以rRNA為標(biāo)的的微生物定量分析方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種能夠以高靈敏度并且更準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測(cè)的微生物定量、檢測(cè)方法。是以在被檢測(cè)體中的目的微生物rRNA量為指標(biāo)的目的微生物的定量方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】以rRNA為標(biāo)的的微生物定量分析方法
[0001] 本申請(qǐng)是2006年1月30日提出的申請(qǐng)?zhí)枮?00680003601. 1的同名專(zhuān)利申請(qǐng)的 分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及一種以rRNA為標(biāo)的進(jìn)行的對(duì)微生物，特別是處于生存狀態(tài)的微生物 進(jìn)行定量、檢測(cè)的方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 以往，微生物的定量方法主要使用在預(yù)先預(yù)測(cè)的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，計(jì) 測(cè)菌數(shù)的方法、在選擇性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，測(cè)定混濁度或吸光度的方法。此外，在 檢測(cè)樣本中的微生物時(shí)需要的微生物鑒定操作中，能夠使用通過(guò)形態(tài)觀察、革蘭氏染色、需 氧性、糖同化特性、在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)等細(xì)菌學(xué)性質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法、通過(guò)DNA-DNA同 源性試驗(yàn)進(jìn)行判斷、通過(guò)微生物表面抗原的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法等。這些方法需要 時(shí)間并要求熟練，從迅速性和簡(jiǎn)便性的觀點(diǎn)出發(fā)尚存在問(wèn)題。
[0004] 近年，以PCR法為首的基因擴(kuò)增方法作為用于檢測(cè)微量核酸的技術(shù)而在廣泛的領(lǐng) 域中使用，該方法不以樣本中的微生物培養(yǎng)為必要條件，此外，能夠?qū)颖局苯幼鳛樵嚇舆M(jìn) 行處理等，具有能夠提供迅速化和簡(jiǎn)便化的優(yōu)點(diǎn)，因此，正在討論將其應(yīng)用于微生物的定 量、檢測(cè)中。
[0005] 作為在微生物分析中應(yīng)用PCR法的例子，已知將總DNA作為標(biāo)的序列，通過(guò)使用通 用引物的PCR法進(jìn)行細(xì)菌定量的方法（專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。此外，也實(shí)現(xiàn)了使用16SrDNA作為標(biāo) 的的方法，例如，已知通過(guò)以16SrDNA為標(biāo)的序列的PCR法進(jìn)行的定量分析方法（專(zhuān)利文 獻(xiàn)2)、通過(guò)以16SrDNA為標(biāo)的序列的PCR法進(jìn)行的腸內(nèi)細(xì)菌分析方法（專(zhuān)利文獻(xiàn)3)、作為 啤酒混濁菌的乳酸桿菌屬菌種的檢測(cè)方法（專(zhuān)利文獻(xiàn)4)等。但是，由于為這些方法得不到 以往使用的培養(yǎng)法那樣的檢測(cè)靈敏度，所以存在不能作為以往方法的替代方法而使用的問(wèn) 題。例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)2中提出的定量性分析方法，為了其實(shí)施，需要相當(dāng)于微生物數(shù)為1〇 5個(gè) /μ 1以上的大量的模板DNA，這樣的方法是不實(shí)用的。此外，靈敏度低可以認(rèn)為是由于作為 PCR反應(yīng)模板的總DNA或16SrDNA在微生物中所占拷貝數(shù)（模板量）少的緣故。此外，已知 DNA在微生物死亡后也殘留存在，這些方法無(wú)非是將死亡后的微生物和生存狀態(tài)的微生物 加在一起進(jìn)行定量、檢測(cè)而已，也存在難以準(zhǔn)確地定量、檢測(cè)生存狀態(tài)的微生物的問(wèn)題（非 專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。
[0006] 此外，作為在微生物分析中應(yīng)用PCR法的例子，也出現(xiàn)了將mRNA作為標(biāo)的序列進(jìn) 行的試驗(yàn)，例如，已知將mRNA作為標(biāo)的序列對(duì)糞便中乳酸菌進(jìn)行的定量分析（非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2)等。此外，也已知以樣本中的癌細(xì)胞特異的mRNA作為標(biāo)的序列對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法 (專(zhuān)利文獻(xiàn)5、6)。但是，即使是這些方法，作為定量法，也不能得到能夠代替以往方法那樣 的檢測(cè)靈敏度。S卩，在非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2中表示的定量分析的檢測(cè)限度僅為ι〇3_5個(gè)以上/§ ·_ 便而已，從檢測(cè)靈敏度的觀點(diǎn)出發(fā)，不能作為以往的培養(yǎng)法的替代來(lái)使用。此外，這些方法 是以各微生物中特有基因的niRNA作為標(biāo)的的方法，從引物設(shè)計(jì)的煩雜程度、特異性低等問(wèn) 題出發(fā)，不適于檢測(cè)含有多種微生物的被檢測(cè)體。
[0007] 因此，期待開(kāi)發(fā)出雖然為使用PCR法等的迅速方法，但是能夠同時(shí)得到和以往的 檢測(cè)方法同樣程度的檢測(cè)靈敏度，而且能夠更準(zhǔn)確地定量、檢測(cè)生存狀態(tài)的微生物的方法。
[0008] 為了改善靈敏度，也可以考慮將標(biāo)的向細(xì)胞內(nèi)更穩(wěn)定的或者更大量存在的物質(zhì)進(jìn) 行設(shè)計(jì)變更。但是，如果考慮到懷疑這種穩(wěn)定的標(biāo)的在死亡后的細(xì)胞中也長(zhǎng)期殘留，則認(rèn)為 對(duì)用于僅以檢測(cè)生存狀態(tài)的微生物為目的是不理想的。因此，不容易同時(shí)達(dá)到充分的髙度 檢測(cè)靈敏度和僅檢測(cè)生存細(xì)胞。
[0009] 另一方面，已知rRNA是占細(xì)胞內(nèi)RNA含有率約85%左右的多拷貝，由于和蛋白質(zhì) 形成復(fù)合體，因此比mRNA的穩(wěn)定性高。此外，也有 rRNA在死后48小時(shí)左右被檢測(cè)出的報(bào) 告（非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)，一般考慮不適于檢測(cè)處于生存狀態(tài)的微生物（非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。
[0010] 專(zhuān)利文獻(xiàn)1 :日本專(zhuān)利特開(kāi)2002-238585號(hào)公報(bào)
[0011] 專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :日本專(zhuān)利特開(kāi)2003-259879號(hào)公報(bào)
[0012] 專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :日本專(zhuān)利特開(kāi)2001-112485號(hào)公報(bào)
[0013] 專(zhuān)利文獻(xiàn)4 :日本專(zhuān)利特開(kāi)平10-210980號(hào)公報(bào)
[0014] 專(zhuān)利文獻(xiàn)5 :日本專(zhuān)利特開(kāi)平10-248600號(hào)公報(bào)
[0015] 專(zhuān)利文獻(xiàn)6 :國(guó)際公開(kāi)第00/17395號(hào)小冊(cè)子
[0016] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1 :J Food Prot，vol· 67, No. 4,823-832_ (2004)
[0017] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 :FEMS Microbiology Letters，vol· 231，125-130 (2004)
[0018] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3 :Appl. Environ. Microbiol·，vol. 64, No. 11,4264-4268(1998)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)可代替以往培養(yǎng)法那樣的檢測(cè)靈敏度，并更 準(zhǔn)確地檢測(cè)處于生存狀態(tài)的微生物的微生物定量分析方法。
[0020] 本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果從穩(wěn)定性出發(fā)，將認(rèn)為不適于檢 測(cè)處于生存狀態(tài)的微生物的rRNA(在細(xì)菌中為55、165、235，在真核生物中為53、183、2 63或 28S)用于標(biāo)的，出人意料，能夠不反映死細(xì)胞而準(zhǔn)確地定量、檢測(cè)處于生存狀態(tài)的微生物數(shù) 量，并且發(fā)現(xiàn)，如果在定量、檢測(cè)時(shí)使用PCR法，則能夠?qū)崿F(xiàn)可代替以往方法那樣的檢測(cè)靈 敏度，從而完成本發(fā)明。
[0021] SP，本發(fā)明提供一種以被檢測(cè)體中的目的微生物rRNA量為指標(biāo)的目的微生物定 量方法。
[0022] 此外，本發(fā)明提供一種以被檢測(cè)體中的目的微生物rRNA的存在為指標(biāo)的目的微 生物檢測(cè)方法。
[0023] 此外，本發(fā)明提供一種能夠在上述方法中使用的核酸片段，是由序列號(hào)2、3或5? 28記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或者是由與上述堿基序列同源 的堿基序列構(gòu)成且功能上等價(jià)的核酸片段。
[0024] 此外，本發(fā)明還提供一種用于實(shí)施上述方法的試劑盒。
[0025] 發(fā)明的效果
[0026] 如果使用本發(fā)明的以rRNA為標(biāo)的的檢測(cè)方法，由于標(biāo)的大量存在，因此盡管相比 于以往的標(biāo)的能夠達(dá)到高靈敏度，但同時(shí)也能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)、定量處于生存狀態(tài)的微生 物。此外，如果在該檢測(cè)中使用PCR法，則能夠?qū)崿F(xiàn)可成為以往培養(yǎng)法的代替那種程度的檢 測(cè)靈敏度。而且，如果是使用 PCR的方法，則相比于培養(yǎng)法等的以往方法，能夠?qū)崿F(xiàn)格外的 迅速和簡(jiǎn)便。即，如果使用本發(fā)明的方法，則能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)高檢測(cè)靈敏度、更準(zhǔn)確的定量、檢 測(cè)處于生存狀態(tài)的微生物、和迅速簡(jiǎn)便。因此，能夠在腸道菌群的分析和在來(lái)自食品、生物 體的試樣中生存的微生物的檢測(cè)、定量等要求檢測(cè)、定量微生物的實(shí)際應(yīng)用情況中使用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1是表示各種微生物的增殖和rRNA轉(zhuǎn)錄量的關(guān)系的圖。
[0028] 圖2是表示由定量RT-PCR法產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量PCR法的檢測(cè)范圍的比較的 圖。
[0029] 圖3是表示來(lái)自人糞便的綠膿桿菌的檢測(cè)范圍的圖。
[0030] 圖4是針對(duì)人糞便大腸菌群的定量值，比較由定量RT-PCR求出時(shí)和由培養(yǎng)法求出 時(shí)的圖。
[0031] 圖5甚耒沄來(lái)白牛奶的大腸桿菌、金昔色葡萄球菌和蠟樣芽朐桿菌的拾測(cè)靈敏度 的圖。
[0032] 圖6縣表示夾自血液的綠膿桿菌、金昔色葡萄球菌的檢測(cè)靈敏度的圖。
[0033] 圖7是表示夾自發(fā)酵乳制品的大腸桿菌的檢測(cè)靈敏度的圖。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明的目的微生物的定量、檢測(cè)方法，其特征在于以在被檢測(cè)體中的目的微生 物rRNA的存在量和存在為指標(biāo)。
[0035] 所謂目的微生物rRNA，指的是以定量、檢測(cè)為目的的微生物能夠具有的rRNA， 作為rRNA，例如，可以列舉在原核生物中的5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，在真核生物中的 5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、26SrRNA、28SrRNA，從作為現(xiàn)在的微生物分類(lèi)可靠的指標(biāo)而主 要被使用的方面出發(fā)，特別優(yōu)選16SrRNA、23SrRNA、18SrRNA和26SrRNA。此外，所謂目的 微生物，指的是作為定暈、檢測(cè)目的的微生物，沒(méi)有特別的限定，例如，可以列舉腸桿菌科、 腸球菌屬、乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、韋榮氐球菌屬、假單朐菌屬、檢菌屬、擬桿菌 屬、雙歧桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、普雷沃菌屬、瘤胃球苗雇、梭形桿菌屬、丙酸桿菌屬、消化鏈球茴 屬、弧菌屬、芽朐桿苗屬、彎曲桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、乳球菌屬、片球菌屬、魏斯菌屬、明串珠 直凰、酒球菌屬、螺桿菌屬、奈瑟球菌屬、李斯特苗雇、豬嗜血桿菌屬、分枋桿菌屬、加德納菌 屬、軍團(tuán)菌屬、氣單朐菌屬、草柃菌屬、念珠菌雇等微牛物和后沭表2、表3記載的微生物。此 夕卜，本發(fā)明的目的微生物的概念不僅包含由1種菌種構(gòu)成的微生物，而且還包含由共有某 種性質(zhì)的2種以上菌種的集合構(gòu)成的群、屬和科。
[0036] 所謂被檢測(cè)體，指的是微生物的存在或存在量等的調(diào)查對(duì)象。作為被檢測(cè)體，例 如，可以列舉結(jié)膜拭子、牙石、牙斑、咳出的痰、咽拭子、唾液、鼻涕、支氣管肺泡灌洗液、胸 水、胃液、洗胃液、尿、子宮頸管粘液、陰道分泌物、皮膚損傷、糞便、血液、腹水、組織、腦脊髓 液、關(guān)節(jié)液、患處沖洗液等來(lái)自生物的試樣、食品、藥品、化妝品、食品?藥品?化妝品的中間 處理物、微生物培養(yǎng)液、植物、土壤、活性污泥、排水等可能含有微生物的對(duì)象。此外，所謂被 檢測(cè)體試樣，指的是以被檢測(cè)體為基礎(chǔ)攝取或制作的試樣，只要是能夠反映被檢測(cè)體微生 物存在或存在量的試樣，則沒(méi)有特別的限定，例如，可以列舉含有被檢測(cè)體中所含的核苷酸 的混合物和含有RNA的混合物，但從在PCR法中使用的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選含有被檢測(cè)體中所含 RNA的混合物。
[0037] 被檢測(cè)體試樣，例如，能夠從全部或一部分被檢測(cè)體，根據(jù)需要，在通過(guò)提取、分 離、精制方法進(jìn)行前處理后，通過(guò)適當(dāng)?shù)墓椒ㄈ〉?。例如，含有RNA的混合物，根據(jù)需 要，在通過(guò)過(guò)濾、離心分離、色譜法等公知的方法進(jìn)行前處理后，例如，能夠通過(guò)使用"異硫 氰酸胍-氯化銫超速離心法"、"酸性異硫氰酸胍-苯酚氯仿法（AGPC法）"、"磁珠法"、"二 氧化硅柱法"等通用方法的提取而得到，此外，也能夠使用市售的試劑盒（QIAGEN RNeasy KIt、TRIZ0L 等）進(jìn)行。
[0038] 此外，作為被檢測(cè)體試樣，從防止分解、維持高檢測(cè)靈敏度的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用 在微生物中處于固定狀態(tài)的RNA。這樣的固定，例如，能夠通過(guò)市售的固定劑（RNAprotect Bacterial Regent、RNAlater等）進(jìn)行。此外，從避免微生物內(nèi)的RNA量變化的觀點(diǎn)出發(fā)， 固定優(yōu)選在采取樣本后立即進(jìn)行。
[0039] 本發(fā)明中的目的微生物的定量以在被檢測(cè)體中的目的微生物rRNA量為指標(biāo)。這 里，被檢測(cè)體中的目的微生物rRNA量，例如，能夠通過(guò)（1)使用能夠與目的微生物rRNA特 異雜交的核酸片段和被檢測(cè)體試樣，通過(guò)PCR法求出擴(kuò)增產(chǎn)物量；(2)求出能夠與目的微生 物rRNA特異雜交的核酸片段和被檢測(cè)體試樣的雜交效率；或（3)以使用其它公知方法的定 量方法求出。
[0040] 這里，⑴在使用PCR法時(shí)，"能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段"的設(shè) 計(jì)能夠通過(guò)比較目的微生物具有的堿基序列和其它微生物具有的堿基序列，在目的微生物 能夠具有的rRNA中選擇特異的序列而進(jìn)行。這里，微生物能夠具有的rRNA的堿基序列，例 如，能夠通過(guò)參考數(shù)據(jù)庫(kù)（DDBJ、Genbank等）而得到。此外，能夠使用軟件（Clustal X等） 對(duì)堿基序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)目測(cè)等手段發(fā)現(xiàn)特異的序列。此外，目的微生物中特異性序列， 優(yōu)選參考作為定量對(duì)象的微生物所包含范圍的廣度。即，例如，如果以特異性定量某菌種為 目的，則優(yōu)選選擇該菌種的特異序列，此外，如果以特異性定量某屬為目的，則優(yōu)選選擇該 屬的特異序列。這樣的選擇能夠使用公知的方法適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行。
[0041] 作為能夠與目的微生物rRNA雜交的核酸片段，不僅能夠使用這樣設(shè)計(jì)的序列，而 且也能夠按照公知的技術(shù)常識(shí)適當(dāng)估計(jì)，使用與該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列和能夠在目的 微生物的定量中同樣使用的同源的堿基序列，例如，由a)該堿基序列中的1個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選 1至10個(gè)堿基取代、添加或缺失的堿基序列；b)與該堿基序列具有90%以上、優(yōu)選95%以 上、更優(yōu)選99%以上同一性的堿基序列； c)在嚴(yán)格條件下與和該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列 構(gòu)成的DNA雜交的堿基序列構(gòu)成的核酸片段等。
[0042] 此外，這樣的核酸片段，也可以是在其兩端或一端，優(yōu)選在5'端添加任意數(shù)，優(yōu)選 100個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選1〇個(gè)以下堿基的核酸片段的一部分。
[0043] 該核酸片段的長(zhǎng)度沒(méi)有特別的限制，優(yōu)選由5?50個(gè)堿基構(gòu)成的核酸片段，更優(yōu) 選由12?35個(gè)堿基構(gòu)成的核酸片段。
[0044] 這樣設(shè)計(jì)的核酸片段，例如，能夠按照其堿基序列以DNA合成機(jī)進(jìn)行人工合成。作 為該片段，優(yōu)選在合成后確認(rèn)其特異性的片段，這里，作為特異性的確認(rèn)，例如，當(dāng)以目的 rRNA為模板時(shí)，通過(guò)和適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比，確認(rèn)得到特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物而進(jìn)行。
[0045] 作為這樣的核酸片段，例如，可以列舉序列號(hào)1?30記載的堿基序列或與其互補(bǔ) 的堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的 核酸片段。這里，作為由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核酸片段， 例如，可以列舉在以下表示的（a)?（c)中表示的，在目的微生物rRNA的定量、檢測(cè)中能夠 使用的核酸片段。
[0046] (a)在由以序列號(hào)1?30表示的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段 中，1個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代或添加的核酸片段。
[0047] (b)由與以序列號(hào)1?30表示的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列具有90%以上， 優(yōu)選以上，更優(yōu)選的％以上同一性的堿基序列構(gòu)成的核酸片段。
[0048] (c)由在嚴(yán)格的條件下與以序列號(hào)1?30表示的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列 構(gòu)成的DNA雜交的堿基序列構(gòu)成的核酸片段。
[0049] 此外，在這里，堿基序列的同一性，可以通過(guò)使用GENETYX(R)的同源性分析程序 算出。
[0050] 此外，作為"嚴(yán)格的條件"，例如，可以列舉在含有50 %甲酰胺、5XSSC、 5XDenhardt，s溶液和25〇mg/mL鮭魚(yú)精子DNA的溶液中，以42°C恒溫16?24小時(shí)使其 雜交的條件。
[0051] 能夠在目的微生物rRNA的定量、檢測(cè)中使用的核酸片段，例如，能夠通過(guò)進(jìn)行PCR 法，選擇以目的微生物rRNA作為模板時(shí)能夠得到擴(kuò)增產(chǎn)物，而以其它標(biāo)的，例如其它微生 物rRNA或mRNA作為模板時(shí)不能得到擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸片段而得到。
[0052] 這樣，⑴由序列號(hào)1或2記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片 段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核酸片段，能夠在特異地 定量、檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌的用途中使用,⑵由序列號(hào)3或4記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的 堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核 酸片段，能夠在特異地定量、檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的用途中使用，(3)由序列號(hào)5或6記載的堿 基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成 且在功能上等價(jià)的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測(cè)腸趕菌赴的用途中使用，（4)由序列 號(hào)7或8記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或由與上述堿基序列同 源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測(cè)盤(pán)直逑直凰的用 途中使用，（5)由序列號(hào)9或10記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或 由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核酸片段，能夠在特異地定量、 檢測(cè)假單胞菌屬的用途中使用，( 6)由序列號(hào)11或12記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基 序列構(gòu)成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核酸片 段，能夠在特異地定暈、檢測(cè)腸球菌屬的用途中使用，(7)由序列號(hào)13或14記載的堿基序列 或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功 能上等價(jià)的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測(cè)嗜酸乳桿菌亞群的用徐中俅用，(8)由序列 號(hào)15或16記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或由與上述堿基序列 同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核酸片段，能夠在特異地宙量、檢測(cè)瘤胃乳桿菌亞 群的用途中使用，（9)由序列號(hào)17或18記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核 酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核酸片段，能夠在特 異地定量、檢測(cè)植物乳桿菌亞群的用途中使用，(10)由序列號(hào)19或20記載的堿基序列或 與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能 上等價(jià)的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測(cè)豐盤(pán)乳趕藍(lán)亞群的用途中可以使用，（11)由序 列號(hào) 21或22記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或由與上述堿基序 列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測(cè)清酒乳桿菌 亞群的用途中使用，（12)由序列號(hào)23或24記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的 核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核酸片段，能夠在 特異地定暈、檢測(cè)干酪乳桿菌亞群的用途中可以使用,(13)由序列號(hào)25或26記載的堿基 序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且 在功能上等價(jià)的核酸片段，能夠在特異地定量、檢測(cè)短IL枉直亞群的用途中可以使用，（14) 由序列號(hào)27或28記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段，或由與上述堿 基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核酸片段，能夠在特異地定暈、檢測(cè)食果糖 乳桿菌的用途中使用，(15)由序列號(hào)29或30記載的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成 的核酸片段，或由與上述堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成且在功能上等價(jià)的核酸片段，能夠 在特異地定暈、檢測(cè)發(fā)酵乳酸桿菌的用途中使用。
[0053] 此外，在這里，由序列號(hào)1記載的堿基序列構(gòu)成的核酸片段是在FEMS Microbiology Letters，vol. 202,209-213(2001)中記載的公知的核酸片段。此外，由 序列號(hào)4記載的堿基序列構(gòu)成的核酸片段是在Microbiol. Immunol.，vol. 46, No. 5， 353-358 (2002)中記載的公知的核酸片段。此外，由序列號(hào)29或30記載的堿基序列構(gòu)成的 核酸片段是在日本專(zhuān)利特開(kāi)平11-151097號(hào)公報(bào)中記載的公知的核酸片段。另一方面，由 序列號(hào)2、3或5?28記載的堿基序列構(gòu)成的核酸片段是本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的核酸片段。
[0054] 使用這樣制作的核酸片段和被檢測(cè)體試樣的PCR法，能夠通過(guò)"以該核酸片段作 為引物使用，在含有被檢測(cè)體試樣的反應(yīng)體系中，以目的微生物rRNA為模板的PCR反應(yīng)"而 進(jìn)行。作為這樣的PCR法，只要為特異性擴(kuò)增來(lái)自目的微生物rRNA的核苷酸片段的反應(yīng)， 則沒(méi)有特別的限制，但優(yōu)選包含將目的微生物rRNA作為模板，通過(guò)酶，優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄酶等制 作cDNA的工序的方法，此外，更優(yōu)選在該工序以外，包含以這樣制作的cDNA作為模板擴(kuò)增 核苷酸的工序的方法。這樣的PCR法，例如，能夠通過(guò)使用公知的RT-PCR反應(yīng)而進(jìn)行。這 里，RT-PCR反應(yīng)能夠使用Two-Step RT-PCR或One-Step RT-PCR等公知的方法進(jìn)行，但是 從簡(jiǎn)便、并且從防止交叉污染的觀點(diǎn)出發(fā)，特別優(yōu)選One-Step RT-PCR。
[0055] 這樣的One-Step RT-PCR法，例如，可以使用市售的試劑盒（QIAGEN One-Step RT-PCR kit等）進(jìn)行。作為在RT反應(yīng)中使用的具有逆轉(zhuǎn)錄活性的酶，能夠使用M-MHV reverse transcriptase等各種逆轉(zhuǎn)錄酶。此外，在使DNA擴(kuò)增的PCR反應(yīng)中使用的DNA聚 合酶優(yōu)選為具有90°C以上耐熱性的酶。
[0056] 這樣的PCR反應(yīng)，例如，能夠通過(guò)下述方法進(jìn)行：以在90?98°C將雙鏈DNA變?yōu)閱?鏈的熱變性反應(yīng)、在 37?72°C使引物與模板cDNA雜交的退火反應(yīng)、在5〇?75°C使DNA聚 合酶發(fā)揮作用的延伸反應(yīng)的溫度條件下，將此作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行1?數(shù)十個(gè)循環(huán)。此外， 優(yōu)選的反應(yīng)條件的一個(gè)例子為，熱變性95°C 30秒，退火60°C 30秒、延伸反應(yīng)72°C 60秒。
[0057] 此外，在PCR反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選將2種引物作為1組使用，此時(shí)，兩者必須使引導(dǎo)鏈和后 隨鏈進(jìn)行組合。由于本發(fā)明提供的核酸片段將在RT-PCR反應(yīng)中的退火溫度設(shè)定為幾乎固 定的溫度，因此能夠同時(shí)測(cè)定多個(gè)微生物的核酸片段。此外，既能夠作為探針使用，也能夠 和其它公知的通用引物、寡聚核苷酸等組合使用。
[0058] 此外，作為含有作為該RT-PCR反應(yīng)模板的rRNA的被檢測(cè)體試樣，優(yōu)選含有RNA總 量為lpg?1 μ g的RNA的物質(zhì)，更優(yōu)選含有10pg?〇. 1 μ g的物質(zhì)。
[0059] 在進(jìn)行適當(dāng)?shù)腜CR反應(yīng)時(shí)，通常，在"PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量"、"PCR循環(huán)數(shù)"和"PCR的模 板量"之間有相關(guān)關(guān)系。因此，如果參考通過(guò)這樣進(jìn)行的PCR反應(yīng)而擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物量和 PCR循環(huán)數(shù)而適當(dāng)計(jì)算，就能夠求出目的微生物rRNA量。
[0060] 此外，正如后述的實(shí)施例圖1所示，可知在求出的"目的微生物rRNA量"和"目的 微生物的菌數(shù)"之間也存在良好的相關(guān)關(guān)系。因此，如果參考這樣求出的"目的微生物rRNA 量"而計(jì)算，就能夠求出目的微生物的菌數(shù)。此外，即使不經(jīng)過(guò)計(jì)算"目的微生物rRNA量" 的過(guò)程，通過(guò)參考如上述操作進(jìn)行的"通過(guò)PCR反應(yīng)而擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物量"和"PCR循環(huán)數(shù)" 而適當(dāng)計(jì)算，也能夠求出目的微生物的菌數(shù)。
[0061] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量和PCR循環(huán)數(shù)的得知沒(méi)有特別的限定，能夠通過(guò)所有的方法進(jìn)行， 例如，能夠通過(guò)確定在到達(dá)任意設(shè)定的一定量的DNA量時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)而進(jìn)行。這樣的確 定，例如，能夠通過(guò)使用"并用標(biāo)記PCR產(chǎn)物的PCR法，經(jīng)時(shí)地計(jì)測(cè)標(biāo)記而進(jìn)行的PCR法"，確 定在到達(dá)設(shè)定的一定熒光強(qiáng)度時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)而進(jìn)行。這里，一定的熒光強(qiáng)度，從能夠反映 適當(dāng)?shù)南嚓P(guān)關(guān)系出發(fā)，優(yōu)選以"擴(kuò)增產(chǎn)物在對(duì)數(shù)擴(kuò)增時(shí)能夠達(dá)到的熒光強(qiáng)度的范圍內(nèi)"而設(shè) 定。這樣的范圍通過(guò)公知的方法能夠適當(dāng)理解。此外，在這里，作為標(biāo)記，例如，可以列舉以 熒光色素產(chǎn)生的標(biāo)記，作為標(biāo)記的計(jì)測(cè)，例如，可以列舉熒光強(qiáng)度的計(jì)測(cè)。此外，在這里，作 為以熒光色素產(chǎn)生的標(biāo)記，例如，可以列舉以嵌入性熒光色素產(chǎn)生的標(biāo)記，作為嵌入性熒光 色素，例如，可以列舉SYBR(R) Green I。嵌入性色素因嵌入在雙鏈核酸中而具有熒光強(qiáng)度增 強(qiáng)的性質(zhì)，因此發(fā)出反映擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的強(qiáng)度的熒光。此外，以熒光色素產(chǎn)生的標(biāo)記，也 能夠通過(guò)使用以熒光色素標(biāo)記的TaqMan探針和分子信標(biāo)（Moleculer Beacon)等而進(jìn)行。 TaqMan探針和分子信標(biāo)是使熒光色素和猝滅劑結(jié)合在與通過(guò)PCR擴(kuò)增的區(qū)域的內(nèi)部序列 具有同源性的寡聚核苷酸中的探針，使其共存在PCR反應(yīng)中而使用。通過(guò)結(jié)合在探針中的 熒光色素和猝滅劑的相互作用，發(fā)出與PCR擴(kuò)增反應(yīng)相應(yīng)的熒光，因此，通過(guò)測(cè)定在各PCR 階段的熒光強(qiáng)度，能夠?qū)Ρ粩U(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行經(jīng)時(shí)地觀察。但是，TaqMan探針和分子信 標(biāo)等，必須找出適應(yīng)于探針的細(xì)菌中特異的互補(bǔ)序列，有時(shí)根據(jù)對(duì)象不同而存在困難。
[0062] 如果參考這樣得知的"PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量和PCR循環(huán)數(shù)"和適當(dāng)?shù)谋容^實(shí)驗(yàn)的結(jié)果， 就能夠求出rRNA量。即，例如，如果參考"使用其量已知的rRNA進(jìn)行的比較實(shí)驗(yàn)的結(jié)果"， 與如上述得知的"PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量和PCR循環(huán)數(shù)"進(jìn)行適當(dāng)?shù)膶?duì)比，通過(guò)公知的方法就能夠 計(jì)算目的微生物rRNA量。
[0063] 這樣，如果參考這樣計(jì)算的"目的微生物rRNA量"和適當(dāng)?shù)谋容^實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，就能 夠求出目的微生物的菌數(shù)。S卩，例如，如果參考"使用對(duì)應(yīng)的其菌數(shù)已知的被檢測(cè)體試樣進(jìn) 行的比較實(shí)驗(yàn)的結(jié)果"，與這樣計(jì)算的"目的微生物rRNA量"進(jìn)行適當(dāng)?shù)膶?duì)比，通過(guò)公知的 方法就能夠計(jì)算目的微生物的菌數(shù)。此外，在這樣的對(duì)比中，從簡(jiǎn)便性出發(fā)，優(yōu)選使用表示 作為PCR模板的"被檢測(cè)體微生物的菌數(shù)"和到達(dá)一定的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量時(shí)的"PCR循環(huán) 數(shù)"（以下有時(shí)也稱(chēng)為&值）的相關(guān)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通常是將作為標(biāo)的 的微生物菌數(shù)標(biāo)繪在橫軸，將CT值標(biāo)繪在縱軸而制成（參照?qǐng)D2)。在標(biāo)準(zhǔn)曲線制成時(shí)使用 的微生物也可以使用模式株等公知的菌株。
[0064] 此外，如果適當(dāng)對(duì)比"使用對(duì)應(yīng)的其菌數(shù)已知的被檢測(cè)體試樣進(jìn)行的比較實(shí)驗(yàn)的 結(jié)果"和如上述操作而得知的"PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量和PCR循環(huán)數(shù)"，不經(jīng)過(guò)具體計(jì)算rRNA量的 過(guò)程，也能夠直接計(jì)算目的微生物的菌數(shù)。具體而言，適用將來(lái)自被檢測(cè)體試樣的C T值導(dǎo) 入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可。
[0065] 此外，如上所述，在被檢測(cè)體中的目的微生物rRNA量，例如，也能夠通過(guò)（2)得知 能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段和被檢測(cè)體試樣的雜交效率而求出。
[0066] 這里，能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段，例如，能夠使用如上述設(shè)計(jì) 和制作的核酸片段。此外，作為這樣的核酸片段，優(yōu)選形成標(biāo)記的核酸片段。這里，作為標(biāo) 記，可以列舉酶、順磁性離子、生物素、熒光色素、發(fā)色團(tuán)、重金屬或放射性同位素，作為更優(yōu) 選的標(biāo)記，可以列舉酶，這里，作為酶，可以列舉辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶。這樣的標(biāo)記 能夠通過(guò)公知的方法進(jìn)行。
[0067] 如果測(cè)定被檢測(cè)體試樣和這樣的核酸片段的雜交程度，通過(guò)公知的換算方法就能 夠得知在被檢測(cè)體中的目的微生物rRNA量和/或目的微生物的菌數(shù)。這樣的雜交程度的 計(jì)測(cè)沒(méi)有特別的限定，能夠以公知的方法為準(zhǔn)進(jìn)行，例如，能夠通過(guò)計(jì)測(cè)添加在核酸片段的 標(biāo)記而進(jìn)行。即，例如，當(dāng)使用以熒光色素標(biāo)記的核酸片段時(shí)，能夠通過(guò)計(jì)測(cè)熒光強(qiáng)度而進(jìn) 行。這樣的計(jì)測(cè)優(yōu)選為和適當(dāng)?shù)膶?duì)照平行進(jìn)行的計(jì)測(cè)。這里，作為適當(dāng)?shù)膶?duì)照，例如，可以列 舉"已知不與使用的核酸片段特異雜交的試樣"、"來(lái)自所含目的微生物菌數(shù)已知的被檢測(cè) 體的被檢測(cè)體試樣"、"從目的微生物rRNA量已知的被檢測(cè)體攝取或制作的被檢測(cè)體試樣" 等。通過(guò)參考這樣的對(duì)照，以公知的換算方法能夠得知目的微生物rRNA量或目的微生物菌 數(shù)。此外，微生物菌數(shù)的得知也能夠參考這樣計(jì)算的目的微生物rRNA量和適當(dāng)?shù)谋容^實(shí)驗(yàn) 結(jié)果，以公知的方法進(jìn)行。
[0068] 此外，本發(fā)明的目的微生物的檢測(cè)方法，是以在被檢測(cè)體試樣中的目的微生物 rRNA的存在為指標(biāo)的方法。這里，所謂"微生物的檢測(cè)"包含微生物鑒定的含義。此外，也 包含確認(rèn)檢測(cè)對(duì)象微生物在樣本中存在，或確認(rèn)檢測(cè)對(duì)象微生物在樣本中不存在的含義。
[0069] 當(dāng)使用本發(fā)明的檢測(cè)方法確認(rèn)目的微生物rRNA在被檢測(cè)體中存在時(shí)，通過(guò)下述 方法進(jìn)行即可：（1)檢測(cè)使用被檢測(cè)體試樣和能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段 的PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)檢測(cè)這樣的核酸片段和被檢測(cè)體試樣的雜交；(3)使用其它公 知的方法檢測(cè)目的微生物rRNA等。該（1)?（3)的方法能夠通過(guò)參考已經(jīng)敘述的方法而 容易地進(jìn)行。這樣，由于目的微生物rRNA的存在表示目的微生物在被檢測(cè)體中存在，因此 能夠檢測(cè)目的微生物。但是，由于非特異的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增和非特異的雜交均能夠發(fā)生，因此 優(yōu)選和適當(dāng)?shù)膶?duì)照比較而進(jìn)行。
[0070] 如后述的實(shí)施例所示，可知以rRNA量為指標(biāo)的定量方法和以rRNA的存在為指標(biāo) 的檢測(cè)方法，相比于以往的以rDNA量為指標(biāo)的方法，能夠達(dá)到很高的檢測(cè)靈敏度。此外，如 在后述的實(shí)施例中所示，可知以rRNA量為指標(biāo)的方法，能夠不將死細(xì)胞同時(shí)定量、檢測(cè)，而 正確地定量、檢測(cè)處于生存狀態(tài)的微生物。
[0071] 因此，如果使用本發(fā)明的定量、檢測(cè)方法（以下也稱(chēng)為"本發(fā)明的方法"），能夠以 比以往方法更高的檢測(cè)靈敏度，并且特異地定量、檢測(cè)處于生存狀態(tài)的微生物。因此，本發(fā) 明的方法，例如，能夠在下述用途等中使用：（1)以比以往方法更高的檢測(cè)靈敏度定量、檢 測(cè)在被檢測(cè)體中含有的處于生存狀態(tài)的目的微生物；（2)以比以往方法更高的檢測(cè)靈敏度 定量、檢測(cè)在被檢測(cè)體中含有的死細(xì)胞數(shù)；(3)以比以往方法更高的檢測(cè)靈敏度計(jì)測(cè)在被 檢測(cè)體中含有的死細(xì)胞數(shù)和處于生存狀態(tài)的微生物數(shù)的比例；(4)以比以往方法更高的檢 測(cè)靈敏度"確認(rèn)"處于生存狀態(tài)的微生物的存在或存在量。這里，作為確認(rèn)，例如，可以列舉 (a)在有必要更嚴(yán)格地正確把握處于生存狀態(tài)的微生物數(shù)時(shí)，為了把握處于生存狀態(tài)的微 生物的存在或存在量而進(jìn)行的定量、檢測(cè)；(b)在"處于生存狀態(tài)的微生物數(shù)"通過(guò)其它實(shí) 驗(yàn)系統(tǒng)被計(jì)算時(shí)，為了研究該實(shí)驗(yàn)的精度和被計(jì)算的數(shù)值的正確度而進(jìn)行的確認(rèn)。此外，當(dāng) 定量死細(xì)胞時(shí)，例如，優(yōu)選通過(guò)已知同時(shí)檢測(cè)死細(xì)胞的公知的方法等，同時(shí)計(jì)測(cè)死細(xì)胞數(shù)和 生存細(xì)胞數(shù)的合計(jì)數(shù)而進(jìn)行。能夠通過(guò)從合計(jì)數(shù)除去以本發(fā)明的方法計(jì)算的生存細(xì)胞數(shù)而 求出。
[0072] 此外，本發(fā)明的方法，例如，也可以作為定量、檢測(cè)不形成菌落的微生物、不能液體 培養(yǎng)的微生物等通過(guò)以往的培養(yǎng)法難以計(jì)測(cè)的微生物的方法而使用。
[0073] 此外，如后述的實(shí)施例所示，可知在這樣的定量、檢測(cè)方法中，當(dāng)使用PCR法時(shí)，能 夠?qū)崿F(xiàn)和培養(yǎng)法同等程度的檢測(cè)靈敏度。因此，本發(fā)明的方法，也能夠以和培養(yǎng)法同等程度 以上的檢測(cè)靈敏度，即，10°個(gè)以上/g ·樣本，或10°個(gè)以上/mL ·樣本的檢測(cè)靈敏度，而作 為定量、檢測(cè)微生物的方法使用。
[0074] 此外，當(dāng)使用PCR法時(shí)，和培養(yǎng)法比較，能夠極其迅速而且簡(jiǎn)便地進(jìn)行微生物的定 量、檢測(cè)。此外，如果通過(guò)使用PCR法的方法，則從樣本的RNA的提取到微生物的定量、檢測(cè)， 能夠在約6小時(shí)以?xún)?nèi)完成。因此，本發(fā)明的方法也能夠作為能夠以短時(shí)間（6小時(shí)以?xún)?nèi)）檢 測(cè)微生物的方法使用。
[0075] 在本發(fā)明的方法中，如果使用采用PCR法的方法，則能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)高檢測(cè)靈敏度、 更準(zhǔn)確地定量、檢測(cè)處于生存狀態(tài)的微生物、和迅速及簡(jiǎn)便。因此，本發(fā)明的方法，例如，能 夠在特別要求迅速且靈敏度高的定量、檢測(cè)的醫(yī)療場(chǎng)所和食品工業(yè)中的"污染菌、有害菌、 病原微生物等的檢查"的用途中使用。
[0076] 本發(fā)明的方法也能夠使用用于實(shí)施該方法的試劑盒而進(jìn)行。這里，作為用于實(shí)施 該方法的試劑盒，例如，可以列舉包含（1)能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段、 (2)記載實(shí)施方法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、和/或⑶在RNA提取、RNA固定或PCR反應(yīng)中使用的試劑 的試劑盒，但本發(fā)明的試劑盒不限定于這些，也指集合了進(jìn)行該方法的全部或一部分工序 所需物質(zhì)的全部或一部分的試劑盒。這里，"進(jìn)行工序所需的物質(zhì)"能夠通過(guò)參考本說(shuō)明書(shū) 的記載而適當(dāng)理解。
[0077] 實(shí)施例
[0078] 以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行更詳細(xì)地說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí) 施例。
[0079] 實(shí)施例1引物的制作
[0080]針對(duì)各種細(xì)菌菌種，從 DNA Data Bank of Japan (http ://www. ddbj· nig. ac. jp/ Welcome-j. html)入手16S和23S rRNA的DNA序列。通過(guò)Clustal W程序?qū)⑦@些序列比對(duì) 后，制成系統(tǒng)樹(shù)。以系統(tǒng)樹(shù)為基礎(chǔ)，將各菌種分類(lèi)為科、屬、亞群，在每個(gè)分類(lèi)中進(jìn)行引物的 設(shè)計(jì)。在表1中表示制成的引物序列和作為對(duì)象的rRNA種類(lèi)。此外，表1的參考文獻(xiàn)欄表 示記載該序列的文獻(xiàn)。此外，該欄為空欄的，表示該序列是由本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的新序列。此外， 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 4 表示 Microbiol. Immunol.，vol. 46, No. 5, 353-358 (2002)，非專(zhuān)利文獻(xiàn) 5 表示 FEMS Microbiology Letters，vol. 202, 209-213 (2001)，專(zhuān)利文獻(xiàn) 7 表示日本專(zhuān)利特開(kāi)平 11-151097 號(hào)公報(bào)。
[0081] [表 1-1]
[0082] -

【權(quán)利要求】
1. 一種處于生存狀態(tài)的目的微生物的定量方法，其特征在于： 以被檢測(cè)體中的目的微生物rRNA量為指標(biāo)，由目的微生物rRNA量與目的微生物的菌 數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系求出目的微生物的菌數(shù)，目的微生物rRNA量通過(guò)測(cè)定使用能夠與目的 微生物rRNA特異雜交的核酸片段和被檢測(cè)體試樣進(jìn)行的PCR反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物而求得， 被檢測(cè)體試樣中的目的微生物rRNA是固定在微生物中的rRNA， 檢測(cè)靈敏度為10°個(gè)以上/g ·樣本或10°個(gè)以上/mL ·樣本， 從樣本的RNA的提取到微生物的定量在6小時(shí)以?xún)?nèi)完成。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于： 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定為確定擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到一定量時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)的測(cè)定。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于： 經(jīng)時(shí)地對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行計(jì)測(cè)。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于： 被檢測(cè)體為糞便、食品或來(lái)自活體的試樣。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于： 能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段，是由序列號(hào)2、3或5?28記載的堿基 序列或與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段。
6. -種用于實(shí)施權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的方法的試劑盒。
7. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，包括： (1)能夠與目的微生物rRNA特異雜交的核酸片段；和/或⑵用于RNA的提取、RNA的 固定和/或PCR反應(yīng)的試劑。
【文檔編號(hào)】C12Q1/14GK104232769SQ201410452701
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2006年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2005年1月31日
【發(fā)明者】辻浩和, 松田一乘, 朝原崇, 野本康二, 木脅真祐美 申請(qǐng)人:株式會(huì)社益力多本社