一種與吸煙成癮相關(guān)的snp標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及健康教育領(lǐng)域，公開了一種與吸煙成癮相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為rs10795690、rs11205276、rs11258964、rs11742916、rs11757917、rs11858823、rs11996459、rs1582931、rs166402、rs17636179、rs17646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、rs6016431、rs6717249、rs6749212、rs7046153等25個(gè)SNP的組合。該標(biāo)志物可用于制備吸煙成癮相關(guān)的試劑盒。
【專利說明】一種與吸煙成癮相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程及健康教育領(lǐng)域，涉及吸煙成癮篩查相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]煙草使用是導(dǎo)致全球可預(yù)防死亡的首要死因。大量研究證實(shí)，煙草危害人體的許多器官，可導(dǎo)致肺癌、冠心病、腦卒中等多種疾病的發(fā)生和死亡，同時(shí)也會(huì)減少期望壽命，降低生活質(zhì)量。2011年世界衛(wèi)生組織全球煙草流行報(bào)告指出，每年因煙草使用致全球近600萬(wàn)人死亡并造成數(shù)千億元的經(jīng)濟(jì)損失；如果當(dāng)前的趨勢(shì)繼續(xù)下去，到2030年時(shí)，全世界每年因煙草導(dǎo)致的死亡將超過800萬(wàn)人。我國(guó)是全世界最大的煙草生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，吸煙對(duì)人民群眾健康的影響尤為嚴(yán)重。根據(jù)2012年衛(wèi)生部發(fā)布的《中國(guó)吸煙危害健康報(bào)告》，我國(guó)吸煙人群逾3億，另有約7.4億不吸煙人群遭受二手煙的危害；每年因吸煙相關(guān)疾病所致死亡人數(shù)超過100萬(wàn)，如對(duì)吸煙流行狀況不加以控制，至2050年每年死亡人數(shù)將突破300萬(wàn)。由此可見，煙草使用嚴(yán)重威脅全球及我國(guó)居民的生命和健康，是亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。
[0003]世界衛(wèi)生組織指出，煙草依賴是一種慢性成癮性疾病，嗜煙者實(shí)際上是病人。許多吸煙者知道吸煙的危害，并有意愿戒煙，但因煙草依賴而不能控制吸煙行為。雙生子研究顯示，遺傳因素在煙草依賴的發(fā)生中扮演著重要角色。近年來，多個(gè)GWAS研究發(fā)現(xiàn)在高加索人群中15q25.1區(qū)域的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism, SNP)與煙草依賴有關(guān)。
[0004]SNP是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。SNP的存在被認(rèn)為賦予了個(gè)體不同的表型性狀，以及對(duì)于環(huán)境因素、藥物治療等因素的不同反應(yīng)性，因此SNP可能是導(dǎo)致個(gè)體對(duì)常見疾病發(fā)病和預(yù)后易感性差異的重要遺傳基礎(chǔ)。近年來，針對(duì)腫瘤和心血管疾病等常見重大疾病的SNP研究已經(jīng)成為臨床和科研工作者的研究熱點(diǎn)。
[0005]然而，目前還沒有將SNP應(yīng)用于評(píng)價(jià)吸煙成癮的報(bào)道，若能篩選出與吸煙成癮相關(guān)的SNP作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的試劑盒，對(duì)我國(guó)吸煙成癮的評(píng)價(jià)及煙草使用的控制必將是一次有力的推動(dòng)，也為戒煙藥物的篩選、藥效評(píng)價(jià)及靶向治療開辟了新的途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)問題，提出一種與吸煙成癮相關(guān)的SNP標(biāo)志物。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述SNP標(biāo)志物的特異性引物。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述SNP標(biāo)志物及其特異性引物在制備吸煙成癮相關(guān)試劑盒中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明第四個(gè)目的是提供吸煙成癮相關(guān)的試劑盒。
[0010]發(fā)明人通過分離和研究吸煙人群及與其年齡、性別匹配的不吸煙對(duì)照外周血DNA中的單核苷酸多態(tài)性，尋找一組與吸煙成癮相關(guān)的高特異性和敏感性的SNP，并研制出可便于臨床應(yīng)用的吸煙成癮相關(guān)試劑盒，為吸煙成癮的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的新型戒煙小分子藥物提供數(shù)據(jù)支持。
[0011]本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0012]一種與吸煙成癮相關(guān)的SNP標(biāo)志物，該標(biāo)志物為rsl0795690、rsl 1205276、rsll258964、 rsll742916、 rsll757917、 rsll858823、 rsll996459、 rsl582931、 rsl66402、rsl7636179、rsl7646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、 rs601643U rs6717249、 rs6749212、 rs7046153、 rs7246302、 rs8045566、rs855399 和 rs998454 的組合。
[0013]所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，該引物為:
[0014]rs 10795690 的引物序列為 SEQ ID No:1、SEQ ID No:2 ；
[0015]rsll205276 的引物序列為 SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 ；
[0016]rsll258964 的引物序列為 SEQ ID No:7、SEQ ID No:8 ；
[0017]rsll742916 的引物序列為 SEQ ID No:10、SEQ ID No:11 ；
[0018]rsll757917 的引物序列為 SEQ ID No:13、SEQ ID No:14 ；
[0019]rsll858823 的引物序列為 SEQ ID No:16、SEQ ID No:17 ；
[0020]rsl 1996459 的引物序列為 SEQ ID No:19、SEQ ID No:20 ；
[0021]rsl582931 的引物序列為 SEQ ID No:22、SEQ ID No:23 ；
[0022]rs 166402 的引物序列為 SEQ ID No:25、SEQ ID No:26 ；
[0023]rsl7636179 的引物序列為 SEQ ID No:28、SEQ ID No:29 ；
[0024]rsl7646672 的引物序列為 SEQ ID No:31、SEQ ID No:32 ；
[0025]rs2060247 的引物序列為 SEQ ID No:34、SEQ ID No:35 ；
[0026]rs2289958 的引物序列為 SEQ ID No:37、SEQ ID No:38 ；
[0027]rs2960067 的引物序列為 SEQ ID No:40、SEQ ID No:41 ；
[0028]rs4015379 的引物序列為 SEQ ID No:43、SEQ ID No:44 ；
[0029]rs4672335 的引物序列為 SEQ ID No:46、SEQ ID No:47 ；
[0030]rs5752676 的引物序列為 SEQ ID No:49、SEQ ID No:50 ；
[0031]rs6016431 的引物序列為 SEQ ID No:52、SEQ ID No:53 ；
[0032]rs6717249 的引物序列為 SEQ ID No:55、SEQ ID No:56 ；
[0033]rs6749212 的引物序列為 SEQ ID No:58、SEQ ID No:59 ；
[0034]rs7046153 的引物序列為 SEQ ID No:61、SEQ ID No:62 ；
[0035]rs7246302 的引物序列為 SEQ ID No:64、SEQ ID No:65 ；
[0036]rs8045566 的引物序列為 SEQ ID No:67、SEQ ID No:68 ；
[0037]rs855399 的引物序列為 SEQ ID No:70、SEQ ID No:71 ；
[0038]rs998454 的引物序列為 SEQ ID No:73、SEQ ID No:74。
[0039]所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物，該引物為:
[0040]rsl0795690 的引物序列為 SEQ ID NO:3 ;rsll205276 的引物序列為 SEQ IDNO:6 ;rsll258964 的引物序列為 SEQ ID NO:9 ;rsll742916 的引物序列為 SEQ ID NO:12 ;rsl 1757917 的引物序列為 SEQ ID NO: 15 ;rsl 1858823 的引物序列為 SEQ ID NO:18 ;rsll996459 的引物序列為 SEQ ID NO:21 ;rsl582931 的引物序列為 SEQ ID NO:24 ;rsl66402 的引物序列為 SEQ ID NO:27 ;rsl7636179 的引物序列為 SEQ ID NO:30 ;rsl7646672 的引物序列為 SEQ ID NO:33 ；rs2060247 的引物序列為 SEQ ID NO:36 ；rs2289958 的引物序列為 SEQ ID NO:39 ；rs2960067 的引物序列為 SEQ ID NO:42 ；rs4015379 的引物序列為 SEQ ID NO:45 ；rs4672335 的引物序列為 SEQ ID NO:48 ；rs5752676 的引物序列為 SEQ ID NO:51 ；rs6016431 的引物序列為 SEQ ID NO:54 ；rs6717249 的引物序列為 SEQ ID NO:57 ；rs6749212 的引物序列為 SEQ ID NO:60 ；rs7046153 的引物序列為 SEQ ID NO:63 ；rs7246302 的引物序列為 SEQ ID NO:66 ；rs8045566 的引物序列為 SEQ ID NO:69 ;rs855399 的引物序列為 SEQ ID NO:72 ；rs998454的引物序列為SEQ ID NO:75o
[0041]所述的SNP標(biāo)志物在制備吸煙成癮輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0042]所述的SNP標(biāo)志物的特異性引物在制備吸煙成癮輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0043]一種吸煙成癮輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測(cè)外周血DNA中rsl0795690、rsll205276、rsll258964、rsll742916、rsll757917、rsll858823、rsll996459、rsl582931、rsl66402、rsl7636179、rsl7646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067, rs4015379、rs4672335、 rs5752676、 rs601643U rs6717249、 rs6749212、 rs7046153、 rs7246302、rs8045566、rs855399 和 rs998454。
[0044]所述的吸煙成癮輔助診斷試劑盒，該試劑盒含有上述SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物和/或特異性延伸引物。
[0045]所述的吸煙成癮輔助診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物為:
[0046]rs 10795690 的引物序列為 SEQ ID No:1、SEQ ID No:2 ；
[0047]rsll205276 的引物序列為 SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 ；
[0048]rsll258964 的引物序列為 SEQ ID No:7、SEQ ID No:8 ；
[0049]rsll742916 的引物序列為 SEQ ID No:10、SEQ ID No:11 ；
[0050]rsll757917 的引物序列為 SEQ ID No:13、SEQ ID No:14 ；
[0051]rsll858823 的引物序列為 SEQ ID No:16、SEQ ID No:17 ；
[0052]rsl 1996459 的引物序列為 SEQ ID No:19、SEQ ID No:20 ；
[0053]rsl582931 的引物序列為 SEQ ID No:22、SEQ ID No:23 ；
[0054]rs 166402 的引物序列為 SEQ ID No:25、SEQ ID No:26 ；
[0055]rsl7636179 的引物序列為 SEQ ID No:28、SEQ ID No:29 ；
[0056]rsl7646672 的引物序列為 SEQ ID No:31、SEQ ID No:32 ；
[0057]rs2060247 的引物序列為 SEQ ID No:34、SEQ ID No:35 ；
[0058]rs2289958 的引物序列為 SEQ ID No:37、SEQ ID No:38 ；
[0059]rs2960067 的引物序列為 SEQ ID No:40、SEQ ID No:41 ；
[0060]rs4015379 的引物序列為 SEQ ID No:43、SEQ ID No:44 ；
[0061]rs4672335 的引物序列為 SEQ ID No:46、SEQ ID No:47 ；
[0062]rs5752676 的引物序列為 SEQ ID No:49、SEQ ID No:50 ；
[0063]rs6016431 的引物序列為 SEQ ID No:52、SEQ ID No:53 ；
[0064]rs6717249 的引物序列為 SEQ ID No:55、SEQ ID No:56 ；
[0065]rs6749212 的引物序列為 SEQ ID No:58、SEQ ID No:59 ；
[0066]rs7046153 的引物序列為 SEQ ID No:61、SEQ ID No:62 ；
[0067]rs7246302 的引物序列為 SEQ ID No:64、SEQ ID No:65 ；
[0068]rs8045566 的引物序列為 SEQ ID No:67、SEQ ID No:68 ；
[0069]rs855399 的引物序列為 SEQ ID No:70、SEQ ID No:71 ;
[0070]rs998454 的引物序列為 SEQ ID No:73、SEQ ID No:74。
[0071]所述的吸煙成癮輔助診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物為:
[0072]rsl0795690 的引物序列為 SEQ ID NO:3 ;rsl 1205276 的引物序列為 SEQ IDNO:6 ;rsll258964 的引物序列為 SEQ ID NO:9 ;rsll742916 的引物序列為 SEQ ID NO:12 ;rsl 1757917 的引物序列為 SEQ ID NO: 15 ;rsl 1858823 的引物序列為 SEQ ID NO:18 ;rsll996459 的引物序列為 SEQ ID NO:21 ;rsl582931 的引物序列為 SEQ ID NO:24 ;rsl66402 的引物序列為 SEQ ID NO:27 ;rsl7636179 的引物序列為 SEQ ID NO:30 ；rsl7646672 的引物序列為 SEQ ID NO:33 ；rs2060247 的引物序列為 SEQ ID NO:36 ；rs2289958 的引物序列為 SEQ ID NO:39 ；rs2960067 的引物序列為 SEQ ID NO:42 ；rs4015379 的引物序列為 SEQ ID NO:45 ；rs4672335 的引物序列為 SEQ ID NO:48 ；rs5752676 的引物序列為 SEQ ID NO:51 ；rs6016431 的引物序列為 SEQ ID NO:54 ；rs6717249 的引物序列為 SEQ ID NO:57 ；rs6749212 的引物序列為 SEQ ID NO:60 ；rs7046153 的引物序列為 SEQ ID NO:63 ；rs7246302 的引物序列為 SEQ ID NO:66 ；rs8045566 的引物序列為 SEQ ID NO:69 ；rs855399 的引物序列為 SEQ ID NO:72 ；rs998454的引物序列為SEQ ID NO:75o
[0073]所述吸煙成癮相關(guān)試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl2溶液、去離子水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br> [0074]具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括:(I)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫(kù)和數(shù)據(jù)庫(kù):以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。(2)基因型檢測(cè):選擇吸煙人群及與其年齡、性別匹配的不吸煙對(duì)照，利用高密度SNP芯片，在全基因組范圍內(nèi)找出與吸煙成癮相關(guān)的SNP。(3)對(duì)篩選出的陽(yáng)性關(guān)聯(lián)SNP，進(jìn)一步采用Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證其應(yīng)用于臨床診斷的可重復(fù)性。
(4)吸煙成癮相關(guān)試劑盒的研制:根據(jù)吸煙人群和不吸煙對(duì)照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP開發(fā)SNP相關(guān)的試劑盒。
[0075]本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料、臨床資料等，并采用了 Affymetrix6.0芯片進(jìn)行全基因組掃描，SequenomMassARRAY基因分型進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)等。
[0076]具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分:
[0077]1.研究樣本的選擇
[0078](I)通過問卷調(diào)查確定的吸煙人群；
[0079](2)與吸煙人群年齡、性別匹配的不吸煙對(duì)照；
[0080]本研究共采用4268例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。
[0081]2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到20-50ng/y IDNA,純度(紫外2600D與2800D比值)在1.6-2.0。
[0082]3.Affymetrix6.0 芯片檢測(cè)
[0083](I)取受試者全基因組DNA樣本；
[0084](2)在Affymetrixe.0芯片(購(gòu)于美國(guó)昂飛公司，下同)上進(jìn)行全基因組掃描；
[0085](3)檢測(cè)并比較各基因型在吸煙人群與不吸煙對(duì)照中的分布差異。
[0086]4.單個(gè) SNP 的 Sequenom MassARRAY 基因分型
[0087](I)取受試者DNA樣本；
[0088](2)設(shè)計(jì)單個(gè)SNP的特異性引物；
[0089](3)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)；
[0090](4)檢測(cè)并比較吸煙人群與不吸煙對(duì)照中不同基因型的分布差異。
[0091]5.吸煙成癮相關(guān)試劑盒的制備方法
[0092]Affymetrix6.0芯片進(jìn)行全基因組掃描和單個(gè)SNP檢測(cè)后確定吸煙人群與不吸煙對(duì)照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP，作為評(píng)價(jià)吸煙成癮的指標(biāo)。最后篩選出的與吸煙成癮有關(guān)的 SNP 組成相應(yīng)試劑盒(rsl0795690、rsll205276、rsll258964、rsll742916、rsll757917、rsll858823、rsll996459、rsl582931、rsl66402、rsl7636179、rsl7646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、rs6016431、rs6717249、rs6749212、rs7046153、rs7246302、rs8045566、rs855399 和 rs998454)。試劑可以包括這些SNP的特異性引物和Taq酶、dNTP等。
[0093]6.統(tǒng)計(jì)分析方法
[0094]運(yùn)用卡方檢驗(yàn)(用于分類變量)或者student t檢驗(yàn)(用于連續(xù)性變量)比較人口學(xué)特征等在研究對(duì)象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
[0095]為了進(jìn)一步研究這25個(gè)SNP構(gòu)成的綜合指征用于早期評(píng)價(jià)吸煙成癮的效果，我們構(gòu)建了一個(gè)數(shù)學(xué)公式，綜合考慮每個(gè)SNP與吸煙成癮的正、負(fù)關(guān)聯(lián)情況和聯(lián)系強(qiáng)度。具體來說，我們對(duì)每個(gè)SNP的三種基因型進(jìn)行評(píng)分，野生純合型=“0”，雜合型=“1”，變異純合型=“2”，以單個(gè)SNP分析時(shí)的additive模型下的回歸系數(shù)為權(quán)重，綜合考慮每個(gè)SNP的情況給每個(gè)研究對(duì)象確定一個(gè)危險(xiǎn)分值。危險(xiǎn)分值的計(jì)算方法如下:危險(xiǎn)分值=(0.39Xrsl0795690 的評(píng)分)+ (0.40Xrsll205276 的評(píng)分)+ (0.41 Xrsll258964 的評(píng)分)+ (0.37Xrsl 1742916 的評(píng)分)+ (-0.32Xrsl 1757917 的評(píng)分)+ (0.40Xrsl 1858823 的評(píng)分)+ (-0.33Xrsll996459 的評(píng)分)+ (0.26Xrsl582931 的評(píng)分)+ (0.43Xrsl66402 的評(píng)分)+ (0.49Xrsl7636179 的評(píng)分)+ (0.41 Xrsl7646672 的評(píng)分)+ (-0.35Xrs2060247的評(píng)分) + (0.45Xrs2289958 的評(píng)分)+ (0.35Xrs2960067 的評(píng)分)+ (-0.64Xrs4015379的評(píng)分)+ (0.46Xrs4672335 的評(píng)分)+ (0.43Xrs5752676 的評(píng)分)+ (0.45Xrs6016431 的評(píng)分)+ (-0.29Xrs6717249 的評(píng)分)+ (-0.48Xrs6749212 的評(píng)分)+ (0.40Xrs7046153 的評(píng)分)+ (0.26Xrs7246302 的評(píng)分)+ (0.34Xrs8045566 的評(píng)分)+ (-0.30Xrs855399 的評(píng)分)+ (0.29Xrs998454的評(píng)分)，獲得的危險(xiǎn)分值系數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于全基因組關(guān)聯(lián)研究的2190例樣本中。(以rsl0795690為例:(λ 39為rsl0795690的回歸系數(shù)(見表I) ;rs 10795690的評(píng)分，野生純合型=“0”，雜合型=“ 1”，變異純合型= “2”，某個(gè)SNP的基因型由儀器檢測(cè)結(jié)果確定；某個(gè)樣本的總評(píng)分是這些個(gè)SNP分別評(píng)分的總和，單個(gè)SNP的基因型只是計(jì)算評(píng)分的一個(gè)中間過程，不需要知道具體基因型。)
[0096]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均通過專門的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件完成(PLINK1.07)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平P值設(shè)為0.05，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。
[0097]以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說明:
[0098]在上述912例吸煙人群及1278例不吸煙對(duì)照中，兩組年齡、性別均衡可比。我們將這兩組人群經(jīng)Affymetrixe.0芯片進(jìn)行全基因組掃描獲得相關(guān)結(jié)果。
[0099]根據(jù)Affymetrixe.0芯片檢測(cè)，本發(fā)明人檢測(cè)到在“吸煙人群”組和“不吸煙對(duì)照”組中基因型分布頻率存在差異的SNP包括:rsl0795690、rsll205276、rsll258964、rsll742916、 rsll757917、 rsll858823、 rsll996459、 rsl582931、 rsl66402、 rsl7636179、rsl7646672、 rs2060247、 rs2289958、 rs2960067, rs4015379、 rs4672335、 rs5752676、rs6016431、 rs6717249、 rs6749212、 rs7046153、 rs7246302、 rs8045566、 rs855399 和rs998454。
[0100]根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，我們將這25個(gè)與吸煙成癮相關(guān)的SNP在另外1020例吸煙人群和與其年齡、性別匹配的1058例不吸煙對(duì)照中進(jìn)行了單個(gè)SNP的檢測(cè)，結(jié)果與芯片檢測(cè)—致。
[0101]單因素和多因素Logistic回歸分析結(jié)果均表明，這25個(gè)SNP與吸煙成癮存在著顯著關(guān)聯(lián)。
[0102]進(jìn)一步分析這25個(gè)SNP的組合用于評(píng)價(jià)吸煙成癮的效果，發(fā)現(xiàn)其組合能夠很好地區(qū)分吸煙與不吸煙。
[0103]根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于評(píng)價(jià)吸煙成癮的試劑盒，包含測(cè)定受試者血標(biāo)本DNA中上述SNP的特異性引物和其他檢測(cè)試劑。
[0104]具體而言，這25個(gè)SNP的組合，或者這25個(gè)SNP的特異性引物的組合構(gòu)成的相關(guān)試劑盒有助于評(píng)價(jià)吸煙成癮，為醫(yī)護(hù)人員或吸煙者自身快速準(zhǔn)確掌握煙草依賴的狀態(tài)和嚴(yán)重程度，及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持。
[0105]本發(fā)明有益效果:
[0106]本發(fā)明提供的SNP標(biāo)志物作為評(píng)價(jià)吸煙成癮的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于:
[0107](I)SNP是一種新型基因生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測(cè)，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標(biāo)志物的成功開發(fā)將為吸煙成癮的評(píng)價(jià)和診斷開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。
[0108](2) SNP試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷試劑盒，可用于評(píng)價(jià)吸煙成癮的狀態(tài)，有助于反映吸煙者煙草依賴的嚴(yán)重程度，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情、及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持。
[0109](3)采用嚴(yán)密的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)體系，本發(fā)明人初期采用全基因組芯片掃描以獲取疾病相關(guān)的SNP譜，并應(yīng)用Sequenom MassARRAY基因分型方法在大樣本中進(jìn)行了驗(yàn)證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了 SNP生物標(biāo)志物和相關(guān)試劑盒在臨床上的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。
[0110]本發(fā)明通過控制年齡、性別等影響因素，研究SNP在吸煙成癮評(píng)價(jià)的應(yīng)用前景，闡述SNP對(duì)于吸煙成癮進(jìn)展的影響，揭示其診斷價(jià)值。因此，本發(fā)明獲得了吸煙成癮相關(guān)SNP譜和特異性標(biāo)志物；通過SNP生物標(biāo)志物和相關(guān)試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得吸煙成癮的評(píng)價(jià)和診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握吸煙者煙草依賴的狀態(tài)和嚴(yán)重程度，為臨床治療效果評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0111]圖1:顯示全基因組關(guān)聯(lián)研究吸煙組和不吸煙對(duì)照組的ROC曲線。
[0112]顯示吸煙組對(duì)不吸煙對(duì)照組為參照的ROC曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0113]實(shí)施例1樣品的收集和樣品資料的整理
[0114]發(fā)明人于2005月4月開始至2011年12月從江蘇地區(qū)收集了大量的血標(biāo)本，通過對(duì)樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了 4268例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本全基因組芯片掃描和單個(gè)SNP Sequenom MassARRAY基因分型的實(shí)驗(yàn)樣品:
[0115]1、通過問卷調(diào)查確定的吸煙人群；
[0116]2、與吸煙人群年齡、性別匹配的不吸煙對(duì)照；
[0117]并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。
[0118]實(shí)施例2外周血DNA中SNP的全基因組掃描
[0119]在上述符合條件的912例吸煙人群和1278例不吸煙對(duì)照中，兩組年齡、性別匹配。將這兩組人群經(jīng)Affymetrixe.0芯片檢測(cè)獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為:
[0120]1、向儲(chǔ)存于2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑(即裂解液，40份量配置方法如下:蔗糖219.72g、氯化鎂2.02g和曲拉通X-1OO (amresco0694) 20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml,下同),顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。
[0121]2、去除紅細(xì)胞:用溶血試劑將5ml離心管補(bǔ)至4ml,顛倒混勻,4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑,再次顛倒混勻清洗一次,4000rpm離心10分鐘,棄上清。
[0122]3、抽提DNA:向沉淀中加Iml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化鈉，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15mll0%十二烷基硫酸鈉，148.1ml雙蒸水，下同)和8μ I蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過夜。
[0123]4、去除蛋白質(zhì):加Iml飽和酹充分混勻(手輕搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿:異戊醇=24:1, v/v,下同)，充分混勻后(手搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘,取上清(分入兩個(gè)1.5ml的離心管)。
[0124]5、DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無(wú)水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心10min。
[0125]6、DNA洗漆:在沉淀中加入冰無(wú)水乙醇1ml, 12000rpm離心1min,棄上清后真空抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0126]7、測(cè)量濃度:通常能得到20-50ng/ μ I DNA,純度(紫外2600D與2800D比值)在1.6_2.0 ο
[0127]8、在Affymetrix6.0芯片(購(gòu)于美國(guó)昂飛公司，下同)上進(jìn)行全基因組掃描；
[0128]9、數(shù)據(jù)分析與處理:在“吸煙人群”組和“不吸煙對(duì)照”組中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的SNP在上文中已經(jīng)羅列出，結(jié)果見表1。
[0129]表1.病例組與對(duì)照組全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
[0130]

【權(quán)利要求】
1.一種與吸煙成癮相關(guān)的SNP標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物為rsl0795690、rsll205276、rsll258964、rsll742916、rsll757917、rsll858823、rsll996459、rsl582931、rsl66402、rsl7636179、rsl7646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、rs601643U rs6717249、rs6749212、rs7046153、rs7246302、rs8045566、rs855399 和 rs998454 的組合。
2.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，其特征在于該引物為: rs 10795690 的引物序列為 SEQ ID No:1、SEQ ID No:2 ； rsll205276 的引物序列為 SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 ； rsll258964 的引物序列為 SEQ ID No:7、SEQ ID No:8 ； rsll742916 的引物序列為 SEQ ID No: 10, SEQ ID No:11 ； rsll757917 的引物序列為 SEQ ID No: 13, SEQ ID No:14 ； rsll858823 的引物序列為 SEQ ID No: 16, SEQ ID No:17 ； rs 11996459 的引物序列為 SEQ ID No: 19、SEQ ID No:20 ； rsl582931 的引物序列為 SEQ ID No:22, SEQ ID No:23 ； rsl66402 的引物序列為 SEQ ID No:25, SEQ ID No:26 ； rsl7636179 的引物序列為 SEQ ID No:28, SEQ ID No:29 ； rsl7646672 的引物序列為 SEQ ID No:31、SEQ ID No:32 ； rs2060247 的引物序列為 SEQ ID No:34, SEQ ID No:35 ； rs2289958 的引物序列為 SEQ ID No:37, SEQ ID No:38 ； rs2960067 的引物序列為 SEQ ID No:40, SEQ ID No:41 ； rs4015379 的引物序列為 SEQ ID No:43, SEQ ID No:44 ； rs4672335 的引物序列為 SEQ ID No:46, SEQ ID No:47 ； rs5752676 的引物序列為 SEQ ID No:49, SEQ ID No:50 ； rs6016431 的引物序列為 SEQ ID No:52, SEQ ID No:53 ； rs6717249 的引物序列為 SEQ ID No:55, SEQ ID No:56 ； rs6749212 的引物序列為 SEQ ID No:58, SEQ ID No:59 ； rs7046153 的引物序列為 SEQ ID No:61、SEQ ID No:62 ； rs7246302 的引物序列為 SEQ ID No:64、SEQ ID No:65 ； rs8045566 的引物序列為 SEQ ID No:67、SEQ ID No:68 ； rs855399 的引物序列為 SEQ ID No:70, SEQ ID No:71 ； rs998454 的引物序列為 SEQ ID No:73, SEQ ID No:74。
3.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物，其特征在于該引物為: rs 10795690 的引物序列為 SEQ ID NO:3 ； rsll205276 的引物序列為 SEQ ID NO:6 ； rsll258964 的引物序列為 SEQ ID NO:9 ； rsll742916 的引物序列為 SEQ ID NO:12 ； rsll757917 的引物序列為 SEQ ID NO:15 ； rsll858823 的引物序列為 SEQ ID NO:18 ； rs 11996459 的引物序列為 SEQ ID NO:21 ；rs 1582931 的引物序列為 SEQ ID NO:24 ; rs 166402 的引物序列為 SEQ ID NO:27 ； rs 17636179 的引物序列為 SEQ ID NO:30 ； rsl7646672 的引物序列為 SEQ ID NO:33 ； rs2060247 的引物序列為 SEQ ID NO:36 ； rs2289958 的引物序列為 SEQ ID NO:39 ； rs2960067 的引物序列為 SEQ ID NO:42 ； rs4015379 的引物序列為 SEQ ID NO:45 ； rs4672335 的引物序列為 SEQ ID NO:48 ； rs5752676 的引物序列為 SEQ ID NO:51 ； rs6016431 的引物序列為 SEQ ID NO:54 ； rs6717249 的引物序列為 SEQ ID NO:57 ； rs6749212 的引物序列為 SEQ ID NO:60 ； rs7046153 的引物序列為 SEQ ID NO:63 ； rs7246302 的引物序列為 SEQ ID NO:66 ； rs8045566 的引物序列為 SEQ ID NO:69 ； rs855399 的引物序列為 SEQ ID NO:72 ； rs998454 的引物序列為 SEQ ID NO:75。
4.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物在制備吸煙成癮輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備吸煙成癮輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物在制備吸煙成癮輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
7.一種吸煙成癮輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測(cè)外周血DNA中rsl0795690、rsll205276、rsll258964、rsll742916、rsll757917、rsll858823、rsll996459、rsl582931、 rsl66402、 rsl7636179、 rsl7646672、 rs2060247、 rs2289958、 rs2960067、rs4015379、 rs4672335、 rs5752676、 rs6016431, rs6717249、 rs6749212、 rs7046153、rs7246302、rs8045566、rs855399 和 rs998454。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的吸煙成癮輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物和/或權(quán)利要求2所述SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述吸煙成癮輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括PCR技術(shù)常用的試劑。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104164427SQ201410351066
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】沈洪兵, 胡志斌, 靳光付, 馬紅霞, 戴俊程, 孫潔 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)