一種高產(chǎn)紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌及其應(yīng)用。該蘭黑紫色桿菌被命名為ZSJ，已于2014年7月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.9465，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)即可產(chǎn)生紫色桿菌素。發(fā)酵培養(yǎng)基的溶質(zhì)及濃度為：蛋白胨8.0～12.0g/L、牛肉粉2.0～4.0g/L、氯化鈉4.0～6.0g/L、葡萄糖為0.5～1.5g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為4～8；發(fā)酵培養(yǎng)的溫度是7℃～30℃、時間為48h～240h。該菌株分泌生產(chǎn)的紫色桿菌素屬純天然色素，沒有人工色素潛在的危害，有很好的廣譜抗菌性、抗病毒性、抗腫瘤等生物活性，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、工業(yè)等各領(lǐng)域中。
CGMCC No.9465
2014.07.16
【專利說明】一種高產(chǎn)紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌及其 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 色素一般分為人工合成色素和天然色素。人工合成色素是指用化學(xué)合成方法所制 得的有機(jī)色素，主要是從煤焦油中提取或以苯、甲苯、萘、苯胺等芳烴類化合物為原料合成。 因性能優(yōu)異、價格低廉、使用方便而占據(jù)色素市場的絕對優(yōu)勢。但由于其存在安全性問題， 各國使用合成色素的產(chǎn)品品種在逐漸減少。
[0003] 天然色素是利用自然界存在的物質(zhì)或培養(yǎng)方法生產(chǎn)得到的次生代謝物質(zhì)進(jìn)行一 定加工而制成，具有無毒副作用、安全可靠、色調(diào)自然和大多具備一定的營養(yǎng)價值等優(yōu)點(diǎn)， 其開發(fā)利用越來越受到各領(lǐng)域人們的廣泛認(rèn)可。目前天然色素主要以紅、黃色調(diào)為主，蘭紫 色素非常稀少，因此加快對蘭紫色素的開發(fā)研究具有重要意義。天然色素的主要來源為：植 物、動物、微生物。利用微生物資源生產(chǎn)天然色素，克服以動植物為原料生產(chǎn)天然色素受季 節(jié)、氣候、產(chǎn)地等諸多因素限制的缺點(diǎn)，并且易于工業(yè)化。因此采用微生物生產(chǎn)天然色素將 逐漸成為天然色素來源的主流。
[0004] 紫色桿菌素（Violacein，略寫為Vio)是細(xì)菌合成的一種次級代謝產(chǎn)物，由兩個色 氨酸分子氧化縮合而成，屬于吲哚衍生物。自19世紀(jì)首次從紫色色桿菌中發(fā)現(xiàn)這一色素以 來，又有不同的產(chǎn)紫色桿菌素的微生物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。人們對紫色桿菌素的生物活性進(jìn)行了 大量的探索，目前很多實(shí)驗(yàn)已證明紫色桿菌素具有很強(qiáng)的生物活性：（1)抗原生動物活性； (2)光譜抗菌性；(3)抗病毒性；(4)抗腫瘤細(xì)胞；（5)其他功能，如能抗可見光輻射。另外 還可代替合成色素作染料，對天然原料和合成原料具有很好的著色效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種高產(chǎn)紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌 (Janthinobacterium Iividum)〇
[0006] 上述所述的蘭黑紫色桿菌被命名為ZSJ，已于2014年7月16日保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 9465。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種蘭黑紫色桿菌在制備紫色桿菌素中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種生產(chǎn)紫色桿菌素的方法。
[0009] 上述所述的方法，包括如下步驟：首先將蘭黑紫色桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；再用有機(jī) 溶劑提取紫色桿菌素。
[0010] 上述方法中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的溶質(zhì)及其濃度為：蛋白胨8. 0?12. Og/L、牛肉 粉2. 0?4. Og/L、氯化鈉4. 0?6. Og/L、葡萄糖為0? 5?I. 5g/L，溶劑為水。
[0011] 上述方法中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基具體為蛋白胨10. 〇g、牛肉粉3. 0g、氯化鈉5. 0g、 葡萄糖I. 0g，使用蒸饋水定容至lOOOmL。
[0012] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為4?8 ;具體為7。
[0013] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)時間為48h?240h ;具體為168h。
[0014] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)溫度為7°C?30°C ;具體為21°C。
[0015] 上述方法中，所述提取紫色桿菌素的有機(jī)溶劑為無水甲醇或無水乙醇或無水異丙 醇或無水四氫呋喃；具體為無水甲醇。
[0016] 本發(fā)明最后一個目的是提供上述任一所述的方法在生產(chǎn)紫色桿菌素中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum),保藏編號為CGMCC No. 9465。該蘭黑紫色桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)即可產(chǎn)生紫色桿菌素。該菌株分泌的紫色桿菌素屬純 天然色素，沒有人工色素潛在的危害，有很好的廣譜抗菌性、抗病毒性、抗腫瘤等生物活性， 可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、工業(yè)等各領(lǐng)域中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465的分離培養(yǎng)基 上菌落圖。
[0019] 圖2為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465的液體培養(yǎng)基 靜置培養(yǎng)圖。
[0020] 圖3為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465的液體培養(yǎng)基 搖床培養(yǎng)圖。
[0021] 圖4為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465在光學(xué)顯微鏡 下照片。
[0022] 圖5為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465產(chǎn)生的色素酸 堿穩(wěn)定性結(jié)果。圖5A為紫色桿菌素在不同PH的甲醇溶液中的顏色變化；圖5B為紫色桿菌 素在不同PH的甲醇溶液中置于自然光下照射36h后的顏色變化。
[0023] 圖6為紫色桿菌素在不同溶劑中的溶解程度及顏色。
[0024] 圖7為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465產(chǎn)生的色素的 主要成分HPLC分離圖譜。I為紫色桿菌素；II為脫氧紫色桿菌素。
[0025] 圖8為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465色素主要成分 (I )的核磁氫譜譜圖。
[0026] 圖9為紫色桿菌素粗產(chǎn)品圖。
[0027] 圖10為紫色桿菌素的分子結(jié)構(gòu)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0029] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030] 實(shí)施例1、菌株的分離與鑒定
[0031] 一、分離
[0032] 1、樣品采集
[0033] 從北京市昌平區(qū)小湯山火雞老店采集關(guān)中羊奶，迅速冷藏，送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0034] 2、菌株的分離和篩選
[0035] 配制分離培養(yǎng)基：胰蛋白胨5. 0g、酵母浸膏2. 5g、葡萄糖I. 0g、脫脂奶粉I. 0g，使 用蒸餾水定容至1000ml，加入18. Og瓊脂，80°C水浴溶解。準(zhǔn)備干凈平皿若干，用廢舊報(bào)紙 包好。將培養(yǎng)基及平皿121°C滅菌15min。滅菌后，將培養(yǎng)基及平皿保溫至50?60°C。
[0036] 將樣品用生理鹽水進(jìn)行10倍梯度的稀釋，取10-2、10-3、10-4梯度的樣品液I. Oml 分別加入滅菌后的平皿中，再倒入20?25ml保溫著的培養(yǎng)基，混勻、待凝。倒置平板于TC 培養(yǎng)箱，培養(yǎng)10天。
[0037] 培養(yǎng)后觀察發(fā)現(xiàn)有蘭紫色單菌落，挑取該菌落，進(jìn)行劃線分離。重復(fù)劃線分離，直 至為單一純菌株（如圖1所示）。將上述獲得的菌株命名為ZSJ。
[0038] 二、鑒定
[0039] 1、形態(tài)鑒定
[0040] 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨5. 0g、酵母浸膏2. 5g、葡萄糖I. 0g、脫脂奶粉I. 0g，使用蒸 饋水定容至1000ml，121°C滅菌15min。
[0041] 將菌株ZSJ接種于液體培養(yǎng)基，菌株于液體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)（圖2)，搖床培養(yǎng)如圖 3所示。培養(yǎng)48h后，挑取單菌落，做革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，在光學(xué)顯微鏡下觀察見圖4。
[0042] 結(jié)果表明：在分離培養(yǎng)基的平皿上，菌落呈深藍(lán)紫色，圓形，表面光滑，邊緣整齊； 顯微鏡觀察該菌株呈短桿狀，無芽孢、莢膜，無鞭毛，不運(yùn)動，無孢子，革蘭氏陽性。
[0043] 2、分子鑒定
[0044] 采用北京天根生化科技有限公司的TIANnamp Bacteria細(xì)菌基因組DNA提 取試劑盒提取本發(fā)明篩選的ZSJ菌株的基因組DNA。以獲得的ZSJ菌株基因組DNA 為模板，采用下述引物PCR擴(kuò)增菌株ZSJ的16s rDNA序列。引物序列如下：27f: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ;1492r :5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。
[0045] PCR反應(yīng)條件：

【權(quán)利要求】
1. 一種高產(chǎn)紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium lividum)，該菌株被命 名為ZSJ，已于2014年7月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為 CGMCC No. 9465。
2. 權(quán)利要求1所述蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium lividum)在制備紫色桿菌素中 的應(yīng)用。
3. -種生產(chǎn)紫色桿菌素的方法，包括如下步驟：首先對權(quán)利要求1中所述蘭黑紫色桿 菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；再用有機(jī)溶劑提取紫色桿菌素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)基中溶質(zhì)及其濃度為：蛋白 胨8. 0?12. Og/L、牛肉粉2. 0?4. Og/L、氯化鈉4. 0?6. Og/L、葡萄糖為0. 5?1. 5g/L， 溶劑為水；具體為蛋白胨10. 〇g、牛肉粉3. 0g、氯化鈉5. 0g、葡萄糖1. 0g，使用蒸饋水定容至 lOOOmL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為4?8 ;具體 為7。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)時間為48h?240h ; 具體為168h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)溫度為7°C?30°C ; 具體為21°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3-7任一所述的方法，其特征在于：所述提取紫色桿菌素的有機(jī)溶劑 為無水甲醇或無水乙醇或無水異丙醇或無水四氫呋喃；具體為無水甲醇。
9. 權(quán)利要求3-8任一所述的方法在生產(chǎn)紫色桿菌素中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK104293703SQ201410487660
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】呂加平, 張書文, 劉鷺, 薛海曉, 逄曉陽, 蘆晶 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所