豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白共表達(dá)載體及其構(gòu)建和表達(dá)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白共表達(dá)載體及其構(gòu)建和表達(dá)方法，所述的共表達(dá)載體基于分子克隆技術(shù)將豬瘟病毒的主要囊膜蛋白(E2c)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2-3c)及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白(E2b)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2-3b)的編碼基因分別與雙表達(dá)載體pETDuet-1、pRSFDuet-1連接。本發(fā)明的共表達(dá)載體能夠同時(shí)表達(dá)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，可用于制備多價(jià)亞單位疫苗、防控豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒。
【專利說明】豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋 白共表達(dá)載體及其構(gòu)建和表達(dá)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白共 表達(dá)載體，屬于生物基因工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬癌（Classical swine fever，CSF)是由豬癌病毒（Classical swine fever virus，CSFV)引起豬的一種高度接觸性、致死性的傳染病，臨床上以發(fā)病急、高熱稽留、全身 泛發(fā)性點(diǎn)狀出血和脾梗死為主要特征，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，豬 瘟在亞洲、歐洲、南美洲等地區(qū)呈現(xiàn)復(fù)發(fā)的趨勢，其流行趨勢發(fā)生了很大的變化，呈現(xiàn)典型 豬瘟和非典型豬瘟共存，隱性感染和持續(xù)感染并現(xiàn)，以及豬瘟疫苗免疫失敗的現(xiàn)象。牛病毒 性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV)與豬癌病毒同屬黃病毒科、癌病毒屬成 員。BVDV不僅感染牛，而且能感染豬、綿羊、山羊及野生動物，很多國家地區(qū)的研究證實(shí)了 BVDV在豬群中存在不同程度的感染。豬感染BVDV可出現(xiàn)類似豬瘟的臨床癥狀和病理變化， 導(dǎo)致繁殖障礙、產(chǎn)仔數(shù)下降和流產(chǎn)。此外，先天性感染的仔豬出生后還可能形成持續(xù)感染和 免疫耐受，并長期帶毒。
[0003] 目前，世界各國主要推廣使用的豬瘟疫苗為弱毒疫苗，這種疫苗存在安全性不高， 無法區(qū)分野毒感染和免疫接種，以及弱毒疫苗返強(qiáng)等缺陷。當(dāng)前控制BVDV感染的手段為傳 統(tǒng)的滅活疫苗和基因修飾弱毒疫苗接種，但滅活疫苗只能起到部分保護(hù)，而BVDV基因修飾 弱毒疫苗會抑制機(jī)體淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活性，產(chǎn)生免疫抑制，增強(qiáng)其他病毒的致病 力。此外，在CSFV和BVDV弱毒疫苗的生產(chǎn)過程中，使用BVDV污染的血清，造成了疫苗的污 染更增加了病毒的潛在傳播。
[0004] 近年來，本領(lǐng)域也開始嘗試使用病毒活載體疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗等新型 疫苗，但這類疫苗無法避免使用過程中基因重組的問題，導(dǎo)致其防治效果不穩(wěn)定。
[0005] 因此本領(lǐng)域亟待發(fā)明一種可以長期使用而不產(chǎn)生毒力返強(qiáng)，培養(yǎng)生產(chǎn)過程中避免 使用血清，并且能有效預(yù)防和控制豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒感染的多價(jià)亞單位疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)的需要，本發(fā)明公開了一種豬癌病毒（Classical swine fever virus，CSFV)和牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV)的主要囊膜蛋 白（E2)和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2-3)共表達(dá)載體，能夠在宿主菌中同時(shí)表達(dá)CSFV主要囊膜蛋白 (E2 C)和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2-3J及BVDV主要囊膜蛋白（E2b)和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2-3b)，并且蛋 白的免疫原性不受破壞和改變。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白共表達(dá)載體，是在 同一宿主菌中表達(dá)的雙表達(dá)載體pETDuet-1、pRSFDuet-Ι，二者分別連接有豬瘟病毒的 主要囊膜蛋白E2。和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白E2b和非結(jié) 構(gòu)蛋白NS2-3b的編碼基因，雙表達(dá)載體與編碼基因的連接關(guān)系為ρΕΤ0ικ^-Ε2ε-Ν52-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b。
[0009] 本發(fā)明所用的載體pETDuet-1、pRSFDuet-1是雙表達(dá)載體，每一個載體上有兩個 啟動子，屬于單一載體雙啟動子系統(tǒng)，每一個蛋白的編碼基因都有獨(dú)立的一個啟動子，每個 啟動子獨(dú)立驅(qū)動外源蛋白的表達(dá)。
[0010] 與傳統(tǒng)的構(gòu)建融合基因相比，本發(fā)明的雙表達(dá)載體避免了基因之間的相互影響， 保證了蛋白穩(wěn)定表達(dá)，克服了串聯(lián)表達(dá)表達(dá)量不足的缺點(diǎn)。并且通過在同一宿主菌中表達(dá) 的雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι作為復(fù)制子相同不相容的兩個質(zhì)粒，在Amp 和Kana兩種抗生素存在的壓力下子代菌能夠有效存活，不會被抗生素殺死，從而可以同時(shí) 轉(zhuǎn)化進(jìn)入同一宿主菌后有效的表達(dá)外源基因。
[0011]為了便于規(guī)?；a(chǎn)，降低培養(yǎng)難度，本發(fā)明所用的宿主菌為大腸桿菌，其培養(yǎng)簡 單，可以采用發(fā)酵罐實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，從而有效控制質(zhì)量，保證疫苗生產(chǎn)的安全性和有效 性。
[0012] 常規(guī)的生物工程中所用的大腸桿菌均可用于本發(fā)明，包括大腸桿菌BL21(DE3)，和 BL21(DE3)PLySs 等。
[0013] 相應(yīng)的，本發(fā)明公開了上述共表達(dá)載體的構(gòu)建方法，通過將豬瘟病毒的主要囊 膜蛋白E2。和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白E2 b和非結(jié)構(gòu)蛋白 NS2-3d^編碼基因連接到雙表達(dá)載體pETDuet-UpRSFDuet-Ι中，具體的制備過程包括下述 步驟：
[0014] 1)擴(kuò)增豬瘟病毒的主要囊膜蛋白E2。和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒 的主要囊膜蛋白E2 b和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3b的編碼基因；
[0015] 2)利用 Nde I 酶切 pETDuet-1、pRSFDuet-Ι 和 pET-32a (+)載體，將酶切后的 pETDuet-UpRSFDuet-Ι分別與pET-32a(+)載體酶切回收后的Trx-tag序列片段連接得到 改造后的pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι載體；
[0016] 3)將改造后的pETDuet-1、pRSFDuet-Ι載體分別進(jìn)行EcoR I、Pst I雙酶切和 Pst I、Hind III雙酶切，豬瘟病毒的主要囊膜蛋白E2。編碼基因用EcoR I、Pst I雙酶 切，牛粘膜病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3b編碼基因用Pst I、Hind III雙酶切；將雙酶切之 后的pETDuet-1、pRSFDuet-Ι載體分別與雙酶切后的豬瘟病毒主要囊膜蛋白E2。編碼基 因、牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3 b編碼基因連接得到表達(dá)載體pETDuet-l-E2。和 pRSFDuet-l-NS2-3b；
[0017] 4)對步驟3)所得表達(dá)載體pETDuet-l-E2。進(jìn)行Bglll、Xho I雙酶切，表達(dá)載體 pRSFDuet-l-NS2-3b進(jìn)行Nae I、Xho I雙酶切，同時(shí)用Bgl II、Xho I雙酶切豬瘟病毒非結(jié) 構(gòu)蛋白NS2-3。編碼基因，用Nae I、Xho I雙酶切牛病毒性腹瀉病毒主要囊膜蛋白E2b編碼 基因，將上述雙酶切后的表達(dá)載體與病毒蛋白編碼基因進(jìn)行連接，構(gòu)建pETDuet-E2 e-NS2-3c 和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 雙表達(dá)載體。
[0018] 通過上述制備過程，將E2b和NS2_3b編碼基因經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化后插入雙表達(dá)載 體pETDuet-Ι，將NS2-3 b和E2b編碼基因插入雙表達(dá)載體pRSFDuet-Ι，然后把攜帶四個蛋白 對應(yīng)的編碼基因的兩個載體共同轉(zhuǎn)化入一個宿主菌，實(shí)現(xiàn)高線穩(wěn)定的同時(shí)表達(dá)四種蛋白， 這是本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)中的其它技術(shù)方案相比所具有的突破性的技術(shù)優(yōu)勢。
[0019] 其中，步驟1)的編碼基因即可從相關(guān)的生物制品公司和實(shí)驗(yàn)室購買成品或者合 成，也可以豬瘟病毒株、牛病毒性腹瀉毒株的基因組為模版結(jié)合相應(yīng)的特異性引物采用PCR 方法自行擴(kuò)增，可采用的引物序列對應(yīng)如下所示：
[0020] E2C-F ： CTCGAATTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC (含 EcoR I 酶切位點(diǎn)）
[0021] E2C-R ：GGCCTGCAGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGT (含 Pst I 酶切位點(diǎn)）
[0022] NS2-3C-F ：CGCAGATCTAGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG(含 BglII 酶切位點(diǎn)）
[0023] NS2-3C-R ：CCGCTCGAGTAGACCAACTACTTGTTTTAG (含 Xho I 酶切位點(diǎn)）
[0024] NS2-3b-F ：CGCCTGCAGGGGCCTGCCGTGTGTAAGAAG (含 Pst I 酶切位點(diǎn)）
[0025] NS2-3b-R ：CATAAGCTTTTACGCGTTCTGATCAAAATCAG(含 Hind III 酶切位點(diǎn)）
[0026] E2b-F :CGCGCCGGCCACTTGGATTGCAAACCTG (含 Nae I 酶切位點(diǎn)）
[0027] E2b-R ：CCGCTCGAGCCCTAAGGCCTTCTGTTCTGA (含 Xho I 酶切位點(diǎn)）
[0028] PCR的條件和參數(shù)采用本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件即可。
[0029] 其中，步驟 2)采用 Nde I 對 pETDuet-1、pRSFDuet-Ι 和 pET_32a(+)酶切，切開的 pET-32a(+)的315bp小片段作為Trx-tag回收，再將切開的pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι分 別與Trx-tag小片段連接，將讀碼框正確插入的pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι在大腸桿菌中擴(kuò) 增。通過此種方式，本發(fā)明利用pETDuet-1、pRSFDuet-Ι第二個多克隆位點(diǎn)（MCS2)的Nde I位點(diǎn)插入了 Trx-tag,使表達(dá)的外源蛋白在N端融合Trx標(biāo)簽，改善了蛋白的可溶性。
[0030] 通過上述構(gòu)建方法所得到的共表達(dá)載體在菌株中誘導(dǎo)表達(dá)的四種抗原蛋白以包 涵體形式存在，純化的蛋白經(jīng)Western-blot檢測表明，能夠與抗CSFV和抗BVDV的陽性血 清發(fā)生反應(yīng)，證明表達(dá)的多種蛋白具有很好的免疫原性。
[0031] 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明公開了所述共表達(dá)載體的表達(dá)方法，將共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到同 一宿主菌進(jìn)行涂板，過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落接種于LB培養(yǎng)基中，搖菌過夜，轉(zhuǎn)接至新LB 培養(yǎng)基中，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0032] 其中，培養(yǎng)最終達(dá)到0D值0· 6-0. 8,所用IPTG濃度為(λ 8mmol/L。
[0033] 其中，所用的載體菌株采用適合于外源蛋白表達(dá)的菌株，優(yōu)選的是BL21 (DE3)、 BL21(DE3)PLySs 等。
[0034] 與傳統(tǒng)的疫苗相比，用本發(fā)明所涉及的共表達(dá)方法制備的疫苗可以用發(fā)酵罐規(guī)模 化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制，保證所生產(chǎn)的疫苗安全有效；本發(fā)明涉及的疫苗用抗原是蛋白質(zhì)， 與其他新型疫苗（如活載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗）相比不會發(fā)生可能出現(xiàn)基因重 組問題，因此不存在生物安全性問題，可大規(guī)模推廣應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖 1 為 pETDuet-E2e-NS2-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 的酶切結(jié)果，其中 1 為 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 的雙酶切，2 是 pETDuet-ESc-NSS-S。的雙酶切，Μ 是 lOOOObp Marker ;
[0036] 圖2是共表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)的四種免疫蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖，其 中：Μ為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為未誘導(dǎo)的菌體；2為質(zhì)粒pETDuet-E2 e-NS2-3。；3為質(zhì)粒 pRSFDuet-NS2-3b-E2b ;4 為質(zhì)粒 pETDuet-E2e-NS2-3。和質(zhì)粒 pRSFDuet-NS2-3b-E2b
[0037] 圖3是四種表達(dá)的蛋白抗原性效果圖，其中1是未誘導(dǎo)的菌體；2為表達(dá)的蛋白與 標(biāo)簽抗體的反應(yīng)；3為表達(dá)的蛋白與陽性血清的反應(yīng)；4為表達(dá)的蛋白與陰性血清的反應(yīng)。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 在下述實(shí)施例中， 申請人:提供了一種具體的共表達(dá)載體構(gòu)建和表達(dá)過程，并且詳 細(xì)描述了所用原料的來源，僅為示意，并非構(gòu)成特別限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用符合公知定 義的相關(guān)原料和實(shí)驗(yàn)條件也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的。
[0039] 在下述實(shí)施中，所用原料來源如下：
[0040] 豬瘟病毒株：石門株（Shimen)，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，也可從其他實(shí)驗(yàn)室或國家菌種 保藏中心購買。
[0041] 牛病毒性腹瀉毒株：VEDEVAC，實(shí)驗(yàn)室保存，也可從其他實(shí)驗(yàn)室或國家菌種保藏中 心購買。
[0042] pETDuet-1 和 pRSFDuet-1 雙表達(dá)載體，pET_32a(+)載體，均購自 Novagen 公司。
[0043] BL21(DE3)是四個外源蛋白的表達(dá)宿主菌，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0044] 所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0045] 所用酶和試劑：限制性內(nèi)切酶 Nde I、Bgl II、EcoR I、Pst I、Hind III、Nae I、 Xho I，T4DNA連接酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase聚合酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶均購自大連 寶生物有限公司；IPTG、SDS (十二燒基橫酸鈉）、核酸Marker、Agarose DNA extraction kit、DNA快速純化回收試劑盒和質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖芯徸源筮B寶生物工程公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit,購自QIAGEN公司；瓊脂糖購自Invitrogen公司；預(yù)染蛋白Marker購 自 Fermentas 公司。
[0046] 實(shí)施例1 :共表達(dá)載體的構(gòu)建
[0047] 1. E2C、NS2-3C、NS2-3b和E2b蛋白編碼基因的擴(kuò)增
[0048] 按QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說明提取 Shimen株P(guān)K15 細(xì)胞上清和VEDEVAC 株MDBK細(xì)胞培養(yǎng)上清的病毒RNA。以E2e-R、NS2-3e-R、NS2-3b-R、E2 b-R為反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。然后分別以此為模板擴(kuò)增出各個目的基因。
[0049] RT-PCR 25 μ L 反應(yīng)體系：PrimeSTAR 0· 25 μ L，5XPrimeSTAR 緩沖液 5 μ L，dNTP 2 μ L，上、下游引物各1 μ L，模板3 μ L，去離子水12. 75 μ L。PCR產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒 回收，從而得到四個蛋白目的蛋白的編碼基因。
[0050] 2. pETDuet-1 和 pRSFDuet-1 載體的改造
[0051] 將 pETDuet-Ι 和 pRSFDuet-Ι 和 pET_32a(+)載體分別用 Nde I 酶切，40 μ L 酶切體 系：10ΧΗ緩沖液4μ L，Nde I各2μ L，載體24μ L，去離子水10μ L。
[0052] 用膠回收試劑盒回收切開的pETDuet-1和pRSFDuet-1，將切開的pET-32a(+)的 315bp小片段（即Trx-tag編碼基因）也同樣回收；再將切開的pETDuet-Ι和pRSFDuet-1 分別與315bp的Trx-tag編碼基因連接，連接體系：10XT4DNALigase Buffer 2.5yL， Trx-tag 編碼基因膠回收產(chǎn)物 14μ L，pETDuet-l 或者 pRSFDuet-12y L，T4DNALigase 1 μ L， 去離子水5. 5 μ L。對改造后的載體進(jìn)行測序。
[0053] 3. pETDuet-l-E2c 和 pRSrouet-l-NS2_3b 載體的構(gòu)建
[0054] pETDuet-1 和 pRSFDuet-1 兩個載體分別進(jìn)行 EcoR I、Pst I 雙酶切和 Pst I、Hind m雙酶切，40 μ L酶切體系：10XH或10XΜ緩沖液4 μ L，對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶各2 μ L，載 體24 μ L，去離子水10 μ L。
[0055] 酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后膠回收。
[0056] E2。編碼基因用EcoR I、Pst I雙酶切，NS2-3b編碼基因用Pst I、Hind III雙酶 切；40yL酶切體系：10XH或10XM緩沖液4yL，對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶各2yL，目的基因 24 μ L，去離子水10 μ L。
[0057] 酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖電泳后膠回收，然后分別與雙酶切的pETDuet-1、 pRSFDuet-1的載體連接，兩個連接體系分別是：①10XT4DNA Ligase Buffer 2.5yL， E2C 編碼基因膠回收產(chǎn)物 14yL，pETDuet-12yL，T4DNALigase lyL，去離子水 5.5yL; ② 10XT4DNALigase Buffer 2· 5μ L，NS2-3b 編碼基因膠回收產(chǎn)物 14μ L，pRSFDuet-12y L， T4DNALigase lyL，去離子水 5.5yL。
[0058] 16°C連接過夜，分別轉(zhuǎn)化Transl09感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落分別進(jìn)行 菌液PCR鑒定、酶切鑒定，并對構(gòu)建的載體測序，確定成功構(gòu)建了 pETDuet-l-E2。和 pRSFDuet-l-NS2-3b 表達(dá)載體。
[0059] 4· ρΕΤ0ι?Θ?-Ε2ε-Ν52-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 載體的構(gòu)建
[0060] 對 pETDuet-l-E2。和 pRSFDuet-l-NS2-3b*別進(jìn)行 Bgl II、Xho I 和 Nae I、Xho I 雙酶切，40 μ L酶切體系：10XH或10XL緩沖液4 μ L，限制性內(nèi)切酶各2 μ L，載體24 μ L， 去離子水10 μ L。
[0061] 酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后膠回收。
[0062] 用Bgl II、Xho I雙酶切NS2-3。編碼的基因，用Nae I、Xho I雙酶切E2b編碼的基 因，40 μ L酶切體系：10XH或10XL緩沖液4 μ L，限制性內(nèi)切酶各2 μ L，目的基因24 μ L， 去離子水10 μ L。
[0063] 酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖電泳后膠回收?；厥盏拿盖挟a(chǎn)物分別與雙酶切后的 pETDuet-l-E2。和卩1--〇116卜1-呢2-313載體連接，兩個連接體系分別是：①10XT4DNALigase Buffer 2. 5 μ L，NS2-3。編碼基因回收產(chǎn)物 14 μ L，pETDuet-l-E2?；厥债a(chǎn)物 2 μ L， T4DNALigase 1 μ L，去離子水 5. 5 μ L ;② 10 X T4DNALigase Buffer 2. 5 μ L，E2b 的編碼基 因膠回收產(chǎn)物14以1^，？1--〇1?^-1-呢2-313回收產(chǎn)物2yL，T4DNA Ligase lyL，去離子水 5. 5 μ L〇
[0064] 16°C連接過夜，分別轉(zhuǎn)化Transl09感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落分別進(jìn)行菌 液PCR鑒定、酶切鑒定，并對構(gòu)建的載體測序，確定成功構(gòu)建了 pETDuet-E2e-NS2-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 表達(dá)載體（參考圖 1)。
[0065] 實(shí)施例2 :共表達(dá)載體的表達(dá)
[0066] 將 pETDuet-E2e-NS2-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 表達(dá)載體各 0· 5 μ L，同時(shí)轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)宿主菌，涂板，過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落接種于新鮮10mL LB培養(yǎng)基中，搖菌過 夜，按1 : 100比例轉(zhuǎn)接新鮮10mL LB培養(yǎng)基中，0D值達(dá)0. 6-0. 8時(shí)取lmL菌液作為未誘導(dǎo) 樣品，其余加入終濃度〇. 8mM的IPTG，誘導(dǎo)4h，每小時(shí)收取lmL菌液樣品。
[0067] 表達(dá)完成后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測以確定表達(dá)是否有效。
[0068] SDS-PAGE溶液組成如下：
[0069] Tris-甘氨酸緩沖液：25mmol/L Tris、250mmol/L 甘氨酸（pH 8. 0)、0· 1 % SDS。
[0070] 2XSDS Loading buffer :100mmol/L Tris Cl (ρΗ8· 0)、200mmol/L 疏基乙醇、4% SDS、0. 2%溴酚藍(lán)、20%甘油。
[0071] 考馬斯亮藍(lán)染色液：45mL甲醇、45mL水、10mL冰醋酸中溶解0. 25g考馬斯亮藍(lán) R250。
[0072] 脫色液：30%甲醇、10%冰乙酸，蒸餾水補(bǔ)體積至100mL。
[0073] SDS-PAGE檢測過程如下：
[0074] (1)洗凈玻璃板，固定在電泳槽上，用2. 0%瓊脂糖封邊。常規(guī)方法配制15%的分 離膠5mL，迅速注入兩玻璃板之間，膠頂覆蓋lmL雙蒸水。待分離膠凝固后傾出覆蓋層液體， 用去離子水沖洗凝膠頂部數(shù)次，倒置空干液體，加入2mL 5%的濃縮膠溶液，插上梳子，垂直 放置電泳槽使其凝固。
[0075] (2)小心移去梳子，在電泳裝置上、下槽間加入Tris-甘氨酸緩沖液，用注射器沖 洗加樣孔數(shù)次，將電源負(fù)極與上槽相連。
[0076] (3)收集的菌液12000rpm離心2min，用50 μ LpH7. 4的PBS懸浮，加入等體積的 2XSDS上樣buffer，混勻，水浴煮沸l(wèi)Omin，用微量進(jìn)樣器上樣10yL，打開電源，用80V電 壓電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，把電壓提高到120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。
[0077] (4)染色：取下凝膠用蒸餾水沖洗，用5倍凝膠體積的考馬斯亮藍(lán)染色液浸泡凝 膠，放在脫色搖床上室溫染色3h。
[0078] (5)脫色：用30%甲醇、10%冰乙酸的混合液，在脫色搖床上脫色過夜，其間更換 染色液3?4次。待藍(lán)色背景完全脫凈后，將凝膠浸入蒸餾水中終止脫色。
[0079] 結(jié)果如附圖2所示，由附圖2可見，成功實(shí)現(xiàn)了四種蛋白的共表達(dá)。
[0080] 在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明還進(jìn)行了四種蛋白的免疫原性檢測（Western Blot)， SDS-PAGE結(jié)束后，取下凝膠，切掉濃縮膠，根據(jù)分離膠的大小裁剪PVDF膜，然后將膜在甲醇 中浸泡20s，轉(zhuǎn)移至去離子水中漂洗一下，最后置于蛋白轉(zhuǎn)移液中浸泡5min。在蛋白轉(zhuǎn)移 液中按照濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙的順序鋪好，注意凝膠對應(yīng)負(fù)極，膜對應(yīng)正極，夾緊夾子， 放入轉(zhuǎn)移槽內(nèi)，接通電源，350mA轉(zhuǎn)漬150min，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將膜置于5%脫脂 奶粉中封閉非特異性蛋白質(zhì)，室溫，2h。將膜置于標(biāo)簽抗體或陽性血清工作液中，在搖床上 4°C搖晃過夜，PBST洗膜4次，每次15min，將膜置于二抗工作液中，在搖床上，室溫?fù)u晃孵育 1. 5h，PBST洗膜4次，每次15min。洗滌結(jié)束后，用去離子水清洗PVDF膜一次，稍微晾干，將 膜置于塑料保鮮膜內(nèi)，在暗室中等量混合ECL顯色系統(tǒng)中A、B液，滴加至PVDF膜上，作用 lmin ;裁剪X-膠片，放在膜上，蓋上膠片夾，曝光適當(dāng)時(shí)間，取出膠片顯影，定影，掃描膠片， 進(jìn)行分析。
[0081] 參考圖3所示，顯示了本發(fā)明的共表達(dá)載體表達(dá)的蛋白與血清的免疫反應(yīng)效果， 顯示了本發(fā)明共表達(dá)的四種蛋白具有良好的免疫原性。
【權(quán)利要求】
1. 豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白共表達(dá)載體，其特征 在于在同一宿主菌中表達(dá)的雙表達(dá)載體pETDuet-1、pRSFDuet-Ι上分別連接有豬瘟病毒的 主要囊膜蛋白E2。和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白E2 b和非結(jié) 構(gòu)蛋白NS2-3b的編碼基因，雙表達(dá)載體與編碼基因的連接關(guān)系為ρΕΤ0ικ^-Ε2 ε-Ν52-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的共表達(dá)載體，其特征在于宿主菌為大腸桿菌。
3. 權(quán)利要求1的共表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括將豬瘟病毒的主要囊膜蛋白 E2。和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白E2b和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3b的 編碼基因連接到雙表達(dá)載體pETDuet-1、pRSFDuet-Ι的步驟。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的構(gòu)建方法，其特征在于具體包括下述步驟：1)擴(kuò)增豬瘟病毒的主 要囊膜蛋白E2。和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白E2 b和非結(jié)構(gòu)蛋 白 NS2-3b 的編碼基因；2)利用 Nde I 酶切 pETDuet-l、pRSFDuet-l 和 pET-32a(+)載體，將 酶切后的pETDuet-l、pRSFDuet-l分別與pET-32a(+)載體酶切回收后的Trx-tag序列片段 連接得到改造后的pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι載體；3)將改造后的pETDuet-l、pRSFDuet-l 載體分別進(jìn)行EcoR I、Pst I雙酶切和Pst I、HindIII雙酶切，豬瘟病毒的主要囊膜蛋白 E2C編碼基因用EcoR I、Pst I雙酶切，牛粘膜病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3b編碼基因用Pst I、 Hind III雙酶切；將雙酶切之后的pETDuet-1、pRSFDuet-Ι載體分別與雙酶切后的豬瘟病 毒主要囊膜蛋白E2。編碼基因、牛病毒性腹瀉病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3 b編碼基因連接得到表 達(dá)載體 pETDuet-l-EZ。和 pRSFDuet-l-NS2-3b ;4)對步驟 3)所得表達(dá)載體 pETDuet-l-E2c 進(jìn)行Bgl II、Xho I雙酶切，表達(dá)載體pRSFDuet-l-NS2-3b進(jìn)行Nae I、Xho I雙酶切，同時(shí) 用BglII、Xho I雙酶切豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3。編碼基因，用Nae I、Xho I雙酶切牛病 毒性腹瀉病毒主要囊膜蛋白E2b編碼基因，將上述雙酶切后的表達(dá)載體與病毒蛋白編碼基 因進(jìn)行連接，構(gòu)建pETDuet-E2 e-NS2-3。和pRSFDuet-NS2-3b-E2b雙表達(dá)載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的構(gòu)建方法，其特征在于步驟1)以豬瘟病毒基因組為模版，擴(kuò)增出 主要囊膜蛋白E2。和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3。的編碼基因，以牛病毒性腹瀉病毒基因組為模版，擴(kuò) 增出主要囊膜蛋白E2 b和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3b的編碼基因。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的構(gòu)建方法，其特征在于各編碼基因?qū)?yīng)的引物分別為 E2C-F ：CTCGAATTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC E2C-R ：GGCCTGCAGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGT NS2-3C-F ：CGCAGATCTAGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG NS2-3C-R ：CCGCTCGAGTAGACCAACTACTTGTTTTAG NS2-3h-F ：CGCCTGCAGGGGCCTGCCGTGTGTAAGAAG NS2-3h-R ：CATAAGCTTITACGCGTTCTGATCAAAATCAG E2h-F ： CGCGCCGGCCACTTGGATTGCAAACCTG E2h-R : CCGCTCGAGCCCTAAGGCCTTCTGTTCTGA。
7. 權(quán)利要求1的共表達(dá)載體的表達(dá)方法，其特征在于將共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到同一宿主菌 進(jìn)行涂板，過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落接種于LB培養(yǎng)基中，搖菌過夜，轉(zhuǎn)接至新LB培養(yǎng)基 中，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的表達(dá)方法，其特征在于培養(yǎng)最終達(dá)到0D值0. 6-0. 8,所用IPTG濃 度為 0. 8mmol/L。
【文檔編號】C12N15/66GK104152479SQ201410377167
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月1日
【發(fā)明者】周繼章, 宮曉煒, 曹小安, 李兆才, 陳啟偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所