鑒定和區(qū)分多房棘球蚴和石渠棘球蚴感染的pcr-rflp檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒定和區(qū)分多房棘球蚴和石渠棘球蚴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包含如SEQ?ID?NO.1和2所示的Em和Es通用引物、限制性內(nèi)切酶EcoR?Ⅰ和/或Ssp?Ⅰ；還包含PCR試劑和多房棘球蚴和石渠棘球蚴DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物。通過(guò)提取待檢測(cè)樣品單個(gè)包囊的DNA作為模板，再使用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后再使用EcoR?Ⅰ或Ssp?Ⅰ內(nèi)切酶酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳即可達(dá)到鑒定和區(qū)分多房棘球蚴和石渠棘球蚴感染的目的。本發(fā)明省去了測(cè)序造成的耗時(shí)、耗錢(qián)和數(shù)據(jù)處理的繁瑣過(guò)程，且不需要復(fù)雜的操作系統(tǒng)，可以快速、方便、經(jīng)濟(jì)的區(qū)分鑒定野生嚙齒動(dòng)物感染多房棘球蚴還是感染石渠棘球蚴。
【專利說(shuō)明】鑒定和區(qū)分多房棘球蚴和石渠棘球蚴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及寄生蟲(chóng)的檢測(cè)，特別涉及一種鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]多房棘球絳蟲(chóng)(Echinococcus multilocularis, Em)幼蟲(chóng)與石渠棘球絳蟲(chóng)(Echinococcus shiquicus, Es)幼蟲(chóng)均可寄生于哨齒動(dòng)物體(如高原鼠兔、青海田鼠等)內(nèi)，且兩者包囊外形極其相似，長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)均被認(rèn)為是多房棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)，直至在藏狐(Vuipes ferrilata)腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了石渠棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng),才明確地將石渠棘球絳蟲(chóng)與多房棘球絳蟲(chóng)區(qū)分開(kāi)來(lái)，進(jìn)而確定石渠棘球絳蟲(chóng)為棘球?qū)俚囊粋€(gè)新種。多房棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)的蟲(chóng)卵感染人和多種嚙齒動(dòng)物，引起多房棘球蝴病，人的多房棘球蝴病危害嚴(yán)重，病死率極高，又稱“蟲(chóng)癌”，嚴(yán)重威脅我國(guó)西部廣大牧民的生命與健康。石渠棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)主要感染嚙齒動(dòng)物，目前尚無(wú)人感染病例的報(bào)道。對(duì)嚙齒動(dòng)物棘球絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染的調(diào)查可以作為某一地區(qū)棘球蝴病流行情況的指標(biāo)之一。因此，建立一種快速、經(jīng)濟(jì)的方法區(qū)分該兩種棘球蝴的檢測(cè)試劑盒對(duì)開(kāi)展棘球蝴病流行病學(xué)調(diào)查，預(yù)防和控制棘球蝴病的流行具有重要的意義。
[0003]目前鑒定區(qū)分兩個(gè)物種主要依靠其遺傳物質(zhì)間的差異，這種方法涉及到測(cè)序，在沒(méi)有測(cè)序儀的基層單位，則顯得相對(duì)耗時(shí)、耗錢(qián)，同時(shí)由于序列處理、比對(duì)等涉及到相關(guān)的生物信息學(xué)工具，對(duì)大批量調(diào)查時(shí)則會(huì)造成數(shù)據(jù)處理繁瑣或易出錯(cuò)等情況。
[0004]隨著多房棘球絳蟲(chóng)和石渠棘球絳蟲(chóng)的線粒體全基因的測(cè)序工作的相繼完成，在比對(duì)其線粒體全基因組序列后，發(fā)現(xiàn)存在兩段DNA序列上同一內(nèi)切酶位點(diǎn)的個(gè)數(shù)和分布不同，這為利用內(nèi)切酶對(duì)兩種棘球絳蟲(chóng)線粒體基因組上同一、長(zhǎng)度一致的片段進(jìn)行切割產(chǎn)生條帶大小和個(gè)數(shù)不同提供了可行性，依據(jù)電泳圖便可直觀的將該兩種棘球絳蟲(chóng)區(qū)分。此方法比測(cè)序具有快速、簡(jiǎn)便和耗錢(qián)少的優(yōu)點(diǎn)，不需要測(cè)序所需的PCR儀，該方法只需要恒溫水浴鍋和兩種內(nèi)切酶即可完成，其中膠回收試劑盒可有可無(wú)。到目前為止，尚無(wú)應(yīng)用此方法區(qū)分野生嚙齒動(dòng)物感染多房棘球蝴和石渠棘球蝴的文獻(xiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種快速、簡(jiǎn)便地鑒定和區(qū)分野生嚙齒動(dòng)物多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP方法及檢測(cè)試劑盒。
[0006]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方法實(shí)現(xiàn):
[0007]一種鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP方法，PCR擴(kuò)增的引物為Em和Es通用引物，限制性內(nèi)切酶為EcoR I和/或Ssp I。所述的Em和Es通用引物為:
[0008]F:5’ -TAA GffT RAG TGT GTG TGT TGG T-3’，
[0009]R:5’ -TAA RCA AAC CTC TCA ACG AGA C-3’ ；
[0010]其中，W= A/T，R = A/G。
[0011]利用通用引物擴(kuò)增出的Em DNA序列片段長(zhǎng)度為1417bp，Es DNA序列片段長(zhǎng)度為1426bp。
[0012]EcoR I和Ssp I酶切位點(diǎn)在Em和Es片段中的位置分別如圖1和圖2所示。使用通用引物擴(kuò)增的Em DNA片段在261和757bp處有Ssp I酶切位點(diǎn)；擴(kuò)增的Es DNA片段在254bp處有EcoR I酶切位點(diǎn)，在1175bp處有Ssp I酶切位點(diǎn)。
[0013]一種鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒，包含上述通用引物、EcoR I和/或Ssp I ο
[0014]優(yōu)選的，所述的鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒，還包含用于DNA擴(kuò)增的PCR試劑。
[0015]更優(yōu)選的，所述的試劑盒還包含多房棘球蝴和石渠棘球蝴DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物。
[0016]所述的鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒的制備方法優(yōu)選如下:
[0017](I)通用引物的設(shè)計(jì)與酶切位點(diǎn)的選擇
[0018]根據(jù)NCBI中提交的已完成的多房棘球絳蟲(chóng)(登錄號(hào):AB018440)和石渠棘球絳蟲(chóng)(登錄號(hào):AB208064)線粒體基因組序列，利用DNAMAN軟件分別找出兩個(gè)線粒體DNA中含有的酶切位點(diǎn)及其所在的位置，再結(jié)合ClustalW軟件進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果，找出兩個(gè)物種線粒體DNA上同時(shí)或某一個(gè)具備某一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的一段DNA序列，參考TaKaRa公司限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品目錄及報(bào)價(jià)信息，最終確定了多房棘球絳蟲(chóng)線粒體基因組上位置為7123-8539和石渠棘球絳蟲(chóng)線粒體基因組上位置為7160-8585的兩段序列作為鑒定的參考序列，設(shè)計(jì)上下游兼并引物，選擇兩種限制性內(nèi)切酶EcoR I和Ssp I用于相互驗(yàn)證酶切結(jié)果。
[0019](2) DNA聚合酶及限制性內(nèi)切酶的選擇
[0020]本著經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、高效與準(zhǔn)確的原則，DNA聚合酶采用TransGen(北京)公司的2X EmyTaqn PCR SuperMix,該產(chǎn)品包括Easy7?/+ DNA聚合酶、dNTPs和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，濃度為2X ;EcoR I內(nèi)切酶為T(mén)aKaRa(大連)公司所生產(chǎn)，包括EcoR I內(nèi)切酶(10000U)和1XEcoR I Buffer ；Ssp I內(nèi)切酶為T(mén)aKaRa(大連)公司所生產(chǎn)，包括SspI 內(nèi)切酶(500U)和 1XSsp I Buffer0[0021 ] (3)多房棘球蝴和石渠棘球蝴DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物的制備
[0022]野外采集的嚙齒動(dòng)物肺臟包囊或肝臟包囊，用鑷子把單個(gè)的包囊分離出來(lái)，然后根據(jù)組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取單個(gè)包囊的DNA，分別擴(kuò)增其線粒體基因組上的coxl基因片段，送測(cè)序公司測(cè)序后，根據(jù)已提交的兩種棘球絳蟲(chóng)的coxl基因比對(duì)后，確定其蟲(chóng)種，而相應(yīng)的單個(gè)包囊的DNA或者用重組目的基因質(zhì)粒DNA作為DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物。
[0023]所述的鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒的使用方法包括如下步驟:
[0024](I)提取待檢測(cè)樣品單個(gè)包囊的DNA。
[0025](2)以提取的DNA為模板，使用PCR試劑按如下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增:94°C 4min ；94°C 30s,54°C 30s, 72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C 1min0
[0026](3)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。
[0027](4)再使用EcoR I或Ssp I內(nèi)切酶酶切純化的PCR產(chǎn)物。
[0028](5)對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。
[0029]使用本發(fā)明試劑盒和方法可以快速、方便、經(jīng)濟(jì)的區(qū)分鑒定野生嚙齒動(dòng)物感染多房棘球蝴還是感染石渠棘球蝴，省去了測(cè)序造成的耗時(shí)、耗錢(qián)和數(shù)據(jù)處理的繁瑣過(guò)程，同時(shí)不需要復(fù)雜的操作系統(tǒng)，在普通的實(shí)驗(yàn)室就可進(jìn)行，因此存在潛在的實(shí)驗(yàn)研究和極具潛力的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1是EcoR I酶切位點(diǎn)在Em和Es片段中的位置示意圖。
[0031]圖2是Ssp I酶切位點(diǎn)在Em和Es片段中的位置示意圖。
[0032]圖3是實(shí)施例2DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子DL2000，EM:Em DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物；ES:Es DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物。
[0033]圖4是實(shí)施例2DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M =DNA標(biāo)準(zhǔn)分子DL2000 ;左圖為EcoR I內(nèi)切酶酶切結(jié)果，1:未酶切的Em DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物，2:經(jīng)酶切后的Em DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物，3:未酶切的EsDNA模板標(biāo)準(zhǔn)物，4:經(jīng)酶切后的EsDNA模板標(biāo)準(zhǔn)物；右圖為Ssp I內(nèi)切酶酶切結(jié)果，1:未酶切的Em DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物，2:經(jīng)酶切后的Em DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物，3:未酶切的Es DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物，4:經(jīng)酶切后的Es DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物。
[0034]圖5是實(shí)施例3臨床樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M =DNA標(biāo)準(zhǔn)分子DL2000 ; 1-3分別為多房棘球絳蟲(chóng)達(dá)日縣株、玉樹(shù)株和久治縣株；4-9:石渠棘球絳蟲(chóng)久治縣株、達(dá)日縣株(5個(gè))。
[0035]圖6是實(shí)施例3臨床樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子DL2000 ;左圖為EcoR I內(nèi)切酶酶切結(jié)果，1:未酶切的Em DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物，2-4:多房棘球絳蟲(chóng)達(dá)日縣株、玉樹(shù)株和久治縣株酶切結(jié)果，5:未酶切的Es DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物，6-11:石渠棘球絳蟲(chóng)久治縣株和達(dá)日縣株(5個(gè))酶切結(jié)果；右圖為Ssp I內(nèi)切酶酶切結(jié)果，1:未酶切的Em DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物，2-4:多房棘球絳蟲(chóng)達(dá)日縣株、玉樹(shù)株和久治縣株酶切結(jié)果，5:未酶切的Es DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物，6-11:石渠棘球絳蟲(chóng)久治縣株和達(dá)日縣株(5個(gè)基因型)酶切結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述。應(yīng)理解，下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0037]實(shí)施例1
[0038]一種鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒，包含:TransGen (北京)公司的 2 X EasyTai廣.PCR SuperMix^TaKaRa (大連)公司 EcoR I 和 Ssp
I內(nèi)切酶、通用引物以及多房棘球蝴和石渠棘球蝴的DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物。
[0039]通用引物的序列為:
[0040]F:5’ -TAA GffT RAG TGT GTG TGT TGG T-3，，
[0041]R:5’ -TAA RCA AAC CTC TCA ACG AGA C-3，，
[0042]其中，W= A/T, R = A/Go
[0043]實(shí)施例2對(duì)DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行鑒定
[0044](I)DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物PCR擴(kuò)增
[0045]用實(shí)施例1中的試劑盒中提供的PCR試劑、通用引物、兩種棘球絳蟲(chóng)的DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物，分別做PCR擴(kuò)增。為驗(yàn)證野外條件下可能存在多房棘球絳蟲(chóng)和石渠棘球絳蟲(chóng)混合感染的情況，另增加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)模板各半的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系如下:
[0046]

【權(quán)利要求】
1.一種鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP方法，其特征在于:PCR擴(kuò)增的引物為Em和Es通用引物，限制性內(nèi)切酶為EcoR I和/或Ssp I ;所述的Em和Es通用引物為:
F:5’ -TAA GffT RAG TGT GTG TGT TGG T-3’，
R:5，-TAA RCA AAC CTC TCA ACG AGA C-3，， 其中，W = A/T, R = A/Go
2.一種鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒，其特征在于:包含權(quán)利要求1所述的Em和Es通用引物、EcoR I和/或Ssp I。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒，其特征在于:包含PCR試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒，其特征在于:包含多房棘球蝴和石渠棘球蝴DNA模板標(biāo)準(zhǔn)物。
5.權(quán)利要求2所述的鑒定和區(qū)分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下步驟: (1)提取待檢測(cè)樣品單個(gè)包囊的DNA； (2)以提取的DNA為模板，使用PCR試劑按如下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增:94V 4min ；94°C 30s,54°C 30s, 72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C 1min ； (3)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化； (4)再使用EcoRI或Ssp I內(nèi)切酶酶切純化的PCR產(chǎn)物； (5)對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104164512SQ201410426254
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】賈萬(wàn)忠, 范彥雷, 婁忠子, 李立, 閆鴻斌, 蔡進(jìn)忠, 史萬(wàn)貴, 李建秋, 劉聰暖, 楊玉榮, 唐納德·麥克麥納斯 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所