一種快速鑒定油葵新葵19號品種純度的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速鑒定油葵新葵19號品種純度的試劑盒。通過建立包括油葵SSR技術(shù)最佳程序，PCR擴增反應(yīng)各組分的優(yōu)化組合和擴增試劑盒，以及擴增條帶的顯色程序；以商品油葵品種新葵19號及其雙親的DNA為模板，進行大量SSR引物分子標記的篩選和重復(fù)，獲得了鑒定出能夠同時區(qū)分父本、母本和雜交種的引物標記399和425，這2個引物標記可有效用于鑒定上述新葵19號雜交種種子的純度，辨別種子的真?zhèn)?，利于油葵雜交種種子高效準確的質(zhì)量控制，加快新葵19號商品種子的質(zhì)量檢測進程?？捎行в糜阼b定油葵雜交種種子的純度，辨別種子的真?zhèn)?，將從DNA提取到分子標記純度驗證時間縮短到一工作日內(nèi)，具有重要應(yīng)用價值。
【專利說明】一種快速鑒定油葵新葵19號品種純度的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體說，本發(fā)明具體涉及一種快速鑒定油葵新葵19品種純度的試劑盒的【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]向日葵iBelianthus annuus L.)是世界五大經(jīng)濟作物之一,具有耐鹽堿、耐干旱、耐瘠薄的特性，也是我國北方地區(qū)的主要油料作物，其作為油料或蛋白質(zhì)資源日益受到人們的重視。我國有相當一部分干旱瘠薄低產(chǎn)田及鹽堿地，因而向日葵在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上占有重要地位。世界各國在向日葵雜優(yōu)利用研究方面普遍開展三系研究，我國從20世紀70年代開展向日葵雜優(yōu)利用研究，并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中開始利用雜交種。
[0003]隨著向日葵育種技術(shù)的不斷發(fā)展和雜交品種的大面積推廣，品種鑒定已成為新品種保護及保護農(nóng)民利益的重要手段。傳統(tǒng)的品種鑒定多用形態(tài)學(xué)方法，是根據(jù)作物的形態(tài)特征和農(nóng)藝生理特征鑒定特定的基因型，它是一種最原始的品種純度檢驗方法，簡單、直觀、易觀測記載，長期以來形態(tài)標記是鑒定雜交向日葵品種的主要手段，但隨著育種新技術(shù)的不斷發(fā)展，品種間的形態(tài)學(xué)差異越來越小，能用于鑒定的形態(tài)性狀已顯不足，增加了鑒定的困難；而且此法鑒定時間長，費用高。近年來，蛋白質(zhì)和DNA多態(tài)性檢測技術(shù)迅速發(fā)展，尤其是DNA多態(tài)性檢測技術(shù)以其檢測材料少、時間短、結(jié)果穩(wěn)定性好、重復(fù)性高、技術(shù)簡單、成本低而逐漸成為目前檢測的主流方法。
[0004]DNA分子檢測技術(shù)基于DNA分子的缺失、插入、易位、倒位、重排或由于存在長短與排列不一的重復(fù)序列機制而產(chǎn)生的多態(tài)性(Polymorphism diversity orfingerprints)，h}\本質(zhì)上能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段。雜交向日葵品種純度鑒定應(yīng)用的分子檢測技術(shù)有RFLP技術(shù)、RAPD技術(shù)、SSR技術(shù)、AFLP技術(shù)。RFLP {Restrict1nFragment Length Polymorphism)是由(Jroofeicfcr (1974)最早創(chuàng)立的，該技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶酶解不同生物體的DNA分子后，用特異性探針進行Sothern分子雜交，通過放射自顯影來揭示DNA的多態(tài)性。由于RFLP標記對DNA的需要量較大(5_10ug)，質(zhì)量要求較高，技術(shù)較為復(fù)雜，程序繁多，周期長，費用較高，多態(tài)有限，對材料需求量大巨有放射性同位素的潛在污染和危害，因而目前尚不宜于用于品種的純度鑒定。衡V) (Randomly AmplifiedPolymorphic DNA)技術(shù)是以基因組DNA為模板，以一個隨機的寡核普酸序列為引物，一般為9-10bp堿基，通過PCR擴增反應(yīng)，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，再經(jīng)過脂糖凝膠電泳得到多態(tài)性的DNA譜帶。RAH)技術(shù)主要特點是反應(yīng)靈敏，多態(tài)性強，具有簡便、快速的優(yōu)點，既有大量的隨機引物可供篩選使用，又不受種屬的限制，因而被廣泛用于多種作物的品種純度鑒定。AFLP {Amplify Fragment length Poiymorphism)技術(shù)擴增片斷長度多態(tài)性是 RFLP 和 RAPD兩項技術(shù)的結(jié)合，是由荷蘭科學(xué)家為知細等人發(fā)明的一項專利技術(shù)。AFLP技術(shù)具較好的重復(fù)性，但操作復(fù)雜，步驟多，對實驗技能和儀器精度要求均很高，難以在作物品種純度鑒定上普及。SSR標記在人類及植物的基因組中，均存在著由1-4個堿基對組成的簡單重復(fù)序列{Simple sequence repeats,簡稱 SSR),又稱之為微衛(wèi)星, SSR 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于玉米、水稻等作物的品種純度鑒定，SSR最大的優(yōu)點在于其擴增產(chǎn)物在進行測序膠電泳分離時具有單堿基的高分辨率，能檢測到很高的多態(tài)性，遺傳信息量較大，并具有較好的穩(wěn)定性和重演性。
[0005]油葵新葵19號，是由新疆康地種業(yè)科技股份有限公司選育的產(chǎn)量較高、綜合經(jīng)濟性狀好、抗逆性較強的中晚熟油葵雜交種，2010年通過新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)作物品種審定委員會審定。生育期110天左右，植株莖桿粗壯，幼苗長勢強，植株生長整齊，抗旱，籽粒容重高，抗向日葵銹病，耐菌核病，抗褐斑病，抗霜霉病，抗逆性好。
[0006]綜上所述，從傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定、生化指紋檢測發(fā)展到分子水平和基因水平檢測雜交向日葵品種純度的檢驗技術(shù)經(jīng)歷了從簡單到復(fù)雜而精確的過程，每一種方法都有其各自的優(yōu)點和不足，因而至今在農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程中尚無快速的生化或DNA分子檢測技術(shù)標準程序。現(xiàn)有技術(shù)中未見報道有關(guān)鑒定油葵新葵19號品種純度的試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)中未見報道有關(guān)快速鑒定油葵新葵19號品種純度的試劑盒的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種快速鑒定油葵新葵19號品種純度的試劑盒，利用該試劑盒可快速有效用于鑒定上述油葵雜交種種子的純度，辨別種子的真?zhèn)?。利于油葵雜交種種子高效準確的質(zhì)量控制，加快油葵商品種子的質(zhì)量檢測進程，鑒定體系能夠在短時間內(nèi)對大量樣品進行快速鑒定，結(jié)果準確可靠。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案:通過建立了標準油葵DNA的提取試劑盒，包括油葵SSR技術(shù)最佳程序，PCR擴增反應(yīng)各組分的優(yōu)化組合和擴增試劑盒，以及擴增條帶的顯色程序；以商品油葵品種新葵19號及其雙親的DNA為模板，進行大量SSR引物分子標記的篩選和重復(fù)，獲得了鑒定出能夠同時區(qū)分父本、母本和雜交種的引物標記399和425，這2個引物標記可有效用于鑒定上述新葵19號雜交種種子的純度，辨別種子的真?zhèn)?，利于油葵雜交種種子高效準確的質(zhì)量控制，加快新葵19號商品種子的質(zhì)量檢測進程。
[0009]本發(fā)明具體提供一種能夠同時鑒定區(qū)分新葵19號父本、母本和雜交種的試劑盒，該試劑盒包括:
(I)油葵 DNA 快速提取試劑盒 A 配置:50mmol/L Tris-HCl ρΗ8，0.7 mmol/L NaCl, 10mmol/L EDTA, pH8,1% CTAB, 20mmol/L 2-巰基乙醇。
[0010](2)?0?擴增反應(yīng)試劑盒8配置:5父反應(yīng)緩沖液4111，25臟01/1 MgCl2溶液2ul，
0.lmmol/L dNTPs 溶液 3ul, lumol/L Primer 溶液 3ul (SSR 引物標記 399 和 425), 5u TaqDNA聚合酶0.2ul。
[0011]l-5ng模板DNA ;反應(yīng)總體積為20ul，擴增程序為95°C變性2min，94°C變性45 s、57°C退火45 s、72°C延伸60 s，共30個循環(huán)；72°C延伸8min。
[0012]引物標記399:
左序列 CGTACGGTGTAGTTCTCATGGT ；
右序列 GGATCACGTGGCGTTCTATT。
[0013]引物標記425:
左序列 CAAAATACCCAGGTCAAAGCA ；
右序列 CCTAGCTTATGGGACGTATGGA。
[0014]加樣緩沖液配試劑盒C配置:0.25%溴酚藍，0.25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至10mlo
[0015]利用以上試劑盒可有效用于鑒定上述油葵雜交種種子的純度，辨別種子的真?zhèn)?。SSR引物標記399擴增的新葵19號產(chǎn)生的母本特異條帶大小為470bp，產(chǎn)生的父本特異標記條帶大小為Obp ;雜交種的DNA片段中包含父母本的特征譜帶；SSR引物標記425擴增的新葵19號產(chǎn)生的母本特異條帶大小為500bp,產(chǎn)生的父本特異標記條帶大小為Obp ;雜交種的DNA片段中包含父母本的特征譜帶?？煽焖儆行в糜阼b定上述油葵雜交種種子的純度，辨別種子的真?zhèn)?，利于油葵雜交種種子高效準確的質(zhì)量控制，加快油葵商品種子的質(zhì)量檢測進程，鑒定體系能夠在短時間內(nèi)對大量樣品進行快速鑒定，結(jié)果準確可靠。
[0016]同時，本發(fā)明具體提供一種快速鑒定油葵新葵19號品種純度的方法，具體方法步驟如下:
(I)油葵 DNA 快速提取試劑含 50mmol/L Tris-HCl ρΗ8，0.7 mmol/L NaCl, 10 mmol/LEDTA, pH8,1% CTAB,20mmol/L 2-巰基乙醇。
[0017](2)PCR擴增反應(yīng)試劑含 5X 反應(yīng)緩沖液 4ul，25mmol/L MgCl2 溶液 2ul，0.lmmol/LdNTPs 溶液 3ul，lumol/L Primer 溶液 3ul (SSR 引物標記 399 和 425)，5u Taq DNA 聚合酶
0.2ul，l-5ng模板DNA ;反應(yīng)總體積為20ul，擴增程序為95°C變性2min，94°C變性45 s、57°C退火45 s、72°C延伸60 s，共30個循環(huán)；72°C延伸8min。
[0018](3)膠板的制備:擴增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度10%，待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；電泳緩沖液為1XTBE，使電泳緩沖液液面剛高出凝膠面，恒壓電泳。
[0019](4)電泳、觀察和拍照:取4ml上述步驟(2)PCR擴增反應(yīng)液加樣緩沖液1ml，含如下成分:0.25%溴酚藍，0.25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至10ml ;加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約Icm處時，停止電泳；電泳完畢，取出凝膠；凝膠用蒸餾水稍沖洗后，按照以下程序進行銀染:固定(10%乙醇、0.5%冰乙酸)20min ;銀染(0.2%硝酸銀水溶液)12min ;蒸懼水漂洗兩次；0.002%(w/v)硫代硫酸鈉的水溶液漂洗；顯色(1.5%氫氧化鈉、0.4%甲醛)適度；在白色燈下DNA存在處顯示出肉眼可辨的條帶，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。
[0020](5)上述步驟以商品油葵品種新葵19號及其雙親的DNA為模板，進行了約100對SSR物分子標記的篩選和重復(fù)，獲得了鑒定出能夠同時區(qū)分父本、母本和雜交種的SSR引物標記399和425。
[0021]本發(fā)明中，經(jīng)以商品油葵品種新葵19號及其雙親的DNA為模板，進行大量SSR引物分子標記的篩選和重復(fù)，獲得了 DNA快速提取和PCR擴增反應(yīng)的相關(guān)試劑盒，以及鑒定出能夠同時區(qū)分父本、母本和雜交種的SSR引物標記399和425。
[0022]通過實施本發(fā)明具體的技術(shù)指標，實現(xiàn)本
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達到以下有益效果:
(I)加快鑒定時間:本發(fā)明建立油葵DNA提取、SSR技術(shù)試劑盒，擴增效果穩(wěn)定，省去了繁雜的試劑配置和特定引物篩選進程。
[0023](2)特異性好:利用該試劑盒分別對新葵19號的母本多次后進行擴增，結(jié)果表明，各引物對各自模板均產(chǎn)生特異條帶。
[0024] (3)重復(fù)性好:用該試劑盒進行多次重復(fù)性檢測，結(jié)果表明，該方法具有很好的重復(fù)性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1顯示為新葵19號的399引物擴增結(jié)果圖，圖中從左到右依次為DNA標準分子量，即Ikb DNA Ladder I，父本、母本、雜種。
[0026]圖2顯示為新葵19號的425引物擴增結(jié)果圖，圖中從左到右依次為父本、母本、雜種，最后為DNA標準分子量，即Ikb DNA Ladderl。

【具體實施方式】
[0027]下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。
[0028]本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料和設(shè)備有:
主要原輔材料:新葵19號油葵種子是由新疆康地種業(yè)科技股份有限公司提供，是成熟商品品種，本領(lǐng)域可以通過市場購買獲得。
[0029]主要試劑設(shè)備:Tris-HCl，NaCl，EDTA,CTAB, 2_ 巰基乙醇，Taq DNA 聚合酶，dNTPs, Na2EDTA.2H20，溴酚藍，二甲苯青，蔗糖等；LRH-150_G型光照培養(yǎng)箱，上海儀器廠；醫(yī)用高壓蒸汽滅菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠。PCR擴增儀PCr2700、美國冷凍離心機eppendorf5810、美國分光光度計NdlOOO、美國可調(diào)移液器Eppendor、美國純水系統(tǒng)Mi Iib 美國。
[0030]本發(fā)明中選用的所有原輔材料、試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知的，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。
[0031]實施例一:快速鑒定油葵新葵19號品種純度的試劑盒
本發(fā)明提供了鑒定出能夠同時區(qū)分新葵19號父本、母本和雜交種的試劑盒，該試劑盒包括:
(I)油葵 DNA 快速提取試劑盒 A 配置:50mmol/L Tris-HCl ρΗ8，0.7 mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA, pH8,1% CTAB, 20mmol/L 2-巰基乙醇。
[0032](2)?0?擴增反應(yīng)試劑盒8配置:5父反應(yīng)緩沖液4111，25臟01/1 MgCl2溶液2ul，
0.lmmol/L dNTPs 溶液 3ul, lumol/L Primer 溶液 3ul (SSR 引物標記 399 和 425), 5u TaqDNA聚合酶0.2ul。
[0033]l-5ng模板DNA ;反應(yīng)總體積為20ul，擴增程序為95°C變性2min，94°C變性45 s、57°C退火45 s、72°C延伸60 s，共30個循環(huán)；72°C延伸8min。
[0034]引物標記399:
左序列 CGTACGGTGTAGTTCTCATGGT ；
右序列 GGATCACGTGGCGTTCTATT)。
[0035]引物標記425:
左序列 CAAAATACCCAGGTCAAAGCA ；
右序列 CCTAGCTTATGGGACGTATGGA。
[0036]加樣緩沖液配試劑盒C配置:0.25%溴酚藍，0.25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至10ml。
[0037]利用以上試劑盒可有效用于鑒定上述油葵雜交種種子的純度，辨別種子的真?zhèn)?。SSR引物標記399擴增的新葵19號產(chǎn)生的母本特異條帶大小為470bp，產(chǎn)生的父本特異標記條帶大小為Obp ;雜交種的DNA片段中包含父母本的特征譜帶；SSR引物標記425擴增的新葵19號產(chǎn)生的母本特異條帶大小為500bp,產(chǎn)生的父本特異標記條帶大小為Obp ;雜交種的DNA片段中包含父母本的特征譜帶。可快速有效用于鑒定上述油葵雜交種種子的純度，辨別種子的真?zhèn)危谟涂s交種種子高效準確的質(zhì)量控制，加快油葵商品種子的質(zhì)量檢測進程，鑒定體系能夠在短時間內(nèi)對大量樣品進行快速鑒定，結(jié)果準確可靠。
[0038]實施例二:油葵新葵19號品種純度的快速鑒定
一種快速鑒定油葵新葵19號品種純度的方法，具體方法步驟如下:
(I)油葵 DNA 快速提取試劑含 50mmol/L Tris-HCl ρΗ8，0.7 mmol/L NaCl, 10 mmol/LEDTA, pH8,1% CTAB,20mmol/L 2-巰基乙醇。
[0039](2)PCR擴增反應(yīng)試劑含 5X 反應(yīng)緩沖液 4ul，25mmol/L MgCl2 溶液 2ul，0.lmmol/LdNTPs 溶液 3ul，lumol/L Primer 溶液 3ul (SSR 引物標記 399 和 425)，5u Taq DNA 聚合酶
0.2ul，l-5ng模板DNA ;反應(yīng)總體積為20ul，擴增程序為95°C變性2min，94°C變性45 s、57°C退火45 s、72°C延伸60 s，共30個循環(huán)；72°C延伸8min。
[0040](3)膠板的制備:擴增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度10%，待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；電泳緩沖液為1XTBE，使電泳緩沖液液面剛高出凝膠面，恒壓電泳。
[0041](4)電泳、觀察和拍照:取4ml上述步驟(2)PCR擴增反應(yīng)液加樣緩沖液1ml，含如下成分:0.25%溴酚藍，0.25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至10ml ;加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約Icm處時，停止電泳；電泳完畢，取出凝膠；凝膠用蒸餾水稍沖洗后，按照以下程序進行銀染:固定(10%乙醇、0.5%冰乙酸)20min ;銀染(0.2%硝酸銀水溶液)12min ;蒸懼水漂洗兩次；0.002%(w/v)硫代硫酸鈉的水溶液漂洗；顯色(1.5%氫氧化鈉、0.4%甲醛)適度；在白色燈下DNA存在處顯示出肉眼可辨的條帶，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。
[0042](5)上述步驟以商品油葵品種新葵19號及其雙親的DNA為模板，進行了約100對SSR物分子標記的篩選和重復(fù)，獲得了鑒定出能夠同時區(qū)分父本、母本和雜交種的SSR引物標記399和425。
[0043]本發(fā)明中，經(jīng)以商品油葵品種新葵19號及其雙親的DNA為模板，進行大量SSR引物分子標記的篩選和重復(fù)，獲得了 DNA快速提取和PCR擴增反應(yīng)的相關(guān)試劑盒，以及鑒定出能夠同時區(qū)分父本、母本和雜交種的SSR引物標記399和425。
[0044]實施例三:油葵新葵19號品種純度的快速鑒定
(I)向日葵DNA提取:取上述培養(yǎng)I周的向日葵幼嫩真葉于研缽中，加入液氮迅速研磨使成均勻粉狀，在樣品未融化之前加入65°C預(yù)熱的CTAB提取試劑盒500 μ 1，充分混勻后把樣液移入1.5 ml離心管中，置65°C水浴50 min，其間顛倒離心管數(shù)次，CTAB提取試劑盒采用 50 mmol/L Tris-HCl ρΗ8，0.7 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA，pH8，l% CTAB,20mmol/L 2-巰基乙醇； 取出樣品冷卻至室溫，分別加入等體積的酚/氯仿(I:1)和氯仿/異戊醇(24: I)進行抽提，4°C 12000 r/min離心5 min ;取上清液加入0.6倍體積的異丙醇混勻，于室溫放置5-10 min, 12000 r/min離心5 min，去上清，用100 μ I 70%乙醇洗滌沉淀，置無菌臺吹干；用雙蒸水溶解DNA沉淀，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0045](2) PCR擴增反應(yīng)及程序:取上一步已提取的DNA l_5ng，反應(yīng)總體積為20ul，試劑盒含 5X 反應(yīng)緩沖液 4ul, 25mmol/L MgCl2 溶液 2ul, 0.lmmol/L dNTPs 溶液 3ul, lumol/LPrimer溶液3ul, 5u Taq DNA聚合酶0.2ul, l-5ng模板DNA ;擴增程序為95°C變性2min,94°C變性45 s、57°C退火45 s、72°C延伸60 s，共30個循環(huán)；72°C延伸8min。
[0046](3)膠板的制備:擴增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度10%，待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；電泳緩沖液為1XTBE，使電泳緩沖液液面剛高出凝膠面，恒壓電泳。
[0047](4)電泳、觀察和拍照:取上述第(3)步驟PCR擴增反應(yīng)液4ml加樣緩沖試劑盒Iml (0.25%溴酚藍，0.25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml)，加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約Icm處時，停止電泳；電泳完畢，取出凝膠；凝膠用蒸餾水稍沖洗后，按照以下程序進行銀染:固定(10%乙醇、0.5%冰乙酸)20min ;銀染(0.2%硝酸銀水溶液)12min ;蒸懼水漂洗兩次；0.002%(w/v)硫代硫酸鈉的水溶液漂洗；顯色(1.5%氫氧化鈉、0.4%甲醛)適度；在白色燈下DNA存在處顯示出肉眼可辨的條帶，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。
[0048]經(jīng)上述油葵新葵19號品種純度的快速鑒定獲得以下顯著的技術(shù)效果:
(I)利用該試劑盒檢測時間快，只需要1-2天時間。
[0049](2)特異性強:參見附圖1，箭頭所示為新葵19號的399引物擴增結(jié)果圖，圖中從左到右依次為DNA標準分子量，即Ikb DNA Ladderl,父本、母本、雜種。箭頭所示為新葵19號產(chǎn)生的母本特異標記339引物條帶大小為470bp，產(chǎn)生的父本特異標記條帶大小為Obp ；雜交種的DNA片段中包含父母本的特征譜帶。
[0050]參見附圖2，顯示為新葵19號的425引物擴增結(jié)果圖，圖中從左到右依次為父本、母本、雜種，最后為DNA標準分子量，即Ikb DNA Ladderl。箭頭所示為新葵19號產(chǎn)生的母本特異標記425引物條帶大小為500bp，產(chǎn)生的父本特異標記條帶大小為Obp ;雜交種的DNA片段中包含父母本的特征譜帶。
[0051] 經(jīng)過上述各實施例的詳細試驗反復(fù)驗證，采用本發(fā)明提供的快速鑒定油葵新葵19號品種純度的試劑盒進行多次重復(fù)性檢測，結(jié)果表明，該方法具有很好的重復(fù)性，且具有利用該試劑盒檢測時間快，只需要1-2天時間，顯示出顯著的特異性強。因此上述兩個引物擴增產(chǎn)物均可以區(qū)別新葵19號母本、其雜交種、父本，可有效用于鑒定上述油葵雜交種種子的純度，其中雙引物可以有效的辨別種子的真?zhèn)巍?br> 【權(quán)利要求】
1.一種能夠同時鑒定區(qū)分新葵19號父本、母本和雜交種的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括油葵SSR標記，PCR擴增反應(yīng)各組分的優(yōu)化組合和擴增試劑盒，以及擴增條帶的顯色程序；以商品油葵品種新葵19號及其雙親的DNA為模板，進行大量SSR引物分子標記的篩選和重復(fù)，獲得了鑒定出能夠同時區(qū)分父本、母本和雜交種的引物標記399和425，具體闡述如下: (1)油葵DNA 快速提取試劑盒 A 配置:50mmol/L Tris-HCl pH8, 0.7 mmol/L NaCl, 10mmol/L EDTA, pH8,1% CTAB, 20mmol/L 2-巰基乙醇； (2)PCR擴增反應(yīng)試劑盒B配置:5X反應(yīng)緩沖液4ul，25mmol/LMgCl2溶液2ul，0.1 mmol/L dNTPs 溶液 3ul, lumol/L Primer 溶液 3ul, SSR 引物標記 399 和 425，5u Taq DNA聚合酶0.2ul ； l_5ng模板DNA ;反應(yīng)總體積為20ul，擴增程序為95°C變性2min，94°C變性45 s ,57°C退火45 s、72°C延伸60 s，共30個循環(huán)；72°C延伸8min ; 引物標記399:
左序列 CGTACGGTGTAGTTCTCATGGT ； 右序列 GGATCACGTGGCGTTCTATT)； 引物標記425: 左序列 CAAAATACCCAGGTCAAAGCA ； 右序列 CCTAGCTTATGGGACGTATGGA ； 加樣緩沖液配試劑盒C配置:0.25%溴酚藍，0.25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml。
2.一種快速鑒定油葵新葵19號品種純度的方法，其特征在于，具體鑒定方法步驟如下: (1)油葵DNA 快速提取試劑含 50mmol/L Tris-HCl pH8, 0.7 mmol/L NaCl, 10 mmol/LEDTA, pH8,1% CTAB,20mmol/L 2-巰基乙醇； (2)PCR擴增反應(yīng)試劑含5X反應(yīng)緩沖液4ul，25mmol/L MgCl2溶液2ul，0.lmmol/LdNTPs 溶液 3ul, lumol/L Primer 溶液 3ul (SSR 引物標記 399 和 425)，5u Taq DNA 聚合酶.0.2ul, l-5ng模板DNA ;反應(yīng)總體積為20ul，擴增程序為95°C變性2min，94°C變性45 s、.57°C退火45 s、72°C延伸60 s，共30個循環(huán)；72°C延伸8min ; (3)膠板的制備:擴增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度10%，待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；電泳緩沖液為1XTBE，使電泳緩沖液液面剛高出凝膠面，恒壓電泳； (4)電泳、觀察和拍照:取4ml上述步驟(2)PCR擴增反應(yīng)液加樣緩沖液1ml，含如下成分:0.25%溴酚藍，0.25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至10ml ;加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約Icm處時，停止電泳；電泳完畢，取出凝膠；凝膠用蒸懼水稍沖洗后，按照以下程序進行銀染:固定米用10%乙醇、0.5%冰乙酸20min ;銀染米用.0.2%硝酸銀水溶液12min ;蒸餾水漂洗兩次；0.002% (w/v)硫代硫酸鈉的水溶液漂洗；1.5%氫氧化鈉、0.4%甲醛顯色適度；在白色燈下DNA存在處顯示出肉眼可辨的條帶，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之； (5)上述步驟以商品油葵品種新葵19號及其雙親的DNA為模板，進行了約100對SSR物分子標記的篩選和重復(fù)，獲得了鑒定出能夠同時區(qū)分父本、母本和雜交種的SSR引物標記 399 和 425 。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164513SQ201410434784
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】段維, 楊濤, 王沛政, 朱文彬, 劉文杰, 李曉雷, 衛(wèi)澤 申請人:新疆康地種業(yè)科技股份有限公司