一種太湖新銀魚物種分子鑒定的引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種太湖新銀魚物種分子鑒定的引物和方法，屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記領(lǐng)域。本發(fā)明引物序列：ND5L(5’-CTTGGTGCAAATCCAAGCAGGAAC-3’)，ND5R(5’-GCTTACTCGTGGCCTGAGCCGA-3’)；鑒定方法：(1)用上述引物對太湖新銀魚實(shí)驗(yàn)標(biāo)本總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)PCR產(chǎn)物純化、復(fù)制克隆，測序得到ND5基因全序列；(3)將實(shí)驗(yàn)標(biāo)本與相關(guān)近緣物種的ND5基因全序列比對，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)流生物系統(tǒng)樹；(4)如上方法，獲得待測魚類樣本的ND5基因全序列，將該序列加入步驟(3)，重新構(gòu)建檢測流生物系統(tǒng)樹；(5)分析和比較。本發(fā)明用于非形態(tài)學(xué)的準(zhǔn)確地物種鑒定和分類，為該物種的人工養(yǎng)殖，雜交、進(jìn)一步遺傳學(xué)研究提供科學(xué)鑒定依據(jù)。
【專利說明】一種太湖新銀魚物種分子鑒定的引物和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地說，涉及一種太湖新銀魚物 種分子鑒定的引物和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 銀魚（icefishes)是我國一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類。中國有世界17種銀魚中的15種， 其中6種為中國特有種。太湖新銀魚（Neosalanx taihuensi)是種較常見的銀魚，為中國 特有種，屬于銀魚科（Salangidae)新銀魚屬（Neosalanx)。
[0003] 銀魚具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值：每百克鮮銀魚可食部分含蛋白質(zhì)8. 2克， 脂肪〇. 3克，碳水化合物1. 4克，鈣258毫克等。全魚可入藥，其肉性味甘、平，有滋養(yǎng)補(bǔ)腎、 健胃補(bǔ)虛、益肺、利水之功效；可用于治療脾虛泄瀉，營養(yǎng)缺乏，消化不良，小兒瘡積等癥。銀 魚是中國重要的出口水產(chǎn)品之一，遠(yuǎn)銷歐、亞、美各國，在國際市場上被譽(yù)為"軟黃金"。
[0004] 太湖新銀魚的種質(zhì)資源鑒定必要性：中國的銀魚天然資源因圍湖造田、過度捕撈、 環(huán)境污染和生境破碎化等多種因素的影響而持續(xù)衰退，各種銀魚的天然資源都不同程度地 下降，物種分布范圍顯著縮小，個(gè)別物種漸危，太湖新銀魚的產(chǎn)量也逐年下降。因此太湖新 銀魚的種質(zhì)資源鑒定、繁養(yǎng)、雜交以及遺傳多樣性保護(hù)變得十分重要。另一方面，銀魚科 魚類的分類仍存在很多爭議，依據(jù)形態(tài)學(xué)和水域分類的各銀魚科物種的親緣關(guān)系也十分混 舌L。尤其是經(jīng)濟(jì)魚類太湖新銀魚物種與形態(tài)學(xué)相近的大銀魚，近太湖新銀魚及寡齒銀魚的 分類鑒定十分困難，這對特種銀魚養(yǎng)殖，物種雜交，人工選育及遺傳多樣性保護(hù)等生產(chǎn)和科 學(xué)研究帶來諸多不便。因此，利用分子手段鑒定和分類銀魚科物種十分必要，鑒定手段也十 分簡潔和科學(xué)。
[0005] 發(fā)明人曾參與研究發(fā)表的論文《2種銀魚線粒體CO II及側(cè)翼tRNA基因的測定分 析及其親緣關(guān)系研究》，2008年5月第38卷第3期，發(fā)表于《中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)》，探討了 4 種銀魚及香魚線粒體C0 II基因序列變異及它們的親緣關(guān)系，測定和分析銀魚線粒體C0 II 基因全序列及側(cè)翼tRNA基因序列，并與同源序列比較，用NJ法和MP法對其進(jìn)行系統(tǒng)樹重 建，推演物種間的親緣關(guān)系，為銀魚的系統(tǒng)分類尋求分子依據(jù)，論文中所用到的引物為
[0006] YaL(5, -TCAGCCACATAACCGCTCTG-3,）；
[0007] YaR(5' -CTTCTAGGAGGCGGAATTG-3'）和
[0008] YbL(5' -CTGTAATTCTTATCCTCAT-3'）；
[0009] YbR(5' -GCTGGGTTGAGTTGAGGCATG-3'）。
[0010] 但是發(fā)明人后期研究中發(fā)現(xiàn)利用上述引物檢測銀魚線粒體CO II基因從而構(gòu)建生 物系統(tǒng)樹的過程中，引物擴(kuò)增并不是很穩(wěn)定，PCR產(chǎn)物結(jié)果并不足夠精確，要想準(zhǔn)確的鑒定 銀魚種類，需要重新設(shè)計(jì)一種能夠穩(wěn)定擴(kuò)增的引物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 1.發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0012] 本發(fā)明為改善和提高現(xiàn)有銀魚分類和鑒定技術(shù)，提供了一種太湖新銀魚物種分子 鑒定的引物和方法。采用本發(fā)明的技術(shù)方案，通過測定和分析銀魚的線粒體ND5基因序列， 推演物種間的親緣關(guān)系，進(jìn)而獲得其科學(xué)的分類鑒定依據(jù)。
[0013] 2.技術(shù)方案
[0014] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0015] 本發(fā)明的一種太湖新銀魚物種分子鑒定的引物和方法，發(fā)明人選取太湖新銀魚線 粒體ND5基因設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：
[0016] ND5L :5' -CTTGGTGCAAATCCAAGCAGGAAC-3'（SEQ ID NO. 1)
[0017] ND5R :5' -GCTTACTCGTGGCCTGAGCCGA-3'（SEQ ID NO. 2)。
[0018] 利用上述線粒體ND5基因的引物對太湖新銀魚物種分子鑒定的方法，如下述步 驟：
[0019] 步驟一、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)流生物系統(tǒng)樹
[0020] (1)用權(quán)利要求1所述引物對太湖新銀魚實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得 PCR產(chǎn)物；
[0021] (2)將PCR產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體復(fù)制克隆，對菌液進(jìn)行測序，獲得ND5基因全序 列；
[0022] (3)將太湖新銀魚實(shí)驗(yàn)標(biāo)本與相關(guān)近緣物種的ND5基因全序列進(jìn)行比對，利用 MEGA6. 0軟件構(gòu)建NJ法標(biāo)準(zhǔn)流生物系統(tǒng)樹；
[0023] 步驟二、構(gòu)建檢測流生物系統(tǒng)樹
[0024] (4)按照步驟一方法，獲得待測魚類樣本的線粒體ND5基因全序列，將該序列加入 步驟（3)，重新構(gòu)建檢測流生物系統(tǒng)樹；
[0025] (5)分析和比較標(biāo)準(zhǔn)流生物系統(tǒng)樹與檢測流生物系統(tǒng)樹，鑒定待測樣本是否為太 湖新銀魚。
[0026] 優(yōu)選的，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為25 μ 1，模板DNA1 μ 1 (含10?50ng) ;PCR循環(huán)退火 溫度：55°C。
[0027] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的線粒體ND5基因引物是按照如下方法獲得的：
[0028] a，從NCBI獲得太湖新銀魚近緣物種的線粒體全序列3條；利用ClustalXvl. 83做 ND5兩端序列的比對，找出兩端200bp左右的保守區(qū)段，作為引物候選區(qū)；
[0029] b，利用0LIG0 v6軟件對候選區(qū)序列進(jìn)行分析，引物序列選擇條件：選出長度在 20bp左右，GC含量50%左右，軟件預(yù)測的引物退火溫度在50-55攝氏度，引物間不形成發(fā) 卡結(jié)構(gòu)，引物可能擴(kuò)增全序列中其他位置的序列的引物效率低于200。滿足這些要求后，我 們選定1對，上下游引物作為PCR擴(kuò)增的最終引物，即為本發(fā)明的ND5L、ND5R序列。
[0030] 本發(fā)明鑒定方法的原理是：
[0031] 選取太湖新銀魚中進(jìn)化速率適中的線粒體ND5基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲 得的PCR產(chǎn)物純化、轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體復(fù)制克隆，并對菌液進(jìn)行測序，獲得ND5基因全序列；然后 根據(jù)基因序列分析結(jié)果將太湖新銀魚、相關(guān)近緣物種和待測標(biāo)本的基因序列構(gòu)建出生物系 統(tǒng)樹，從而確定待測標(biāo)本是否為太湖新銀魚，與其他銀魚或是太湖新銀魚的親緣關(guān)系。
[0032] 3.有益效果
[0033] 采用本發(fā)明提供的技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下顯著效果：
[0034] (1)本發(fā)明的一種太湖新銀魚物種分子鑒定的引物和方法，與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)相比，分 子鑒定方法科學(xué)、準(zhǔn)確，易于操作，對生物樣本進(jìn)行鑒定具有普遍性，科學(xué)性和可重復(fù)性，快 速測定待測魚類樣本與太湖新銀魚的親緣關(guān)系，為太湖新銀魚的物種間親緣關(guān)系數(shù)據(jù)判定 和資源鑒定、繁養(yǎng)、雜交以及遺傳多樣性保護(hù)提供依據(jù)。
[0035] (2)本發(fā)明的一種太湖新銀魚物種分子鑒定的引物和方法，選取太湖新銀魚的線 粒體ND5基因，與之前發(fā)明人論文里選取的線粒體CO II基因相比，獲得的結(jié)果更為穩(wěn)定，設(shè) 計(jì)的引物PCR，能夠穩(wěn)定擴(kuò)增，PCR為long-PCR，PCR產(chǎn)物精確可靠。
[0036] (3)本發(fā)明的一種太湖新銀魚物種分子鑒定的引物和方法，通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)流生物 系統(tǒng)樹以及增加待測樣品基因重新構(gòu)建生物系統(tǒng)樹的方法，不僅在鑒定和推斷待測物種是 否為太湖新銀魚，與其他銀魚或是太湖新銀魚的親緣關(guān)系方面具有更為精確的優(yōu)勢，還能 夠?qū)τ谌魏我环N未知種屬的銀魚都可以進(jìn)行親緣關(guān)系的重現(xiàn)，并進(jìn)一步用于它們的分類， 適用范圍寬。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明中太湖新銀魚物種分子鑒定方法的流程示意圖；
[0038] 圖2為本發(fā)明中太湖新銀魚物種分子鑒定方法的流程簡圖；
[0039] 圖3為本發(fā)明中實(shí)施例1的生物系統(tǒng)樹構(gòu)建圖。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 為進(jìn)一步了解本發(fā)明的內(nèi)容，結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。
[0041] 實(shí)施例1
[0042] 如圖1所示，本發(fā)明的一種太湖新銀魚物種分子鑒定的方法步驟為：
[0043] 步驟一、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)流生物系統(tǒng)樹
[0044] 獲得太湖新銀魚完整、新鮮個(gè)體樣本，與淮南師范學(xué)院動(dòng)物標(biāo)本室內(nèi)標(biāo)本對比鑒 定，初步確認(rèn)為太湖新銀魚樣本，再依據(jù)太湖新銀魚形態(tài)學(xué)特征（舌部及牙齒數(shù)量和位置， 鰭的位置與鰭條數(shù)），利用解剖鏡和顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，確認(rèn)物種，并將其作為太湖新 銀魚標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)室取標(biāo)本新鮮的肌肉組織，采用SDS/蛋白酶裂解，酚氯仿提取總DNA， 瓊脂糖凝膠電泳檢測，和分光光度計(jì)測定總DNA含量。
[0045] (1)參考近緣物種相關(guān)序列，設(shè)計(jì)太湖新銀魚線粒體ND5基因引物，序列如下：
[0046] ND5L :5' -CTTGGTGCAAATCCAAGCAGGAAC-3'（SEQ ID NO. 1)
[0047] ND5R :5' -GCTTACTCGTGGCCTGAGCCGA-3'（SEQ ID NO. 2)。
[0048] 用上述引物對太湖新銀魚實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；PCR擴(kuò) 增反應(yīng)體積為25 μ 1，模板DNA1 μ 1 (含10?50ng) ;PCR循環(huán)退火溫度：55°C。
[0049] (2)將PCR產(chǎn)物經(jīng)過生物試劑盒純化，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體復(fù)制克隆，對菌液進(jìn)行測序， 具體在本實(shí)施例中，對菌液基因的測序工作交給上海生物公司，獲得ND5基因全序列。
[0050] 太湖新銀魚的ND5基因全序列具體核苷酸如下：1824bp
[0051] //atgtaccccctcaccaccattttaaactcctcgctagtactgatcttcgctcttctcctcttcccct tgttcaccacggc
[0052] taacaaacactgggccctaacgcacgtcaacaccgcaatcaaagccgcattcctcgtcagccttatccc cctctctgttt
[0053] tcctcgactctggggttgaaacagttgtctgtgcctgacaatgaatctgcacccgcacctttgacatta gcatcagcttt
[0054] aaatttgacctttactccctcatcttcacccccgtcgctctttatgtaacatgagcaatcttagaattc gcccgctgata
[0055] tatacatgcagaccccaacatgaaccgattcttcaaatgccttctcctcttcctagtggcaatgattat tatggtaacag
[0056] ccaacaacatgttccaactctttattggctgggaaggcattggtatcatgtcttttctactcatcgact gatgagacggg
[0057] cgagcagatgccggcgccgctgcccttcaggccgtcctatacaaccgagttggagacatcggacttgtt cttagcatagc
[0058] ttgattcgctgtaaatctaaactcttgagacatagagcaaatatctgtgtcttcccaagaccttgacct caccctccccc
[0059] tcataggcctaatcctggcagccactgcaaaatccgcgcaattcggcctccacccctgactccccgcgg ctatagaaggc
[0060] cctactcctgtctccgccctgcttcactccagcacaatggtggtcgcaggagtattccttctagtccgg actagccctat
[0061] aatagaaaacaaccccatagcccttactacctgcttatgcctgggggccctcaccactctctttgccgc cacctgcgctc
[0062] tgacccaaaacgacattaaaaaaatcgtcgccttctccacctcaagccagctcggactaatgatagtcg ctgtcggtctt
[0063] aaccaaccacagctcgctttcctccatatctgcacacacgcatttttcaaagccatactgttcttgtgc tcaggatcaat
[0064] tatccacagcctaaatgatgaacaggacattcggaagatgggaggcctaagcaacctcgcccccttcac ctcctcttgcc
[0065] tcgctatcggcagcctcgccctcacagggacccccttcctggcaggcttcttctcaaaagacgccatca tggaagcttta
[0066] aacacatcttacctgaacgcctgagccctggccctcaccctcctagccacctccttcaccgcaatctat agccttcgtgt
[0067] ggcctactttgtagccatgggccacccccgatccccagccctctcccccatcaacgaaaataacccctg cgttattaacc
[0068] ccattaaacgcctcgccttaggaagcatcattgccggcctcctaatcacctccaacctcctcccctcca aaacccctgtc
[0069] ttaactatgccccccctcctcaaacttagcgcccttgtagtaactgtcatcggccttctcacagcccta gaactcgcctc
[0070] cttgacttccaaacaatttaagacctccccctctctcaccccccacaacttctctaacatgctaggatt tttccccgcaa
[0071] tcatccatcgatcaatcccctactgaagcctcttcctcggacaaacagttgcgagccaaatgcttgaca aaacatgattc
[0072] gagaaagtcggccccaaggcaatatccactatcaacctgcctgcagcttccaccactgccgaccttcac cagggcataat
[0073] caaaacctatctgtccctattccttctgacagtcgtcttggctattatcctgcccctcatctaa// (SEQ ID NO. 3)
[0074] (3)利用生物數(shù)據(jù)庫NCBI獲得相關(guān)近緣物種的對應(yīng)序列，利用生物軟件clusterW 將太湖新銀魚實(shí)驗(yàn)標(biāo)本與相關(guān)近緣物種的ND5基因全序列進(jìn)行比對，基于線粒體ND5基因 核苷酸序列，利用MEGA6. 0軟件構(gòu)建NJ法標(biāo)準(zhǔn)流生物系統(tǒng)樹；確定太湖新銀魚的分類地位。
[0075] 步驟二、構(gòu)建檢測流生物系統(tǒng)樹
[0076] (4)獲得2個(gè)未知銀魚確切物種X和Y的肌肉樣本，按照步驟一方法，分別提取它 們的DNA，利用上述ND5L和ND5R引物擴(kuò)增它們的線粒體ND5基因，測序后獲得2條線粒體 ND5基因全序列。將該序列加入步驟（3)，重新構(gòu)建檢測流生物系統(tǒng)樹，（如圖3所示）。
[0077] (5)分析和比較標(biāo)準(zhǔn)流生物系統(tǒng)樹與檢測流生物系統(tǒng)樹樹形差異，鑒定待測樣本 是否為太湖新銀魚，肌肉樣本X與已知的太湖新銀魚形成一個(gè)單系群，可判斷為太湖新銀 魚，肌肉樣本Y與已知的太湖新銀魚不能形成一個(gè)單系群，不是太湖新銀魚，但是其與大銀 魚形成一個(gè)單系群，為大銀魚。
[0078] 本發(fā)明的一種太湖新銀魚物種分子鑒定方法，太湖新銀魚及其他物種的線粒體 ND5基因均存在物種內(nèi)和種間變異，通過序列比對，檢查突變頻率，可以構(gòu)建生物系統(tǒng)樹，鑒 定物種。且根據(jù)其設(shè)計(jì)的引物ND5L和ND5R較為可靠，能夠在太湖新銀魚及有關(guān)近緣物種 魚類的群體中穩(wěn)定擴(kuò)增，PCR為long-PCR，獲得的PCR產(chǎn)物穩(wěn)定，使得太湖新銀魚的物種鑒 別更精確，且通過生物系統(tǒng)樹的構(gòu)建來確定物種的親緣關(guān)系更加準(zhǔn)確顯而易見。
[0079] 以上示意性的對本發(fā)明及其實(shí)施方式進(jìn)行了描述，該描述沒有限制性，附圖中所 示的也只是本發(fā)明的實(shí)施方式之一，實(shí)際的情況并不局限于此。所以，如果本領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員受其啟示，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造宗旨的情況下，不經(jīng)創(chuàng)造性的設(shè)計(jì)出與該技術(shù)方案 相似的結(jié)構(gòu)方式及實(shí)施例，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種太湖新銀魚物種分子鑒定的引物，其特征在：所述引物序列如下： ND5L ：5, -CTTGGTGCAAATCCAAGCAGGAAC-3, ND5R :5' -GCTTACTCGTGGCCTGAGCCGA-3'。
2. -種太湖新銀魚物種分子鑒定的方法，其特征在于：包括下述步驟： 步驟一、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)流生物系統(tǒng)樹 (1) 用權(quán)利要求1所述引物對太湖新銀魚實(shí)驗(yàn)標(biāo)本總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn) 物； (2) 將PCR產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體復(fù)制克隆，對菌液進(jìn)行測序，獲得ND5基因全序列； (3) 將太湖新銀魚實(shí)驗(yàn)標(biāo)本與相關(guān)近緣物種的ND5基因全序列進(jìn)行比對，利用MEGA6. 0 軟件構(gòu)建NJ法標(biāo)準(zhǔn)流生物系統(tǒng)樹； 步驟二、構(gòu)建檢測流生物系統(tǒng)樹 (4) 按照步驟一方法，獲得待測魚類樣本的線粒體ND5基因全序列，將該序列加入步驟 (3)，重新構(gòu)建檢測流生物系統(tǒng)樹； (5) 分析和比較標(biāo)準(zhǔn)流生物系統(tǒng)樹與檢測流生物系統(tǒng)樹，鑒定待測樣本是否為太湖新 銀魚。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種太湖新銀魚物種分子鑒定的方法，其特征在于：PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體積為25 μ 1，模板DNA1 μ 1，模板DNA含10?50ng ;PCR循環(huán)退火溫度：55°C。
【文檔編號】C12N15/11GK104152451SQ201410409580
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】張際峰, 周杰, 王建超 申請人:淮南師范學(xué)院