一種大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，屬于微藻培養(yǎng)生產【技術領域】。該方法首先在實驗室內進行微藻保種擴種培養(yǎng)，然后在室外光生物反應器內大規(guī)模培養(yǎng)微藻種質藻液；進而利用光生物反應器培養(yǎng)的微藻種質藻液接種至室外跑道式培養(yǎng)池，在跑道式培養(yǎng)池內進行大規(guī)模的微藻培養(yǎng)；最后從跑道式培養(yǎng)池收獲微藻生物質，生產基于微藻生物質的產品。本發(fā)明將室外光生物反應器和跑道式培養(yǎng)池結合，該方法能夠大規(guī)模培養(yǎng)微藻，相比單純的跑道式反應池和單純的光生反應器培養(yǎng)微藻，本發(fā)明顯著降低了生產成本，并開發(fā)了一整套完整的工藝路線。
【專利說明】一種大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微藻培養(yǎng)生產【技術領域】，具體涉及一種可用于生產生物能源、生物材料、食品、飼料、保健品和藥品的大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法。

【背景技術】
[0002]微藻作為寶貴的生物資源，至今還沒有得到充分利用的一個重要原因就是沒有經(jīng)濟的生產系統(tǒng)。目前，用于微藻培養(yǎng)的方法有跑道式培養(yǎng)法、光生物反應器培養(yǎng)法等，然而，跑道式培養(yǎng)法所需的跑道式培養(yǎng)池僅能培養(yǎng)少數(shù)幾個在選擇性培養(yǎng)基中生長的藻種，例如螺旋藻和鹽藻等微藻品種；而光生物反應器培養(yǎng)法中用到的封閉的光生物反應器系統(tǒng)能培養(yǎng)大多微藻品種，但是建造成本和運行成本很高。這種情況很大程度上限制了微藻產業(yè)的發(fā)展。
[0003]跑道式養(yǎng)殖池最初設計于上世紀六十年代，目前技術比較成熟，被廣泛地用于螺旋藻、小球藻、杜氏鹽藻和雨生紅球藻的養(yǎng)殖，然而，由于跑道式培養(yǎng)池是一個開放的培養(yǎng)設施，其中培養(yǎng)的微藻很容易受到外來物種的污染；同時，培養(yǎng)池的溫度等培養(yǎng)條件很難控制，不能為微藻提供理想的培養(yǎng)條件。光生物反應器可以提供封閉的培養(yǎng)環(huán)境和可以調控的培養(yǎng)條件，理論上可以比較好地培養(yǎng)絕大多數(shù)的微藻品種，是多年來業(yè)界研發(fā)的重點，但是目前光生物反應器還存在建造和使用成本高的問題，僅適用于高附加值微藻產品的生產，在微藻產業(yè)中的應用有一定的局限性。
[0004]跑道式培養(yǎng)池之所以能夠在微藻產業(yè)中得到廣泛的應用原因在于所培養(yǎng)的微藻品種自身能夠克服污染問題。螺旋藻能夠在高度堿性的培養(yǎng)基中生長，而其它生物物種無法適應堿性環(huán)境。小球藻生長速度快，能夠對其它物種形成競爭性抑制。杜氏鹽藻能在高鹽含量的培養(yǎng)基中生長，其它物種無法在這種培養(yǎng)基中生存。雨生紅球藻只是在積累蝦青素階段在培養(yǎng)池內培養(yǎng)，因為時間比較短，僅有幾天時間，污染問題可以忽略。然而對于大多數(shù)種類的微藻來說，跑道式培養(yǎng)池無法連續(xù)進行純種培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，藻液會受到外來原生物和其它藻類的污染，既無法保證產量和質量，也無法持續(xù)維持原來的微藻品種。
[0005]光生物反應器的設計和建造是微藻生物【技術領域】的難點之一。雖然經(jīng)過多年研究發(fā)展，各種類型的反應器被設計和建造，甚至被用于商業(yè)化生產微藻產品，但是一直沒有大規(guī)模的成熟穩(wěn)定的造價低廉的光生物反應器設施出售。沒有合適的光生物反應器系統(tǒng)已經(jīng)成了微藻產業(yè)發(fā)展的瓶頸。光生物反應器可以提供封閉的培養(yǎng)環(huán)境和可以調控的培養(yǎng)條件，理論上可以比較好地培養(yǎng)絕大多數(shù)的微藻品種，是多年來業(yè)界研發(fā)的重點，但是目前光生物反應器還存在建造和使用成本高的問題，僅適用于高附加值微藻產品的生產，在微藻產業(yè)中的應用有一定的局限性，對于大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法還沒有形成一整套成熟的工藝路線。


【發(fā)明內容】

[0006]為此,本發(fā)明提出了一種大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，該方法米用光生物反應器和跑道式培養(yǎng)池聯(lián)合進行微藻培養(yǎng)的技術，能有效降低微藻大規(guī)模的培養(yǎng)成本，并形成了一整套完整的大規(guī)模培養(yǎng)微藻的工藝路線。
[0007]其技術解決方案包括:
[0008]一種大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，包括以下步驟:
[0009]a微藻的實驗室保種擴種培養(yǎng)，首先選取適宜微藻生長需要的液體培養(yǎng)基，向其中加入凝膠，制作成固體培養(yǎng)基；其次，選取經(jīng)過純化無菌的微藻藻種，將其接種到所述固體培養(yǎng)基中，封口培養(yǎng)；最后依次進行微藻藻種的初始擴大培養(yǎng)、中繼培養(yǎng)，在中繼培養(yǎng)之后對微藻藻種進行質量控制，篩選出優(yōu)質微藻藻種；
[0010]b將步驟a所得優(yōu)質微藻藻種放入室外光生物反應器內進行大規(guī)模培養(yǎng)，得微藻種植液；
[0011]c將步驟b所得微藻種植液接種到室外跑道式培養(yǎng)池，在跑道式培養(yǎng)池內進行大規(guī)模微藻培養(yǎng)，直至藻液變?yōu)樯罴t色時，收集整池藻液；
[0012]d接C，對整池藻液進行下游處理，進行分離，采收藻細胞并提取蝦青素。
[0013]作為本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，所述步驟c中，微藻種植液在跑道式培養(yǎng)池內為批培養(yǎng)方式或半連續(xù)培養(yǎng)方式。
[0014]作為本發(fā)明的另一個優(yōu)選方案，步驟a中，優(yōu)質微藻藻種的篩選通過外觀和顯微鏡觀察鑒定。
[0015]步驟b中，將優(yōu)質微藻藻種放入室外氣升管道式光生物反應器內進行大規(guī)模培養(yǎng)，控制溫度為12-280C，pH 7.0-8.0，通氣量在100L/min,培養(yǎng)5-7天。
[0016]步驟c中，跑道式培養(yǎng)池內的pH為8.0，培養(yǎng)時間為7-10天。
[0017]步驟d中將整池藻液進行離心分離，棄上清液，收集紅色的紅球藻沉淀；然后將所述紅球藻沉淀稀釋后，依次進行高壓均質、噴霧干燥法后得到干藻粉；最后，將所得干藻粉與等體積的食用油混合，提取蝦青素。
[0018]本發(fā)明提出了一種大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，其首先在實驗室內進行微藻保種擴種培養(yǎng)，然后在室外光生物反應器內大規(guī)模培養(yǎng)微藻種質藻液；進而利用光生物反應器培養(yǎng)的微藻種質藻液接種至室外跑道式培養(yǎng)池，在跑道式培養(yǎng)池內進行大規(guī)模的微藻培養(yǎng)；最后從跑道式培養(yǎng)池收獲微藻生物質，生產基于微藻生物質的產品。
[0019]本發(fā)明將室外光生物反應器與跑道式培養(yǎng)池結合進行微藻的大規(guī)模培養(yǎng)，其具有以下優(yōu)點:(I)有效屏蔽外來生物和防止污染，能夠實現(xiàn)單種和純種微藻培養(yǎng)；(2)能夠有效控制和調整溫度、光線、攪拌、PH值、溶氧和培養(yǎng)基等培養(yǎng)條件；(3)微藻培養(yǎng)能夠獲得更高的培養(yǎng)密度，減小微藻采收難度；(4)培養(yǎng)環(huán)境清潔衛(wèi)生，尤其適用于高附加值藥用和食用微藻代謝產物的生產；(5)有較高的比表面積，光能利用效率高，節(jié)約培養(yǎng)占地面積；(6)0)2利用率高，可以實現(xiàn)CO2減排；(6)建設成本低，維護運行成本低，遠遠低于單純是光生物反應器的維護成本，僅是光生物反應器的十分之一、技術成熟穩(wěn)定，工程上易于放大。
[0020]將室外光生物反應器和跑道式培養(yǎng)池結合,該方法能夠大規(guī)模培養(yǎng)微藻，相比單純的跑道式反應池和單純的光生反應器培養(yǎng)微藻，本發(fā)明顯著降低了生產成本，并開發(fā)了一整套完整的工藝路線。

【具體實施方式】
[0021 ] 本發(fā)明所選原料均可通過商業(yè)渠道得到。
[0022]本發(fā)明，一種大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，具體包括以下步驟:
[0023]第一步、微藻的實驗室擴大培養(yǎng)
[0024]1、配制微藻保種固體培養(yǎng)基
[0025]根據(jù)微藻的生長需要，選用適宜的液體培養(yǎng)基，加入瓊脂糖凝膠，高溫滅菌后在無菌工作臺上利用無菌培養(yǎng)皿制作無菌固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基溫度下降至常溫凝固后用封口膜密封后在溫度為4°C保存。
[0026]2、微藻藻種的保存
[0027]將經(jīng)過純化無菌的微藻藻種在無菌操作臺內接種到上述步驟I制作的固體培養(yǎng)基上保種培養(yǎng)，培養(yǎng)可以在裝有照明光源的培養(yǎng)箱內，需要保種培養(yǎng)的時候，將載有微藻藻種的培養(yǎng)皿移到無菌操作臺，用無菌簽轉移微藻到空白的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，然后用封口膜封口后再放到培養(yǎng)箱培養(yǎng)，保種培養(yǎng)的時間間隔可以根據(jù)微藻生長速度來確定。
[0028]3、藻種的初始擴大培養(yǎng)
[0029]配置液體培養(yǎng)基，分別分裝到大、中、小三類三角培養(yǎng)瓶內，分裝的液體體積大約為10-20mL、100-300mL和500-1000mL，用鋁箔和棉塞將三角瓶封口后高溫滅菌待用；初始擴種第一步在無菌操作臺內用無菌棉簽將微藻從固體培養(yǎng)基轉移少許到小三角培養(yǎng)瓶，在有光源的搖床培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；經(jīng)過幾天到幾個星期的培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變深后，再經(jīng)無菌操作轉移到中培養(yǎng)瓶和大培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。
[0030]4、藻種的中繼培養(yǎng)
[0031]配置液體培養(yǎng)基到容量為1L或20L的透明桶內，高溫滅菌待用，將大培養(yǎng)瓶內的藻液經(jīng)無菌操作轉移到滅菌后的培養(yǎng)桶內培養(yǎng)，向桶內通入無菌的混有二氧化碳的空氣，提供適量的光照，控制培養(yǎng)室內的溫度，對于易于沉降的藻類，輔助以搖床設施防止藻類沉降。
[0032]5、藻種擴大過程的質量控制
[0033]在藻種液體擴大培養(yǎng)過程中，要十分注意控制微藻種液的質量。可以通過外觀和顯微鏡觀察鑒定藻種的質量，外觀觀察是看藻液的顏色是否正常、是否存在沉淀和附壁的現(xiàn)象；對大多說經(jīng)濟微藻來說，沉淀和附壁是不正常的，說明藻種生長不良，應該放棄藻種并高溫滅活，顯微觀察是觀察微藻的微觀形態(tài)是否正常，是否有外來的藻類或者微生物污染，一旦發(fā)現(xiàn)藻種污染，應該立即放棄藻液并做高溫滅活處理。
[0034]第二步、微藻的光生物反應器培養(yǎng)
[0035]1、光生物反應器的準備
[0036]光生物反應器在接種之前，進行清洗消毒；反應器的液體接觸部分可以用化學試劑漂白液或高錳酸鉀溶液等進行消毒，反應器的氣體管路用臭氧或二氧化氮等氣體消毒劑消毒，消毒后，通入無菌水清洗；最后接通反應器的監(jiān)測和控制設備，通入過濾除菌的空氣，加入過濾除菌的培養(yǎng)劑，校驗反應器的監(jiān)測控制設備。
[0037]2、小規(guī)模光生物反應器的接種
[0038]將數(shù)桶經(jīng)過質量檢查的藻種無菌導入準備好的光生物反應器內，觀察和記錄反應器的監(jiān)測結果和控制設備的有效性，設置方應器的控制參數(shù)。
[0039]3、光生物反應器的微藻擴大培養(yǎng)
[0040]接種后的小規(guī)模反應器經(jīng)過幾天的培養(yǎng)后，達到適宜的培養(yǎng)濃度，就可以轉移藻液到大規(guī)模反應器培養(yǎng)，藻液轉移前，要先準備好大規(guī)模的反應器，轉移過程采用無菌操作，保證藻液不受到外來的生物污染，轉移后的小規(guī)模反應器清洗備用。
[0041]4、光生物反應器的微藻半連續(xù)培養(yǎng)
[0042]大規(guī)模的反應器經(jīng)過幾天的培養(yǎng)后，達到了微藻生產能力的最高水平，這時候，微藻在光生物反應器中的培養(yǎng)可以采用半連續(xù)的方式。
[0043]第三步、微藻的跑道式培養(yǎng)池培養(yǎng)
[0044]1、跑道式培養(yǎng)池準備
[0045]將跑道式培養(yǎng)池在接種前進行徹底的清洗和消毒，
[0046]首先將培養(yǎng)池用水管沖洗，去除殘留藻液等殘留物，然后通入自來水至滿池，啟動培養(yǎng)池的轉輪，加入一定量的消毒劑如漂白液或高錳酸鉀等消毒；消毒后，用過濾除菌的自來水再次沖洗培養(yǎng)池；最后再次通入過濾除菌的自來水，開動培養(yǎng)池轉輪，加入培養(yǎng)基的無機鹽成分，啟動培養(yǎng)池的監(jiān)測和控制設備。這里需要控制的參數(shù)時培養(yǎng)基的深度、培養(yǎng)池轉輪的轉速pH等。
[0047]2、跑道式培養(yǎng)池接種
[0048]將在大規(guī)模反應器半連續(xù)培養(yǎng)的藻液轉移到培養(yǎng)池,轉移過程中控制微藻液的培養(yǎng)條件，保證轉移過程中微藻的健康，跑道式培養(yǎng)池接種需要控制的參數(shù)之一是培養(yǎng)池的接種濃度，微藻池接種濃度對微藻培養(yǎng)的生產效率有很大的影響。
[0049]3、跑道式培養(yǎng)池微藻培養(yǎng)
[0050]微藻在培養(yǎng)池的培養(yǎng)維持一定的培養(yǎng)條件，可控制的參數(shù)包括轉輪的轉速和pH等，轉輪的轉速影響溶氧的去除和培養(yǎng)液的有效攪拌，微藻在培養(yǎng)池內的培養(yǎng)可以是批式培養(yǎng)或者半連續(xù)培養(yǎng)。
[0051]第四步、微藻的采收和產品加工
[0052]1、微藻的采收和濃縮
[0053]微藻采收和濃縮可以采用多種形式，如自然沉降，離心沉降，絮凝和過濾等，自然沉降可以在培養(yǎng)池內進行，也可以轉移到專門的沉降池進行，初級沉降后，利用離心機等設備對藻漿液繼續(xù)進行濃縮。
[0054]2、微藻的下游處理
[0055]濃縮后的微藻可以干燥成藻粉產品或繼續(xù)提取有價值的生物產品或不經(jīng)過干燥程序，先行從濕藻生物質中提取生物制品。
[0056]下面結合具體實施例做進一步說明:
[0057]實施例1:
[0058]本發(fā)明，一種大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，其具體包括以下步驟:
[0059]步驟1、雨生紅球藻的實驗室擴大培養(yǎng)
[0060]首先本發(fā)明優(yōu)選選用適宜微藻生長的BBM培養(yǎng)基配方配置微藻液體培養(yǎng)基,在液體培養(yǎng)中加入I %的瓊脂糖凝膠制作固體培養(yǎng)基；
[0061]其次,在培養(yǎng)箱內保種培養(yǎng)微藻，培養(yǎng)溫度20°C,光照強度大約30uE/m2/s ；
[0062]然后，從固體培養(yǎng)基轉移微藻到裝有20mL培養(yǎng)基的200ml培養(yǎng)瓶中，在搖船培養(yǎng)箱內培養(yǎng)約14-21天，培養(yǎng)溫度20°C，光照強度大約30uE/m2/s，搖床約40rpm ；
[0063]最后，挑選藻液顏色變綠的培養(yǎng)瓶，外觀觀察藻液沒有沉淀和附壁現(xiàn)象，轉入裝有200mL培養(yǎng)基的IL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，顯微觀察藻液是否健康，是否污染，如果藻液污染，則放棄該瓶的藻種擴大培養(yǎng)，IL培養(yǎng)瓶以同于200mL培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。7_14天后，將變綠的藻種擴大到含有IL培養(yǎng)基的5L的培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)溫度20°C，光照強度大約80uE/m2/s，搖床約30rpm，藻種在5L的培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)大約7天后，轉入容量為20L的透明桶內培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)溫度25°C，光照強度大約100uE/m2/S，通氣率0.2v/v/min，通入的氣體含3% CO2，培養(yǎng)大約7天后，抽樣檢查藻液質量和濃度，健康藻液濃度達到0.3g/L的藻液可以作為藻種接種光生物反應器培養(yǎng)。
[0064]步驟2、雨生紅球藻的光生物反應器培養(yǎng)
[0065]根據(jù)中試需要，本發(fā)明中建造了 1000L和8000L的兩種室外氣升管道式，首先對1000L的光生物反應器按照上述方法進行清洗消毒，液體消毒劑利用50ppm有效氯的漂白液，氣體消毒劑用10mg/L的臭氧氣體，消毒清洗后加入上述BBM無菌培養(yǎng)基900L ；開通反應器控制單元，設置溫度控制在25°C，pH 7.4，通氣量251711^11 ;無菌轉移5桶20L的健康藻液進入光生物反應，保持培養(yǎng)條件不變，在室外培養(yǎng)5-7天，微藻濃度達到0.5g/L以上。
[0066]利用相同方法和試劑清洗和消毒8000L光生物反應器，然后加入7000L無菌培養(yǎng)基。設置控制條件:溫度控制在25°C，pH控制在7.4，通氣量在100L/min，保持培養(yǎng)條件5-7天，微藻濃度達到0.5g/L以上，保持培養(yǎng)條件不變，每天釋放出3000L藻液，然后再注入3000L的無菌培養(yǎng)基。
[0067]步驟3、雨生紅球藻的跑道池培養(yǎng)
[0068]根據(jù)中試需要，我們設計和建造了 10m2跑道式培養(yǎng)池，按照上文所述方法先對培養(yǎng)池進行清洗和消毒，加入自來水40噸，啟動轉輪lOrpm，加入10%有效氯的漂白液10L，4-5小時后，放掉消毒液，用自來水沖洗培養(yǎng)池，加入27噸無菌自來水，加入雨生紅球藻變紅培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分，啟動轉輪lOrpm，設置pH控制在8.0 ;倒入3000L來自光生物反應器的藻液，開始雨生紅球藻的變紅培養(yǎng)，經(jīng)過7-10天的培養(yǎng)，藻液轉成深紅色后收獲整池藻液，藻液收獲后，清洗藻池并開始沖洗消毒工作。
[0069]步驟4、對雨生紅球藻進行下游處理
[0070]為了收獲微藻生物質，可將紅球藻在藻池內自然沉降一晚上，第二天清晨去除藻池上清液后用污泥泵抽取下層的微藻沉淀液約3-5噸，將沉淀液轉移到5噸的化工桶內讓微藻繼續(xù)沉降8小時，去除桶內上清液，用三足式離心機離心沉降下層微藻沉淀，獲得藻泥約80-100公斤，將藻泥利用噴霧干燥機干燥獲得藻粉9-11公斤。
[0071]采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法，在中試水平進行培養(yǎng)雨生紅球藻生產蝦青素的試驗，取得了良好的效果。經(jīng)過綜合，認為新工藝的蝦青素的生產成本可以比單純利用反應器生產的成本降低在90%倍以上，可以比利用傳統(tǒng)跑道池培養(yǎng)或者跑道池和其它類型的光生物反應器培養(yǎng)成本降低60%以上。
【權利要求】
1.一種大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，其特征在于，包括以下步驟: a微藻的實驗室保種擴種培養(yǎng)，首先選取適宜微藻生長需要的液體培養(yǎng)基，向其中加入凝膠，制作成固體培養(yǎng)基；其次，選取經(jīng)過純化無菌的微藻藻種，將其接種到所述固體培養(yǎng)基中，封口培養(yǎng)；最后依次進行微藻藻種的初始擴大培養(yǎng)、中繼培養(yǎng)，在中繼培養(yǎng)之后對微藻藻種進行質量控制，篩選出優(yōu)質微藻藻種； b將步驟a所得優(yōu)質微藻藻種放入室外光生物反應器內進行大規(guī)模培養(yǎng)，得微藻種植液； c將步驟b所得微藻種植液接種到室外跑道式培養(yǎng)池，在跑道式培養(yǎng)池內進行大規(guī)模微藻培養(yǎng)，直至藻液變?yōu)樯罴t色時，收集整池藻液； d接c，對整池藻液進行下游處理，進行分離，采收藻細胞并提取蝦青素。
2.根據(jù)權利要求1所述的大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述步驟c中，微藻種植液在跑道式培養(yǎng)池內為批培養(yǎng)方式或半連續(xù)培養(yǎng)方式。
3.根據(jù)權利要求1所述的大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，其特征在于:步驟a中，優(yōu)質微藻藻種的篩選通過外觀和顯微鏡觀察鑒定。
4.根據(jù)權利要求1所述的大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，其特征在于:步驟b中，將優(yōu)質微藻藻種放入室外氣升管道式光生物反應器內進行大規(guī)模培養(yǎng)，控制溫度為12-28°C，pH7.0-8.0，通氣量在100L/min,培養(yǎng)5-7天。
5.根據(jù)權利要求1所述的大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，其特征在于:步驟c中，跑道式培養(yǎng)池內的pH為8.0，培養(yǎng)時間為7-10天。
6.根據(jù)權利要求1所述的大規(guī)模微藻培養(yǎng)的方法，其特征在于:步驟d中將整池藻液進行離心分離，棄上清液，收集紅色的紅球藻沉淀；然后將所述紅球藻沉淀稀釋后，依次進行高壓均質、噴霧干燥法后得到干藻粉；最后，將所得干藻粉與等體積的食用油混合，提取蝦青素。
【文檔編號】C12P23/00GK104263649SQ201410468458
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權日:2014年9月15日
【發(fā)明者】李健, 郭素霞, 韓睿明, 張兆雷, 斯波柔斯.阿哥圖斯 申請人:李健