一種可用于篩選生豬腸道高粘附能力微生態(tài)制劑的方法
【專利摘要】一種可用于篩選生豬腸道高粘附能力微生態(tài)制劑的方法，是利用恒化器培養(yǎng)豬糞便，挑取粘附于恒化器瓶壁上的微生物，經(jīng)鑒定后評價其對腸上皮細胞HT-29粘附能力的強弱和不同因素（溫度、膽鹽、PH等）對所篩選細菌生長的影響。本發(fā)明的優(yōu)點是：直接以對恒化器瓶壁粘附能力作為篩細指標，針對性強。由于粘附能力是益生菌發(fā)揮作用的關鍵性指標，因此本發(fā)明可用于畜牧和人類微生態(tài)潛在菌株的篩選。
【專利說明】—種可用于篩選生豬腸道高粘附能力微生態(tài)制劑的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及豬糞便中強粘附細菌的篩選及其生長特性的研究，與豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)關系密切，可用于養(yǎng)殖業(yè)飼料的研制和動物疾病的治療。

【背景技術】
[0002]隨著國內(nèi)肉類產(chǎn)品市場供應的相對充足，肉豬的快速生長與肉豬品質(zhì)矛盾凸顯。有效提高產(chǎn)肉效率、改善豬肉品質(zhì)是一項亟待解決的問題。而益生菌則是一類安全、無毒副作用的健康細菌，能抵抗外來病原菌的侵入，提高肉豬的免疫力和營養(yǎng)利用率，用以飼料發(fā)酵可以替代抗生素的使用和催化肉豬生長的藥物的使用，生產(chǎn)安全優(yōu)質(zhì)的肉類產(chǎn)品。
[0003]益生菌發(fā)酵飼料是指在人工控制條件下，有益微生物通過自身的代謝活動將植物性、動物性和礦物質(zhì)中的抗營養(yǎng)因子分解、合成，產(chǎn)生更能被畜禽采食、消化、吸收和無毒害作用的單一飼料。
[0004]在家畜養(yǎng)殖過程中，動物疾病的發(fā)生不可避免的導致抗生素的大量使用，使得藥物殘留極為嚴重，嚴重影響了肉類的品質(zhì)、風味和食用安全性。采用動物腸道內(nèi)益生菌共同研制的飼料能針對不同種類動物生產(chǎn)專一飼料，有效針對不同動物的不同生理狀態(tài)采用不同的特定飼料。細菌的粘附性是益生菌發(fā)酵飼料的一個重要指標。篩選粘附能力強的益生菌參與發(fā)酵能有效的使細菌定植于動物腸道中，抵御外來病原菌的侵入，同時定植后的細菌能參與食物分解，提高飼料的利用率，增加肉豬的產(chǎn)肉率。
[0005]本發(fā)明在豬糞便中強粘附細菌的篩選及其生長特性的研究中，提供了一套從豬糞便中篩選強粘附細菌的方法，并測定了細菌的粘附性、膽鹽耐受、酸堿耐受和抗定植能力等生長特性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對豬糞便中強粘附細菌的的特性從而篩選具有高粘附能力的益生菌。
[0007]本發(fā)明所述制備方法包括下列步驟:
(1)樣品的收集和保存:收集健康豬盲腸中的糞便和腸壁粘膜層物質(zhì)，轉人厭氧環(huán)境，加入甘油，其重量為糞便和甘油總重量的10%，旋渦振蕩器混勻，-80 °C保存；
(2)恒化器的組裝和使用:將儲料罐，發(fā)酵罐，廢液罐，橡膠塞，硅膠管，裝NaOH的玻璃瓶及通氣過濾器按順序連接起來，置于工作臺上，連接混合氣體，蠕動泵，PH調(diào)節(jié)器，磁力攪拌器，廢氣排除裝置；
(3)恒化器內(nèi)培養(yǎng)基的制備:按加入成分占終產(chǎn)物質(zhì)量百分比加入如下成分:5%。可溶性丨疋粉，3%。牛乳釀蛋白，3%。蛋白腺，0.6%。果I父，0.6%。木聚糖，0.6%。阿拉伯半乳聚糖，0.6%。支鏈淀粉，0.4%。半胱氨酸，0.01%。血紅素，0.25%。膽固醇，0.25%。鵝脫氧膽酸，0.25%。膽酸，2%。磷酸二氫鉀，10%。磷酸氫二鉀，4.5%。氯化鈉，0.5%。七水硫酸鎂，0.45%0二水氯化鈣，培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后用蠕動泵泵入儲料罐內(nèi)；(4)待恒化器穩(wěn)定后，在培養(yǎng)基中接種步驟(1)中得到的-80°C保存的豬糞便樣品或腸粘膜層，其重量為培養(yǎng)基和豬糞便或培養(yǎng)基和腸粘膜層總重量的10%，連續(xù)培養(yǎng)8-16天后得到的的培養(yǎng)物即為健康人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)；
(5)刮取恒化器瓶壁上的物質(zhì)，利用活菌技術方法分離微生物并鑒定；鑒定出的微生物利用細胞粘附試驗和益生菌評價指標評價其益生效果。
[0008]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明直接以對恒化器瓶壁粘附能力作為篩細指標，針對性強，由于粘附能力是益生菌發(fā)揮作用的關鍵性指標，因此本發(fā)明可用于畜牧和人類微生態(tài)潛在菌株的篩選，該方法簡單、快捷。
[0009]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1腸道微生物粘附性能力測定；圖2-1腸道微生物酸堿耐受性2h ；
圖2-2腸道微生物酸堿耐受性4h ;圖3-1腸道微生物膽鹽耐受性24h ；
圖3-2腸道微生物膽鹽耐受性4h。

【具體實施方式】
[0011]實施例1:
豬糞便中強粘附細菌的篩選及鑒定:
1、樣品的收集和保存:收集健康豬盲腸中的糞便和腸壁粘膜層物質(zhì)，轉人厭氧環(huán)境，加入甘油，其重量為糞便和甘油總重量的10%，旋渦振蕩器混勻，-80 °C保存；
2、恒化器的組裝和使用:將儲料罐，發(fā)酵罐，廢液罐，橡膠塞，硅膠管，裝NaOH的玻璃瓶及通氣過濾器按順序連接起來，置于工作臺上，連接混合氣體，蠕動泵，PH調(diào)節(jié)器，磁力攪拌器，廢氣排除裝置；
3、恒化器內(nèi)培養(yǎng)基的制備:按加入成分占終產(chǎn)物質(zhì)量百分比加入如下成分:5%?？扇苄载夥?，3%。牛乳釀蛋白，3%。蛋白腺，0.6%。果I父，0.6%。木聚糖，0.6%。阿拉伯半乳聚糖，
0.6 %。支鏈淀粉，0.4 %。半胱氨酸，0.0I %。血紅素，0.25 %。膽固醇，0.25 %。鵝脫氧膽酸，
0.25%。膽酸，2%。磷酸二氫鉀，10%。磷酸氫二鉀，4.5%。氯化鈉，0.5%。七水硫酸鎂，0.45%。二水氯化鈣，培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后用蠕動泵泵入儲料罐內(nèi)；
4、待恒化器穩(wěn)定后，按重量比接種10%在-801:保存的豬糞便樣品和腸粘膜層，連續(xù)培養(yǎng)8-16天后得到的的培養(yǎng)物即為健康人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)。
[0012]實施例2:篩選菌株的鑒定
刮取恒化器瓶壁上的物質(zhì)，利用活菌計數(shù)方法分離微生物并送測序公司進行鑒定，鑒定結果見表1，共分離得到3株微生物，其分別為植物乳酸桿菌WCFSlLactobacillusplantarum,基因序列號為NR_076229.1 ;羅伊乳酸桿菌Lactobacillus reuteri,基因序列號為EF421935.1 ;幾腸球菌Enterococcus faecalis,基因序列號為AY735444.1。上述三種益生菌均可從從公共機構如獲得，且其基因序列均可從公共數(shù)據(jù)庫NCBI獲得。
[0013]實施例3:篩選菌株益生特性評價
1.粘附性強弱測定:用10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HT-29細胞，鋪滿后，加入篩選的三 f中細菌 Zae tobaciIlus plan tarum.、Lac tobaciIlus reu ter1、En terococcusfaecal is Λ綠2小時后計算每100個細胞上細菌的數(shù)目；
3.酸堿耐受測定:配制MRS培養(yǎng)基，設置PH為1.5 ,2.5,3.5,4.5,7.0五個梯度，分別接種1%三種菌液，過夜培養(yǎng)后進行活菌計數(shù)；
4.膽鹽耐受測定:配制MRS培養(yǎng)基，設置膽鹽濃度為O，0.10%, 0.30%, 0.50%四個梯度，分別接種1%三種菌液，過夜培養(yǎng)后進行活菌計數(shù)。
[0014]5.腸道微生物粘附性能力測定結果如圖1所示，ZactobaciIlus plantarum.、Lactobacillus reu teri, En terococcus faecalis 三種菌在 HT-29 細胞表面的粘附效果以Lactobacillus plantarumLactobacillus reuter1、故之，Enterococcus faecalis
最弱；腸道微生物酸堿耐受性強弱如圖2-1，2-2所示，在2 h階段，三種菌對酸堿耐受性，相差不大；在 4 h 后，PH=L 5 時，Lactobacillus plantarum，Lactobacillus reuteri 有所減少，但是總體變化不大。說明，三種菌酸堿耐受性較強；腸道微生物膽鹽耐受性強弱如圖3-1，3-2所示，4h階段時，在膽鹽濃度為O和0.10%時，Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuter1.、Enterococcus /aeca/is三種菌生長態(tài)勢良好,但是在膽鹽濃度為0.30%和0.50%,三種菌幾乎不生長。24時候，膽鹽濃度為0.30%時，三種菌再次生長，但數(shù)量較低；膽鹽濃度為0.50%沒有長菌。說明三種菌對0.10%濃度的膽鹽耐受，對0.30%濃度的膽鹽也具有一定的耐受性，但對菌的生長有一定影響，但三種菌對0.50%濃度的膽鹽均不具有耐受性。
【權利要求】
1.一種可用于篩選生豬腸道高粘附能力微生態(tài)制劑的方法，其特征是: (1)樣品的收集和保存:收集健康豬盲腸中的糞便和腸壁粘膜層物質(zhì)，轉人厭氧環(huán)境，加入甘油，其重量為糞便和甘油總重量的10%，旋渦振蕩器混勻，-80 °C保存； (2)恒化器的組裝和使用:將儲料罐，發(fā)酵罐，廢液罐，橡膠塞，硅膠管，裝NaOH的玻璃瓶及通氣過濾器按順序連接起來，置于工作臺上，連接混合氣體，蠕動泵，PH調(diào)節(jié)器，磁力攪拌器，廢氣排除裝置； (3)恒化器內(nèi)培養(yǎng)基的制備:按加入成分占終產(chǎn)物質(zhì)量百分比加入如下成分:5%?？扇苄载夥?，3%。牛乳釀蛋白，3%。蛋白腺，0.6%。果I父，0.6%。木聚糖，0.6%。阿拉伯半乳聚糖，0.6%。支鏈淀粉，0.4%。半胱氨酸，0.01 %。血紅素，0.25%。膽固醇，0.25%。鵝脫氧膽酸，.0.25%。膽酸，2%。磷酸二氫鉀，10%。磷酸氫二鉀，4.5%。氯化鈉，0.5%。七水硫酸鎂，0.45%0二水氯化鈣，培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后用蠕動泵泵入儲料罐內(nèi)； (4)待恒化器穩(wěn)定后，在培養(yǎng)基中接種步驟(1)中得到的-80°C保存的豬糞便樣品或腸粘膜層，其重量為培養(yǎng)基和豬糞便或培養(yǎng)基和腸粘膜層總重量的10%，連續(xù)培養(yǎng)8-16天后得到的的培養(yǎng)物即為健康人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)； (5)刮取恒化器瓶壁上的物質(zhì)，利用活菌技術方法分離微生物并鑒定；鑒定出的微生物利用細胞粘附試驗和益生菌評價指標評價其益生效果。
【文檔編號】C12R1/25GK104164396SQ201410403216
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權日:2014年8月15日
【發(fā)明者】陳廷濤, 王鑫, 辛洪波 申請人:南昌大學