一種與仔豬腹瀉相關(guān)的snp標記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與仔豬腹瀉相關(guān)的SNP標記及其應(yīng)用，該標記DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述序列中的第98個堿基呈現(xiàn)T或G的多態(tài)性。該多態(tài)性導(dǎo)致所編碼的氨基酸發(fā)生改變，并且與仔豬腹瀉率存在相關(guān)。根據(jù)該基因的單核苷酸多態(tài)性可對基因組DNA中含有ASIP基因的種豬進行仔豬腹瀉抗性性狀選育，篩選出顯著降低仔豬腹瀉率優(yōu)勢基因型品種，具有極其重大的應(yīng)用價值和經(jīng)濟效益。
【專利說明】一種與仔豬腹瀉相關(guān)的SNP標記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于豬的分子生物學(xué)技術(shù)及育種領(lǐng)域，具體是涉及一種與仔豬腹瀉率相關(guān) 特征的SNP遺傳標記及其應(yīng)用方法。

【背景技術(shù)】：
[0002] 我國是世界第一養(yǎng)豬大國，年出欄豬約占全球一半左右。與此同時，我國的豬病多 而泛濫，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失，嚴重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。仔豬腹瀉是豬病中最常見 的疾病之一，豬的死亡率主要發(fā)生于初生階段，若能降低仔豬腹瀉率，無疑具有重大的經(jīng)濟 效益。
[0003] 本 申請人:在前期多個科研項目的資助下，在豬的全基因組范圍內(nèi)初步篩選影響仔 豬腹瀉的候選基因，豬鼠色信號蛋白（ASIP)就是其中之一。眾所周知，ASIP基因?qū)τ谟袡C 體色素從深的真黑素轉(zhuǎn)化為淺的表黑素具有重要作用。據(jù)報道，ASIP及其神經(jīng)肽同類物與 鼠色相關(guān)的蛋白還參與能量平衡，paracrine信號分子的黑素受體的亞單位具有明顯的反 興奮作用。ASIP在小鼠中廣泛分布和表達，可導(dǎo)致動物的表現(xiàn)包括相同的黃皮、肥大、超重 以及類似于人II型糖尿病的代謝紊亂等。這些報道表明ASIP基因?qū)τ跈C體有著廣泛、復(fù) 雜的影響，當(dāng)然也有可能與腹瀉有關(guān)。
[0004] 目前沒有關(guān)于豬ASIP基因與仔豬腹瀉相關(guān)性的研究報道。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種與仔豬腹瀉率相關(guān)特征的 SNP遺傳標記及其應(yīng)用方法。
[0006] 一種與仔豬腹瀉相關(guān)的SNP標記，DNA序列如SEQ ID NO. 1所示；所述序列中的第 98個堿基呈現(xiàn)T或G的多態(tài)性。所述的多態(tài)性導(dǎo)致所編碼的氨基酸為亮氨酸或纈氨酸。
[0007] 擴增所述的與仔豬腹瀉相關(guān)的SNP標記的引物對的序列如下：
[0008] 正向引物：5' -ctcgcctcctcttagctacd，
[0009] 反向引物：5'-ctgtgccaccttcttcatcg-3' ?
[0010] 所述的與仔豬腹瀉相關(guān)的SNP標記用于篩選或者選育仔豬腹瀉率低的品種。
[0011] 本發(fā)明確定的SNP標記序列即ASIP基因序列，其DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。該序列的第98堿基處有一個堿基突變T98-G98。該突變導(dǎo)致所編碼的氨基酸發(fā)生改 變，而且仔豬腹瀉率高的為亮氨酸（L)，仔豬腹瀉率低的為纈氨酸（V)。DNA所編碼的氨基酸 序列圖如SEQ ID N0. 2所示。
[0012] 利用本發(fā)明的SNP標記進行篩選檢測，具體包括如下步驟：
[0013] (1)根據(jù)GenBank中豬ASIP基因的mRNA序列，用Primer5.0設(shè)計引物，覆蓋該基 因部分編碼序列；
[0014] ⑵獲取豬基因組DNA，并以此為模板，PCR擴增，產(chǎn)物純化，克隆，獲得如序列表 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；
[0015] (3)鑒定該基因序列的第98堿基處是否存在多態(tài)性。
[0016] 所述引物為：正向引物：5'-ctcgcctcctcttagctacc-3'，
[0017] 反向引物：5' -ctgtgccaccttcttcatcg_3, 〇
[0018] 上述步驟（3)中ASIP基因序列第98堿基處的多態(tài)性是指一個堿基突變?yōu)門或G。
[0019] 將上述序列翻譯為氨基酸序列，結(jié)果表明該突變導(dǎo)致所編碼的氨基酸發(fā)生改變， 亮氨酸（L)突變?yōu)槔i氨酸（V)。且該突變與仔豬腹瀉率存在相關(guān)，仔豬腹瀉率高的為亮氨酸 (L)，仔豬腹瀉率低的為纈氨酸（V)。
[0020] 本發(fā)明采用PCR與DNA測序結(jié)合的方法首先篩選出ASIP基因為仔豬腹瀉的相關(guān) 基因，繼而從豬ASIP基因上篩選到與性狀相關(guān)的SNP，并且通過生產(chǎn)實踐驗證確定ASIP基 因為仔豬腹瀉相關(guān)基因，篩選的SNP為與之相關(guān)的SNP。本發(fā)明篩選的豬ASIP基因的SNP 可作為低腹瀉率仔豬品種輔助選擇的遺傳標記，從而培育出腹瀉率更低的豬，具有極其重 大的應(yīng)用價值和經(jīng)濟效益。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0021] 圖1為豬ASIP基因部分序列的PCR-SSCP電泳圖。

【具體實施方式】：
[0022] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步地解釋，但具體實施例并不對本發(fā)明做任 何限定。
[0023] 實施例1豬相關(guān)基因 SNP篩選
[0024] 選擇相同日齡的健康商品仔豬300只進行試驗，所有初生仔豬打上耳標后，用腸 毒素大腸桿菌感染，觀察3天內(nèi)仔豬腹瀉情況，并記錄每頭豬的腹瀉情況。分別提取其基因 組DNA。對每頭豬采集血樣，提取DNA后進行擴增、測序；確定每頭豬的SNP類型。
[0025] 根據(jù)GenBank中豬ASIP基因的mRNA序列，用Primer5. 0設(shè)計引物， 覆蓋該基因部分編碼序列，引物序列為：5' -ctcgcctcctcttagctacc-3 (正向）， 5' -ctgtgccaccttcttcatcg-3'（反向），由上海英韋創(chuàng)津公司合成。用上述引物分別對提取 的豬基因組DNA進行擴增。
[0026] PCR:10yl 反應(yīng)體系：10Xbuffer(含 Mg2+)lyl,上、下弓| 物（20ymol/L)各 0· 15μ 1，dNTPs(10ymol/L)0. 2μ 1，Taq 酶 1U，DNA(100ng)0. 7μ 1，超純水補至所需體積。
[0027] PCR擴增程序：94°C 5分鐘預(yù)變性后30個PCR循環(huán)參數(shù)為：95°C 30秒，56. 5°C 30 秒，72 °C 30秒，最后72 °C 7分鐘。
[0028] 取擴增產(chǎn)物5 μ 1，加入變性劑（95 %甲硝銨）10 μ 1，95°C變性10分鐘，再冰浴5分 鐘后，點樣于15%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳（丙烯酰胺/Ν，Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺為29 : 1)，電壓保持在80?100V，常溫下電泳約16?18小時，直至蘭色溴酚藍染料至凝膠最底端 為止。凝膠用硝酸銀染色，結(jié)果參見圖1，SSCP分析結(jié)果表現(xiàn)為：豬ASIP基因部分DNA片 段有三種不同條帶類型，說明該DNA片段存在SNP。我們將第98堿基為T定義為A等位基 因，第98堿基為G定義為B等位基因，三種不同條帶類型分別定義為AA型和BB型，雜合型 定義為AB型。
[0029] 取PCR擴增產(chǎn)物50 μ 1，產(chǎn)物純化后送上海英韋創(chuàng)津公司測序，測序結(jié)果確證了 PCR產(chǎn)物是ASIP基因，PCR產(chǎn)物的長度為 239bp，序列如序列表中的SEQIDN0:l所示。
[0030] 將上述產(chǎn)物進行氨基酸序列分析，結(jié)果見SEQ ID NO :2。
[0031] 氨基酸序列分析表明，豬ASIP基因序列的一個堿基突變導(dǎo)致該基因在表達時所 轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)中氨基酸序列發(fā)生變異，亮氨酸（L)突變?yōu)槔i氨酸（V)。
[0032] 對300個樣品的基因型與仔豬腹瀉率進行測定，結(jié)果見表1?？梢姡媚c毒素大腸 桿菌感染時，BB型樣本腹瀉率高達91. 7%，AB型樣本腹瀉率為82. 5%，而AA型樣本的腹瀉 率只有13. 8%，顯著低于其他2種基因型。
[0033] 表1各基因型腹瀉情況
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種與仔豬腹瀉相關(guān)的SNP標記，其特征在于，DNA序列如SEQ ID NO. 1所示；所述 序列中的第98個堿基呈現(xiàn)T或G的多態(tài)性。
2. 如權(quán)利要求1所述的與仔豬腹瀉相關(guān)的SNP標記，其特征在于，所述的多態(tài)性導(dǎo)致所 編碼的氨基酸為亮氨酸或纈氨酸。
3. 擴增如權(quán)利要求1所述的與仔豬腹瀉相關(guān)的SNP標記的引物對，其特征在于，所用引 物對的序列如下： 正向引物：5'-ctcgcctcctcttagctacc_3'， 反向引物：5'-ctgtgccaccttcttcatcg_3'。
4. 權(quán)利要求1所述的與仔豬腹瀉相關(guān)的SNP標記用于篩選或者選育仔豬腹瀉率低的品 種。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152453SQ201410429232
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】蔣雋, 劉定發(fā), 周紅麗, 何俊, 馬海明 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 汕尾寶山豬場有限公司, 蔣雋, 劉定發(fā)