OsMSH4蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物花粉育性中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種OsMSH4蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物花粉育性中的應用。本發(fā)明所提供的應用具體為由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(OsMSH4蛋白)或其編碼基因(OsMSH4基因)在調(diào)控植物花粉育性中的應用。實驗證明，在水稻的發(fā)育過程中，通過RNA干擾技術將水稻中OsMSH4蛋白表達水平下調(diào)，可導致水稻表現(xiàn)出與野生型水稻種子相比，花粉育性降低。結(jié)合采用組織特異性抑制基因表達的方法，OsMSH4基因可以用于水稻雜交種子生產(chǎn)和育性控制，因此本發(fā)明在水稻育種上具有重要意義，可以為增加水稻產(chǎn)量、提高水稻品質(zhì)提供重要生物資源。
【專利說明】0sMSH4蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物花粉育性中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子生物學【技術領域】，涉及一種水稻〇sMSH4蛋白及其編碼基因 在調(diào)控水稻花粉育性中的應用。

【背景技術】
[0002] 水稻是人類最重要的糧食作物之一，世界上近一半的人口，包括東亞和東南亞的 絕大部分人口，都以大米為食。水稻更是我國的第一大糧食作物，因此如何提高水稻的產(chǎn)量 是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的關鍵問題。從二十世紀六十年代開始，隨著半矮品種的推廣，水稻和小 麥的產(chǎn)量得到了突破性的增長。在推廣綠色革命的11個國家中，水稻單產(chǎn)80年代末比70 年代初提高了 63%。因此，這次矮化育種被稱為近代谷物生產(chǎn)的一次"綠色革命"。在我國， 二十世紀七十年代由袁隆平研究出的三系法雜交水稻也是"綠色革命"杰出代表。雜交水稻 的推廣極大的提高了水稻的單產(chǎn)，緩解了我國人口迅速增長與糧食短缺的矛盾。三系法雜 交水稻中的三系是指雄性不育系，保持系和恢復系。水稻雄性不育系是雜交水稻制種的關 鍵，不育系水稻雌蕊發(fā)育正常，但本身沒有花粉或者花粉敗育，即不能正常的自交結(jié)實。將 恢復系的花粉授給不育系植株即可生產(chǎn)出雜交種子。雜交種后代雄蕊育性恢復正常，可以 自交結(jié)實。選育出有增產(chǎn)優(yōu)勢或品質(zhì)優(yōu)良的雜交種即可用于大規(guī)模生產(chǎn)。保持系水稻雌雄 蕊都正常，用它的花粉給不育系授粉，最終仍然得到雄性不育的植株，從而保證了不育系的 繁殖。
[0003] 雖然，雄性不育系的利用在雜交水稻的制備和選育過程中起到了至關重要的作 用，但是自然界里的自發(fā)雄性不育植株極少，鑒定困難，需耗費大量人力物力。因此，通過基 因工程途徑獲得雄性不育水稻成為一個上好的選擇。水稻花粉形成的過程也就是雄配子體 的發(fā)生過程。植物雄配子體花粉的形成包括小孢子的發(fā)生和雄配子的形成兩個過程。小孢 子的發(fā)生這一過程都在幼小的花藥中進行，包括小孢子母細胞的形成，減數(shù)分裂過程以及 四分體的分散過程。雄配子體即花粉粒是小孢子經(jīng)過兩次有絲分裂形成的，其中包含被稱 作雄配子的精細胞。在花粉發(fā)育的這一系列過程中涉及到眾多相關基因，只有他們按照一 定的時空順序正常表達，才能保證可育花粉的形成。
[0004] 通常生物的生活周期由二倍體時期與單倍體時期的交替組成。二倍體細胞經(jīng)由減 數(shù)分裂進程形成染色體數(shù)目減半的單倍體細胞即雌雄配子或卵細胞和精子；而單倍體的細 胞通過受精作用，也就是核融合形成新的二倍體細胞。減數(shù)分裂在整個生活周期中起著至 關重要的作用，使每種生物代代都能夠保持二倍體的染色體數(shù)目。在減數(shù)分裂過程中，同源 染色體間通過重組發(fā)生部分交換產(chǎn)生交叉，結(jié)果使配子的遺傳基礎多樣化，使后代對環(huán)境 條件的變化有更大的適應性，促進了生物物種的進化。早在19世紀，生物學家們根據(jù)對不 同生物的研究提出了一系列重要成果。孟德爾通過對豌豆的觀察，提出了遺傳學的兩個基 本定律-分離定律和自由組合定律。而摩爾根則是以果蠅為模式生物闡明了遺傳學的第三 大定律-連鎖交換定律。在這些發(fā)現(xiàn)中，模式生物都起到了重要作用。水稻不但是重要的 糧食作物，也是單子葉植物研究中的模式生物。近些年來，科學家以水稻為研究對象對減數(shù) 分裂過程進行了研究，獲得了許多控制減數(shù)分裂的基因。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種水稻0sMSH4蛋白及其編碼基因在調(diào)控水稻花粉育性中 的應用。
[0006] 本發(fā)明所提供的應用，具體為由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì) (命名為0sMSH4蛋白）或其編碼基因（命名為0sMSH4基因）在調(diào)控植物花粉育性中的應 用。
[0007] 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)（0sMSH4蛋白）或其編碼基因 (0sMSH4基因）在培育花粉育性降低的植物品種中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0008] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種培育花粉育性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0009] 本發(fā)明所提供的培育花粉育性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟： [0010] a)在目的植物中對由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基 因進行抑制表達，得到轉(zhuǎn)基因植物；
[0011] b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，花粉育性降低的轉(zhuǎn)基 因植物。
[0012] 在本發(fā)明中，所述花粉育性的降低，除了花粉形態(tài)學外，還體現(xiàn)為減數(shù)分裂過程中 所形成的交叉的數(shù)目越少。
[0013] 在上述應用或方法中，所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì) (0sMSH4蛋白）的編碼基因（0sMSH4基因）是如下（1)至（4)中任一所述的DNA分子：
[0014] (1)序列表中序列2的第137-2533位所示的DNA分子；
[0015] ⑵序列表中序列2所示的DNA分子；
[0016] (3)在嚴格條件下與（1)或⑵所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列1 所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0017] (4)與⑴或（2)或⑶所限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表 中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0018] 上述嚴格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0· 1 % SDS 和 1 X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0019] 其中，序列2由2853個核苷酸組成，其中第137-2533位為所述0sMSH4基因的編 碼序列（0RF);序列2的0RF編碼序列表中序列1所示的蛋白質(zhì)，序列1由798個氨基酸殘 基組成。
[0020] 在上述方法中，所述在目的植物中對由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)的編碼基因進行抑制表達，可為任何可降低所述目的植物中所述0sMSH4基因的表 達的方法。
[0021] 在本發(fā)明中，所述在目的植物中對由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋 白質(zhì)的編碼基因進行抑制表達，具體是通過將如下式（I)所示的DNA片段轉(zhuǎn)入所述目的植 物中實現(xiàn)的：
[0022] SEQ反向-X_SEQm ⑴
[0023] 所述SEQM是序列表中序列3的第666-1079位核苷酸；
[0024] 所述SEQ_的序列與所述SEQtt的序列反向互補；
[0025] 所述X是所述SEQ^g與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ 正向及所述SEQ反向均不互補。
[0026] 在本發(fā)明中，所述式（I)所示的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中的序列3 的第19-1079位。
[0027] 序列3由1097個核苷酸組成。其中，第666-1079位為所述0sMSH4基因的一個片 段的正向序列（對應上述式（I)中的，與序列表中序列2的第698-1111位一致），第 433-665位（第450-648位為GA20內(nèi)含子核苷酸序列）對應上述式（I)中的X，第19-432 位為所述0sMSH4基因的一個片段的反向序列（對應上述式（I)中的SEQ &@，為序列表中序 列2的第698-1111位的反向互補序列）。
[0028] 進一步，所述式（I)所示的DNA片段是通過RNA干擾表達載體的形式轉(zhuǎn)入所述目 的植物中的；所述RNA干擾表達載體上啟動所述式（I)所示的DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動子是 Actin啟動子。具體的，所述RNA干擾表達載體為在pCAMBIA2300-Actin載體的多克隆位 點處插入所述0sMSH4基因的RNA干擾序列（序列3)后得到的重組質(zhì)粒；更為具體的，所述 RNA干擾表達載體是按照包括如下步驟的方法制備得到的：用Pst I酶切序列表中序列3所 示的DNA片段，膠回收后與經(jīng)過Pst I酶切的pCAMBIA2300-Actin載體骨架大片段相連，得 到所述RNA干擾表達載體。
[0029] 在上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，將攜帶有所述0sMSH4基因的所述重組表達載 體或所述0sMSH4基因的所述RNA干擾表達載體導入所述目的植物，具體可為：通過使用Ti 質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方 法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0030] 在上述各應用或各方法中，所述植物即可為單子葉植物，也可為雙子葉植物。在本 發(fā)明中，所述植物具體為單子葉植物水稻，如粳稻品種鹽稻8號。
[0031] 如下式（I)所示的DNA片段也屬于本發(fā)明的保護范圍：
[0032] SEQ 反向-X_SEQm ⑴
[0033] 所述SEQM是序列表中序列3的第666-1079位核苷酸；
[0034] 所述SEQ_的序列與所述SEQtt的序列反向互補；
[0035] 所述X是所述SEQ^g與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ 正向及所述SEQ反向均不互補；
[0036] 所述DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中的序列3的第19-1079位。
[0037] 含有所述DNA片段的重組載體、重組菌、表達盒或轉(zhuǎn)基因細胞系也屬于本發(fā)明的 保護范圍。
[0038] 所述重組載體既可以為重組表達載體，也可以為重組克隆載體。在本發(fā)明的一個 實施例中，所述重組表達載體中啟動所述RNA干擾序列轉(zhuǎn)錄的啟動子為Actin啟動子，具 體的，所述重組表達載體為在pCAMBIA2300-Actin載體的多克隆位點處插入所述0sMSH4 基因的RNA干擾序列（序列3)后得到的重組質(zhì)粒；更為具體的，所述RNA干擾表達載體 為在pCAMBIA2300-Actin載體的多克隆位點處插入所述0sMSH4基因的RNA干擾序列（序 列3)后得到的重組質(zhì)粒；更為具體的，所述重組表達載體是按照包括如下步驟的方法制 備得到的：用Pst I酶切序列表中序列3所示的DNA片段，膠回收后與經(jīng)過Pst I酶切的 pCAMBIA2300-Actin載體骨架大片段相連，得到所述RNA干擾表達載體。
[0039] 實驗證明，在水稻的發(fā)育過程中，通過RNA干擾技術將水稻中0sMSH4基因的表達 水平下調(diào)，可導致水稻表現(xiàn)出與野生型水稻種子相比，花粉育性降低。結(jié)合采用組織特異性 抑制基因表達的方法，0sMSH4基因可以用于水稻雜交種子生產(chǎn)和育性控制，因此本發(fā)明在 水稻育種上具有重要意義，可以為增加水稻產(chǎn)量、提高水稻品質(zhì)提供重要生物資源。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1為突變體0smsh4表型分析。其中，A為抽穗期的野生型植株（左）和抽穗期 的0smsh4植株（右）；B為野生型的穗子（左）和突變體的穗子（右）；C為野生型花粉；D 為突變體的不育花粉。標尺長度，C和D中50 μ m。
[0041] 圖2為0sMSH4基因結(jié)構(gòu)圖。
[0042] 圖3為0sMSH4基因的組織特異性表達分析。
[0043] 圖4為野生型中秈3037的減數(shù)分裂時期表型。其中，A為粗線期；B為終變期；C 為中期I;D為后期I。標尺長度,5μηι。
[0044] 圖5為突變體0smsh4的減數(shù)分裂時期表型。其中，Α為粗線期；Β為終變期；C為 中期I，無二價體；D為中期1，2個二價體；E為中期1，3個二價體；F為后期I。標尺長度， 5 μ m〇
[0045] 圖6為野生型和突變體0smsh4交叉數(shù)目統(tǒng)計。其中，A為野生型中期I時交叉數(shù) 目；B為突變體0smsh4中期I時交叉數(shù)目。
[0046] 圖7為0sMSH4基因 RNAi水稻植株的PCR鑒定結(jié)果。其中，泳道Μ為DNA分子量 標注，各條帶由大到小依次為 5000bp、3000bp、2000bp、lOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp ; 其余條帶為供試植株，擴增出588bp目的條帶的株系為陽性株系。
[0047] 圖8為0sMSH4基因 RNAi水稻植株的熒光定量PCR鑒定結(jié)果。
[0048] 圖9為野生型和0sMSH4基因 RNAi水稻植株的花粉育性表型鑒定結(jié)果。
[0049] 圖10為突變體0smsh4與0sMSH4基因 RNAi水稻中期I的染色體表型。其中，A為 突變體0smsh4中期I ;B為0sMSH4基因 RNAi水稻中期I。

【具體實施方式】
[0050] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0051] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0052] pUCCRNAi 載體：參見 "Hengxiu Yu，Mo Wang，Ding Tang et al. 0sSP011-l is essential for both homologous chromosome pairing and crossover formation in rice. Chromosoma· 2010 (119) :625-636. " 一文，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研 究所獲得。
[0053] pCAMBIA2300_Actin 載體：參見 "Hengxiu Yu，Mo Wang，Ding Tang et al.0sSP011-l is essential for both homologous chromosome pairing and crossover formation in rice. Chromosoma· 2010 (119) :625-636. "一文，公眾可從中國科學院遺傳與 發(fā)育生物學研究所獲得。
[0054] PMD18-T載體：北京華奧正生科技有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為6011。
[0055] 水稻品種中秈 3037 :記載于"聽1叩，1(.，13叩，0.，!1〇1^，1^，父11，1.，!1皿叩，]\，1^，]\1 ,Gu, M. , Xue, Y. and Cheng, Z. (2010)DEP and AFO Regulate Reproductive Habit in Rice. Plos Genetics, 6"一文中的"Zhongxian 3037"，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研 究所獲得。
[0056] 粳稻品種鹽稻8號：常規(guī)的水稻栽培品種，可以從江蘇省鹽城市明天種業(yè)科技有 限公司購買。
[0057] 水稻品種日本晴：中國農(nóng)科院作物科學研究所水稻種質(zhì)資源中心保藏，庫編號 I1A13071。
[0058] 實施例1、0sMSH4基因的圖位克隆及其組織特異性表達分析
[0059] 一、突變體表型分析
[0060] 本發(fā)明的發(fā)明人在6°Co輻射誘導后的水稻品種中秈3037中發(fā)現(xiàn)一株不育突變體， 與野生型的中秈3037植株相比，突變體在營養(yǎng)生長及開花時間等方面均無明顯差異（圖1 中A)。抽穗以后突變體才表現(xiàn)出典型的不育表型且最終不結(jié)實（圖1中B)。野生型植株的 成熟花藥為黃色，花藥中充滿花粉，花粉用Ι 2_ΚΙ染色可變?yōu)樗{色，而突變體的成熟花藥表 現(xiàn)為白色，花粉用Ι2_ΚΙ染色不會變藍，且呈現(xiàn)典型不育花粉特征（圖1中C和D)。本發(fā)明 的發(fā)明人將突變體授予野生型的花粉，發(fā)現(xiàn)它仍然不能正常結(jié)實，表明突變體雌性也不育， 說明該基因的突變不僅影響雄育性，還影響雌育性。
[0061] 二、突變性狀的遺傳分析
[0062] 為了研究該不育突變的遺傳行為，本發(fā)明的發(fā)明人在分離出不育突變體的株系 中，按單株收獲可育植株的種子，并將這些種子按單株進行種植。對再次分尚出不育突變體 的株系中的可育株與不育株的數(shù)目進行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，在98株的株系群體中，正常表型株為 73株，不育株為25株，卡方測驗表明分離比符合3:1的分離（X 2 = 0.22 ;Ρ>0. 05)，說明不 育表型是由隱性單基因控制的。
[0063] 三、突變基因的圖位克隆
[0064] 為了克隆這個控制不育表型的基因，本發(fā)明的發(fā)明人采取了圖位克隆的方法。由 于這個突變體是雌雄均不育的，所以選取了分離株系中的6株正常植株（理論上包含ΑΑ和 Aa)與粳稻品種中花11進行雜交，在F2和F3群體中，共獲得732株不育株以用于圖位克隆。 利用已有的STS標記，將該基因初步定位在7號染色體的長臂上。通過比較粳稻與秈稻的 序列差異，本發(fā)明的發(fā)明人在此范圍內(nèi)又發(fā)展了 STS分子標記（表1)，最終將基因定位在兩 個STS分子標記（P4和P5)之間的110Kb范圍內(nèi)。利用RGP網(wǎng)站（http://rgp.dna. affrc. go. jp)上的 RiceGAAS(Rice Genome Automated Annotation System)系統(tǒng)進行基因預測， 最終在這個范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個預測為含有mutS家族結(jié)構(gòu)域IV的蛋白。將相應的候選基因命 名為0sMSH4,該突變體命名為0smsh4。水稻基因組注解數(shù)據(jù)庫RiceGAAS信息表明，該基因 的全基因組長9995bp，含有24個外顯子和23個內(nèi)含子（圖2)。本發(fā)明的發(fā)明人對突變體 和野生型中的該候選基因（0sMSH4基因）的全長cDNA都進行了擴增并測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生 型中的0sMSH4基因的全長cDNA的序列如序列表中序列2所示（編碼序列表中序列1所示 的0sMSH4蛋白），而在突變體中發(fā)現(xiàn)一個G到A的轉(zhuǎn)換（序列2的第708位的G突變?yōu)榱?A)，導致編碼色氨酸Trp的TGG被終止密碼子TAG替換，使該蛋白的翻譯提前終止。因此， 可以推斷可能是功能蛋白的缺失導致了突變體不育的表型。
[0065] 表1圖位克隆使用的STS引物
[0066]

【權利要求】
1. 由序列表中序列1所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)或其編碼基因在調(diào)控植物花粉 育性中的應用。
2. 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或其編碼基因在選育花粉育性 降低的植物品種中的應用。
3. 培育花粉育性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟： a) 在目的植物中對由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因進 行抑制表達，得到轉(zhuǎn)基因植物； b) 從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，花粉育性降低的轉(zhuǎn)基因植 物。
4. 根據(jù)權利要求1-3中任一所述的應用或方法，其特征在于：所述由序列表中序列1 所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是如下（1)至（4)中任一所述的DNA分子： (1) 序列表中序列2的第137-2533位所示的DNA分子； (2) 序列表中序列2所示的DNA分子 (3) 在嚴格條件下與⑴或⑵所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列1所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子； (4) 與（1)或⑵或（3)所限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序 列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
5. 根據(jù)權利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述在目的植物中對由序列表中序 列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因進行抑制表達，是通過將如下式（I)所示 的DNA片段轉(zhuǎn)入所述目的植物中實現(xiàn)的： SEQ 反向-X-SEQm ⑴ 所述SEQ￠?是序列表中序列3的第666-1079位核苷酸； 所述SEQ_的序列與所述SEQM的序列反向互補； 所述X是所述SEQ^g與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQf向及 所述SEQ&^)均不互補。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于：所述式（I)所示的DNA片段的核苷酸序 列為序列表中的序列3的第19-1079位。
7. 根據(jù)權利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述式（I)所示的DNA片段是 通過RNA干擾表達載體的形式轉(zhuǎn)入所述目的植物中的；所述RNA干擾表達載體上啟動所述 式（I)所示的DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動子是Actin啟動子。
8. 根據(jù)權利要求1-7中任一所述的應用或方法，其特征在于：所述植物為單子葉植物 或雙子葉植物。
9. 如下式⑴所示的DNA片段： SEQ 反向-X-SEQm (I) 所述SEQ￠?是序列表中序列3的第666-1079位核苷酸； 所述SEQ_的序列與所述SEQM的序列反向互補； 所述X是所述SEQ^g與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQf向及 所述SEQ&^)均不互補； 所述DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中的序列3的第19-1079位。
10.含有權利要求9所述DNA片段的重組載體、重組菌、表達盒或轉(zhuǎn)基因細胞系。
【文檔編號】C12N1/19GK104193810SQ201410397435
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權日:2014年8月13日
【發(fā)明者】程祝寬, 張蕾, 唐丁, 李亞非, 沈懿, 杜桂杰 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所