T-dna及其插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組序列的擴(kuò)增引物和鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種T-DNA及其真菌插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組序列的擴(kuò)增引物和鑒定方法。本發(fā)明T-DNA包括左臂、右臂DNA，以及二者之間的多克隆位點(diǎn)和eGFP基因，且該T-DNA具有SEQIDNO.9所示的核苷酸序列，本發(fā)明公開了其載體及構(gòu)建方法；該T-DNA的真菌插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組序列的巢式PCR擴(kuò)增的上游引物對應(yīng)于eGFP基因的左端序列，下游引物對應(yīng)于右臂的左端序列；該右臂側(cè)翼基因組序列的鑒定方法包括基因組DNA提取、酶切處理、純化處理、連接反應(yīng)、巢式PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物鑒定、克隆和測序等步驟。本發(fā)明引物特異性強(qiáng)，能夠快速、準(zhǔn)確、高效、穩(wěn)定、普適性地?cái)U(kuò)增出T-DNA的右臂側(cè)翼基因組DNA序列，大大提高鑒定效率。
【專利說明】T-DNA及其插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組序列的擴(kuò)增引物和鑒 定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種T-DNA及其插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組 序列的擴(kuò)增引物和鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] T-DNA (轉(zhuǎn)移DNA)也叫三螺旋DNA，是指一種由三股ssDNA旋轉(zhuǎn)螺旋形成的一種特 殊結(jié)構(gòu)。T-DNA是農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的片斷，包含三個(gè)重要的基因，當(dāng)整合到宿主細(xì)胞(如雙 子葉植物、真菌等）時(shí)分別誘發(fā)根瘤、opine化合物的合成和抑制細(xì)胞分化。Ti質(zhì)粒因?yàn)樽?身一些優(yōu)點(diǎn)很適合作為導(dǎo)入外源基因的載體；而外基因就是整合到T-DNA上的。農(nóng)桿菌侵 染受體后，Ti質(zhì)粒中的T-DNA區(qū)段脫離質(zhì)粒而整合到受體的染色體上。因此，如果把外源 基因插入T-DNA中，就有可能攜帶進(jìn)入受體并整合到染色體上。
[0003] 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌等轉(zhuǎn)基因生物研究日益增多， T-DNA插入突變等反向遺傳學(xué)技術(shù)已成為研究基因功能的一種重要途徑，而T-DNA插入突 變需要鑒定插入位點(diǎn)。目前，鑒定真菌T-DNA插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組DNA序列常采用 TAIL-PCR或Hi-TAIL-PCR擴(kuò)增技術(shù)，也有采用質(zhì)粒挽救、外加接頭等PCR擴(kuò)增的報(bào)道。但這 些技術(shù)均或因模板處理或因引物不確定性問題而導(dǎo)致擴(kuò)增效率低、重復(fù)性差，甚至呈偶然 性事件而被采用；現(xiàn)有研究中也有個(gè)別采用巢式PCR擴(kuò)增未知序列的報(bào)道，但因沒有找到 合適的限制性酶切位點(diǎn)或合適的引物對，導(dǎo)致其PCR擴(kuò)增效率非常低，這種擴(kuò)增也僅僅作 為一種個(gè)例被米用。
[0004] 綜上可知，當(dāng)前亟需一種更高效、更準(zhǔn)確、更具有普適性的T-DNA插入位點(diǎn)鑒定技 術(shù)，以滿足研究需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種T-DNA，并利用T-DNA區(qū)自身含有的多克隆位 點(diǎn)、限制性內(nèi)切酶選擇確定性和確定引物，再加上在多克隆位點(diǎn)區(qū)右邊界添加的一個(gè)eGFP 基因，通過巢式PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得靶標(biāo)基因組DNA序列，提供一種T-DNA真菌插入位點(diǎn)右 臂側(cè)翼基因組DNA序列的鑒定方法，該方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效、穩(wěn)定、普適性地?cái)U(kuò)增出 T-DNA的右臂側(cè)翼基因組DNA序列，大大提高鑒定基因的效率。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種T-DNA，包括左臂DNA、右臂DNA，以及二者之 間依次的多克隆位點(diǎn)MCS和eGFP基因，該T-DNA具有SEQ ID N0. 9所示的核苷酸序列。
[0007] 本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一種載體，含有上述的T-DNA ;該載體可通過以下步驟構(gòu)建： (1) 以真菌trpC啟動子的潮霉素基因 DNA序列代替植物pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體中 T-DNA左臂區(qū)中CaMV35S啟動子和CaMV35S終止子之間的潮霉素基因 DNA序列； (2) 在T-DNA多克隆位點(diǎn)右邊添加一段eGFP基因。
[0008] 對于上述的載體構(gòu)建方法，所述步驟（1)采用如下具體方法： ① PCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體T-DNA左臂區(qū)潮霉素基因改造，即pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn) 化載體限制性內(nèi)切酶Hpal酶切，去除T-DNA左臂區(qū)CaMV35S啟動子和CaMV35S終止子之間 的潮霉素基因 DNA序列，并對酶切產(chǎn)物切膠回收、酶切產(chǎn)物磷酸化和磷酸化后產(chǎn)物純化處 理，獲得T-DNA左臂區(qū)無潮霉素基因的pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體線性DNA片段； ② 再以含有真菌潮霉素基因的PCB1004載體為模板，采用引物對HPH-F/HPH-R PCR擴(kuò) 增pCB 1004載體的潮霉素基因，并把PCR產(chǎn)物克隆到pMD 19-T載體中，采用Hpal酶切回收潮 霉素克隆 DNA 片段；所述 HPH-F 引物序列為：Hpal 5' -ACGTTAAC GGATCCGTCG ACGTTAACGT ③ 最后，將潮霉素克隆DNA片段與上述無潮霉素基因的pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體線 性DNA片段通過T4連接酶連接，實(shí)現(xiàn)pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體T-DNA左臂區(qū)潮霉素基因 改造。
[0009] 對于上述的載體構(gòu)建方法，所述步驟（2)采用如下具體方法： ①先將上步改造后的PCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體采用限制性內(nèi)切酶Hindlll酶切， 并對酶切產(chǎn)物切膠回收、酶切產(chǎn)物磷酸化和磷酸化后產(chǎn)物純化處理，獲得去磷酸化的具有 Hindlll粘性末端的雙元轉(zhuǎn)化載體線性DNA片段；②再以含有真菌eGFP基因的pHBt2載體 為模板，采用引物對eGFP-F/eGFP-R PCR擴(kuò)增pHBt2載體的eGFP基因，并把PCR產(chǎn)物克隆 至IJ PMD19-T載體中，采用Hindlll酶切回收含有Hindlll粘性末端的eGFP基因克隆DAN片 段；所述 eGFP-F 引物序列為：Hindlll 5' -GAATTGGGTACTCAAATTGGTTC-3';所述 eGFP-R 引物序列為：Hindlll 5' -ATCATCATGCAACATGCATGTAC-3' ； ③最后，將eGFP基因克隆DNA片段與上述具有Hindlll粘性末端的雙元轉(zhuǎn)化載體線 性DNA片段通過T4連接酶連接，實(shí)現(xiàn)T-DNA多克隆位點(diǎn)右臂區(qū)一段eGFP基因添加，即完成 T-DNA區(qū)改造。
[0010] 本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一種上述T-DNA真菌插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組序列的巢式PCR擴(kuò) 增引物，其上游引物對應(yīng)于上述eGFP基因的左端序列，其下游引物對應(yīng)于上述右臂DNA的 左端序列，具體引物序列如下： 第一次擴(kuò)增中引物對的核苷酸序列為：FxRBl:5' -GGCACTGGCC GTCGTTTTAC A-3'， FxLBl：5/ -GAAATTGGGG GTTTCGGAAT GT-3/ ； 第二次擴(kuò)增中引物對的核苷酸序列為：FxRB2:5' -ACGTCGTGAC TGGGAAAACC C-3'， FxLB2:5^ -GGGAACCAATTTGAGTACCCAA-3^ 。
[0011] 本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一種利用上述擴(kuò)增引物對上述T-DNA的真菌插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼 基因組序列的鑒定方法，包括如下步驟： (1)基因組DNA提取：取含有上述特異T-DNA插入的真菌體，采用CTAB法提取基因組 DNA ； (2 )酶切處理：選擇9種與T-DNA多克隆位點(diǎn)相對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶EcoRI、Sac I、 ΚρηΙ、Smal、BamHI、Xbal、SphI、SalI 和 PstI，任選一種單酶切基因組 DNA，然后，再在 75°C 條件下水浴20min，使限制性內(nèi)切酶完全失去活性后備用； (3) 純化處理：將所得酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化； (4) 連接反應(yīng)：將所得純化產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)結(jié)束后，加入體積百分比為 75%的乙醇200μ L，混勻5min，再以相對離心力12000Xg離心10 min后，去除上清液，去鹽 純化DNA,干燥后加入20 μ L去離子水溶解DNA備用； (5) 巢式PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物鑒定： ① 第一次PCR擴(kuò)增：將上步所得連接產(chǎn)物作為模板DNA，進(jìn)行第一次擴(kuò)增反應(yīng)，采用 的 10mmol/L dNTP，1 μ L 的 10 μ mol/L FxLBl，1 μ L 的 10 μ mol/L FxRBl，50 ?200ng 的模 板DNA，并加水補(bǔ)充至25 μ L ;擴(kuò)增反應(yīng)運(yùn)行程序：94°C預(yù)變性30s，94°C變性30s，55°C退 火45s，65°C延伸6min，擴(kuò)增30個(gè)上述循環(huán)反應(yīng)后，再在65°C下延伸lOmin，第一次PCR擴(kuò) 增完成后，產(chǎn)物4-KTC下保存； ② 第二次PCR擴(kuò)增：將第一次所得擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋2000倍后，作為模板DNA進(jìn)行第二 次擴(kuò)增反應(yīng)，采用25yL反應(yīng)體系：5yL的5XPCR buffer，lyL的lU/yL LongAmp Taq DNA 聚合酶，0· 75 μ L 的 10mmol/L dNTP，1 μ L 的 10 μ mol/L FxLB2,1 μ L 的 10 μ mol/L FxRB2, 50?200ng的模板DNA，并加水補(bǔ)充至25 μ L ;擴(kuò)增反應(yīng)運(yùn)行程序：94°C預(yù)變性30s， 94°C變性30s，55°C退火45s，65°C延伸6min，擴(kuò)增30個(gè)上述循環(huán)反應(yīng)后，再在65°C下延伸 10min，第二次PCR擴(kuò)增完成后，產(chǎn)物4-KTC下保存； ③ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定：采用IXTAE電泳緩沖液、lwt%瓊脂糖水平電泳鑒定第一、二次 PCR反應(yīng)產(chǎn)物； (6) 巢式PCR產(chǎn)物的克隆及其T-DNA插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組DNA序列分析：將所得 第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后切膠回收，克隆到pMD19-T載體上并測序，所測得DNA序列經(jīng) 去除載體序列、T-DNA右邊界序列后，即為T-DNA插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組DNA序列。
[0012] 對于上述鑒定方法，步驟（1)中所述CTAB法提取基因組DNA包括以下步驟： ① 稱取菌體〇. 5g，加液氮研磨成粉后，轉(zhuǎn)移至盛放有700 μ L CTAB的2ml離心管中， 65° C保溫lh，再加入700yL氯仿、異戊醇混合溶液，然后，先以300rpm振蕩20min，再以 lOOOOrpm離心10min ;所述氯仿、異戊醇混合溶液中氯仿與異戊醇體積比為24:1 ; ② 離心后吸取上清液，再加入與其等體積的上述氯仿、異戊醇混合溶液，然后，先以 300rpm 震蕩 20min，再以 12000rpm 離心 10min ; ③ 離心后吸取上步所得上清液，再加入與其等體積異丙醇混合均勻，然后，先冰浴沉淀 20min，再以 12000rpm 離心 10min ; ④ 離心后去除上清液，加入1000 μ L體積百分比為70%的乙醇水溶液，洗滌沉淀，再以 12000rpm離心10min后，去除上清液，干燥沉淀，即得基因組DNA，加入80 μ L ddH20溶解備 用。 對于上述的鑒定方法，步驟（2)所述酶切采用50 μ L酶切反應(yīng)體系：1U/μ L restriction enzyme 1 μ L，10Xbuffer 5 μ L，基因組 DNA 1-20 μ g，加去離子水補(bǔ)充至 50 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)椋夯蚪MDNA在37°C酶切4h。 對于上述鑒定方法，步驟（3)中的純化可采用Axyprep DNA清潔試劑盒純化，包括以下 步驟： ① 在酶切反應(yīng)液中，加入其3倍體積的Buffer PCR-A，混勻后轉(zhuǎn)移到制備管中，再將制 備管置于2ml離心管中，以相對離心力12000 Xg離心lmin后，棄濾液； ② 將制備管置回2ml離心管，加入700yL Buffer W2,再以相對離心力12000Xg離心 1 min后，棄濾液； ③ 再次將制備管置回2 ml離心管，加入400yL Buffer W2,再以相對離心力12000Xg 離心1 min ; ④ 將制備管置于潔凈的1.5 ml離心管中，在制備管膜中央加入25-30 μ L Eluent或去 尚子水，室溫靜直1 min后，再以相對尚;L·、力12000Xg尚;L·、1 min洗脫DNA。 對于上述的鑒定方法，步驟（4)所述連接反應(yīng)采用30 μ L反應(yīng)體系：純化DNA 20 μ L， 10ΧΤ4 Buffer 3yL，T4 ligase lyL，ddH20 6 yL;反應(yīng)程序?yàn)椋?6°C條件下連接 4h。 對于上述的鑒定方法，步驟（5)所述的擴(kuò)增反應(yīng)中，反應(yīng)前先混勻反應(yīng)液，快速離心收 集反應(yīng)液至離心管底部，反應(yīng)時(shí)采用熱蓋或者樣品頂部添加石蠟油防止揮發(fā)。 對于上述的鑒定方法，步驟（6)所述切膠回收采用Axyprep DNA凝膠回收試劑盒回收 擴(kuò)增產(chǎn)物，具體包括以下步驟： ① 在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎凝 膠；稱重凝膠，以lmg=l μ L計(jì)，以所稱重量數(shù)作為1個(gè)凝膠體積； ② 在凝膠中加入3倍凝膠體積的buffer DE-A，混合均勻后于75°C加熱，每2-3min 間斷混合，直至凝膠塊完全融化； ③ 再加入0.5倍buffer DE-A體積的buffer DE-B，混合均勻；當(dāng)分離的DNA片段小于 400bp時(shí)，需要再加入1個(gè)凝膠體積的異丙醇； ④ 吸取上步所得混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，置于試劑盒內(nèi)提供的2ml離心管中，以 相對離心力12000 Xg離心1 min，棄濾液； ⑤ 將制備管回置2ml離心管，加入500yL buffer W1，以相對離心力12000Xg離心 30s，棄濾液； ⑥ 將制備管回置2ml離心管，加700yL buffer W2,以相對離心力12000Xg離心30s， 棄濾液；再重復(fù)本步驟一次； ⑦ 將制備管回置2ml離心管，以相對離心力12000Xg離心lmin ; ⑧ 將制備管置于潔凈的1.5 ml離心管中，在制備管膜中央加25-30 μ L Eluent或去離 子水，室溫靜置1 min后，以相對離心力12000Xg離心1 min,洗脫DNA。
[0013] 對于上述的鑒定方法，步驟（6)所述克隆、測序包括以下步驟： ① 在200μ L離心管中配制5μ L DNA溶液，其中PMD19-T載體1μ L，PCR回收產(chǎn)物0. 1? 0. 3 pmol，補(bǔ)充去離子水至5yL; ② 加入5 μ L的solution I，16°C條件下反應(yīng)4h ; ③ 將所得連接反應(yīng)液加入l〇〇yL JM109感受態(tài)細(xì)胞中，在冰中放置30min ;然后，在 42°C加熱45s后，再在冰中放置1 min ; ④ 加入890 μ L S0C培養(yǎng)基，37°C條件下振蕩培養(yǎng)60min后，再在含有X-Gal、IPTG、Amp 的LB平板上培養(yǎng)，直至形成單菌落，計(jì)數(shù)白色和藍(lán)色菌落； ⑤ 挑選白色菌落，采用M13 primers引物對，PCR擴(kuò)增插入DNA片段，確認(rèn)載體中插入 片段的長度大??； ⑥ PCR產(chǎn)物克隆鑒定正確后，進(jìn)行測序； ⑦ 從測得DNA序列中去除pMD19-T載體序列和T-DNA右邊界序列（CGTTACCCAA CTTAATCGCC TTGCAGCACA TCCCCCTTTC GCCAGCTGGC GTAATAGCGA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CTGGGCGAAT GCTAGAGCAG CTTGAGCTTG GATCAGATTG TCGTTTCCCG CCTTCAGTTT AAACTATCAG TGTTTGA)后，所得到的序列即為T-DNA插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組 DNA序列。
[0014] 本發(fā)明的積極有益效果： 1.本發(fā)明設(shè)計(jì)了能特異性鑒定真菌T-DNA插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組DNA序列的引物， 得以建立本發(fā)明的巢式PCR分子檢測技術(shù)；兩對引物FxRBl/FxLBl和FxRB2/FxLB2具有嵌 套性，F(xiàn)xRBl/FxLBl這對引物擴(kuò)增產(chǎn)物大于FxRB2/FxLB2擴(kuò)增產(chǎn)物，即FxRBl/FxLBl引物對 居于外側(cè)，F(xiàn)xRB2/FxLB2引物對居于內(nèi)側(cè)；因而，以FxRBl/FxLBl為引物的PCR產(chǎn)物可以作 為FxRB2/FxLB2引物對的模板。
[0015] 2.現(xiàn)有傳統(tǒng)的T-DNA中不含eGFP，因而其多克隆位點(diǎn)與T-DNA右臂區(qū)僅僅300bp， 所設(shè)計(jì)的對擴(kuò)增引物僅位于右臂區(qū)，引物過于集中，長期以來本領(lǐng)域研究者進(jìn)行過無數(shù)次 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)均沒有獲得目的擴(kuò)增產(chǎn)物，而本發(fā)明在T-DNA右臂區(qū)加入eGFP基因后，多克隆位 點(diǎn)與T-DNA右臂區(qū)已經(jīng)達(dá)2000bp，所設(shè)計(jì)的上游引物位于多克隆位點(diǎn)附近的eGFP區(qū)，下游 引物位于T-DNA右臂區(qū)，大大提高了 PCR擴(kuò)增效率，即添加完成后形成一個(gè)有利于右臂基因 組DNA序列獲得的T-DNA。
[0016] 3.本發(fā)明方法克服了常規(guī)TALI-PCR方法以一邊是特異性引物、一邊是隨機(jī)引物 所引起的克隆產(chǎn)物的不確定性、反應(yīng)程序復(fù)雜，重復(fù)性低，同時(shí)假陽性出現(xiàn)頻率高的缺點(diǎn)； 又克服了外加接頭所導(dǎo)致的過高的經(jīng)濟(jì)花費(fèi)，及其假陽性PCR產(chǎn)物的存在；還克服了選擇 酶切位點(diǎn)在T-DNA區(qū)外，相同的酶切位點(diǎn)在基因組中不確定性和分散性，相同的酶切位點(diǎn) 間距離很遠(yuǎn)，超出PCR所用TaqE擴(kuò)增DNA片段的能力，導(dǎo)致PCR的失敗； 4.本發(fā)明巢式PCR方法利用所具有的多克隆位點(diǎn)及其T-DNA右臂區(qū)域的DNA序列設(shè)計(jì) 出的兩對嵌套式特異性引物，能夠快速、準(zhǔn)確、高效、穩(wěn)定、普適性地?cái)U(kuò)增出T-DNA右臂側(cè)翼 基因組DNA序列，大大提高了 T-DNA標(biāo)記基因鑒定的效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明鑒定方法的操作流程圖。
[0018] 圖2為T-DNA區(qū)多克隆位點(diǎn)、引物、左臂、右臂位置示意圖，其中，LB為T-DNA左臂， MCS為多克隆位點(diǎn)區(qū)，eGFP為外源導(dǎo)入的eGFP基因；RB為T-DNA右臂，箭頭1、2、3、4分別 為引物 FxLB2、FxLB 1、FxRB 1 和 FxRB2。
[0019] 圖3、4為本發(fā)明所設(shè)計(jì)的兩對特異性引物在T-DNA區(qū)的位置圖及其多克隆位點(diǎn) 至右邊界DNA序列，圖4為圖3的續(xù)圖。其中，左側(cè)空白區(qū)域?yàn)槎嗫寺∥稽c(diǎn)區(qū)（MCS)DNA;中 間淺色陰影區(qū)為eGFP基因 DNA ;右側(cè)空白區(qū)域?yàn)門-DNA右臂DNA ;深色陰影區(qū)（從前至后） 依次對應(yīng)引物 FxLB2、FxLBl、FxRBl 和 FxRB2。
[0020] 圖5為本發(fā)明方法中Axyprep DNA清潔試劑盒及凝膠回收試劑盒操作流程圖。
[0021] 圖6稻瘟病菌T-DNA插入突變體T-DNA右側(cè)翼基因組DNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖： 左為A46B1菌株采用EcoRI酶切處理后PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；右為A15A6菌株采用PstI酶切 處理后PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果（Marker、一輪PCR產(chǎn)物、二輪PCR產(chǎn)物)。
[0022] 圖7西瓜尖孢鐮刀菌T-DNA插入突變體T-DNA右側(cè)翼基因組DNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物電 泳圖：左為T46B1菌株采用BamHI酶切處理后PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，右為M15A6菌株采用ΚρηΙ 酶切處理后PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果（Marker、一輪PCR產(chǎn)物、二輪PCR產(chǎn)物)。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0024] 實(shí)施例1 本實(shí)施例設(shè)計(jì)一種T-DNA，包括左臂DNA、右臂DNA，以及二者之間依次的多克隆位點(diǎn) MCS和eGFP基因，該T-DNA具有SEQ ID N0. 9所示的核苷酸序列。
[0025] 實(shí)施例2 設(shè)計(jì)一種含實(shí)施例1所述T-DNA的載體，其構(gòu)建方法包括以下步驟： (1)以真菌trpC啟動子的潮霉素基因 DNA序列代替植物pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體 中T-DNA左臂區(qū)中CaMV35S啟動子和CaMV35S終止子之間的潮霉素基因 DNA序列，具體為： 首先，PCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體T-DNA左臂區(qū)潮霉素基因改造，S卩pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化 載體限制性內(nèi)切酶Hpal酶切，去除T-DNA左臂區(qū)CaMV35S啟動子和CaMV35S終止子之間的 潮霉素基因 DNA序列，并對酶切產(chǎn)物切膠回收、酶切產(chǎn)物磷酸化和磷酸化后產(chǎn)物純化處理， 獲得T-DNA左臂區(qū)無潮霉素基因的pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體線性DNA片段；隨之，以含有 真菌潮霉素基因的PCB1004載體為模板，采用引物對HPH-F/HPH-R PCR擴(kuò)增pCB1004載體 的潮霉素基因，并把PCR產(chǎn)物克隆到PMD19-T載體中，采用Hpal酶切回收潮霉素克隆DNA 片段；最后，將潮霉素克隆DNA片段與上述無潮霉素基因的pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體線性 DNA片段通過T4連接酶連接，實(shí)現(xiàn)pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體T-DNA左臂區(qū)潮霉素基因改 造；真菌啟動子的潮霉素基因序列如SEQ ID N0. 10所示，其中序列1?385為TrpC啟動子， 序列386?1408為潮霉素編碼區(qū)序列，序列1409?1474為終止子區(qū)。
[0026] (2)在T-DNA多克隆位點(diǎn)右邊添加一段eGFP基因（如SEQ ID N0. 11所示)，具體為： 首先，將上步改造后的PCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體采用限制性內(nèi)切酶HindllI酶切，并對酶 切產(chǎn)物切膠回收、酶切產(chǎn)物磷酸化和磷酸化后產(chǎn)物純化處理，獲得去磷酸化的具有Hindlll 粘性末端的雙元轉(zhuǎn)化載體線性DNA片段；隨之，以含有真菌eGFP基因的pHBt2載體為模 板，采用引物對eGFP-F/eGFP-R PCR擴(kuò)增pHBt2載體的eGFP基因，并把PCR產(chǎn)物克隆到 PMD19-T載體中，采用HindllI酶切回收含有HindllI粘性末端的eGFP基因克隆DAN片段； 最后，將eGFP基因克隆DNA片段與上述具有HindllI粘性末端的雙元轉(zhuǎn)化載體線性DNA片 段通過T4連接酶連接，實(shí)現(xiàn)T-DNA多克隆位點(diǎn)右臂區(qū)一段eGFP基因添加，即完成T-DNA區(qū) 改造。
[0027] 實(shí)施例3 本實(shí)施例設(shè)計(jì)一種實(shí)施例1所述T-DNA真菌插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組序列的巢式PCR 擴(kuò)增引物，其上游引物對應(yīng)于所述eGFP基因的左端序列，其下游引物對應(yīng)于所述右臂DNA 的左端序列，具體引物序列如下： 第一次擴(kuò)增中引物對的核苷酸序列為：FxRBl:5' -GGCACTGGCC GTCGTTTTAC A-3'， FxLBl ：5; -GAAATTGGGG GTTTCGGAAT GT-3/ ； 第二次擴(kuò)增中引物對的核苷酸序列為：FxRB2:5' -ACGTCGTGAC TGGGAAAACC C-3'， FxLB2:5^ -GGGAACCAATTTGAGTACCCAA-3^ 。
[0028] 實(shí)施例4 利用實(shí)施例2所述引物對實(shí)施例1所述T-DNA的稻瘟病菌插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組 DNA序列的進(jìn)行鑒定，包括如下步驟： (1) 基因組DNA提?。喝『刑禺怲-DNA插入的稻瘟病菌A46B1菌株，采用CTAB法提 取基因組DNA ; ① 稱取稻瘟病菌菌體0. 5g，加液氮研磨成粉后，轉(zhuǎn)移至盛放有700 μ L CTAB的2ml離心 管中，65° C保溫lh，再加入700yL氯仿、異戊醇混合溶液，然后，先以300rpm振蕩20min， 再以lOOOOrpm離心lOmin ;所述氯仿、異戊醇混合溶液中氯仿與異戊醇體積比為24:1 ; ② 離心后吸取上清液，再加入與其等體積的上述氯仿、異戊醇混合溶液，然后，先以 300rpm 震蕩 20min，再以 12000rpm 離心 lOmin ; ③ 離心后吸取上步所得上清液，再加入與其等體積異丙醇混合均勻，然后，先冰浴沉淀 20min，再以 12000rpm 離心 lOmin ; ④ 離心后去除上清液，加入1000 μ L體積百分比為70%的乙醇水溶液，洗滌沉淀，再以 12000rpm離心lOmin后，去除上清液，干燥沉淀，即得基因組DNA，加入80 μ L ddH20溶解備 用。 (2) 酶切處理：選擇與T-DNA多克隆位點(diǎn)相對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶EcoRI單酶切基因組 DNA，然后，再在75°C條件下水浴20min，使限制性內(nèi)切酶完全失去活性后備用；所述酶切采 用 50 μ L 酶切反應(yīng)體系：1U/μ L restriction enzyme 1 μ L，10 X buffer 5 μ L，基因組 DNA 1-20 μ g，加去離子水補(bǔ)充至50 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)椋夯蚪MDNA在37°C酶切4h。 (3) 純化處理：將所得酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，采用Axypr印DNA清潔試劑盒純化，包括以 下步驟： ① 在酶切反應(yīng)液中，加入其3倍體積的Buffer PCR-A，混勻后轉(zhuǎn)移到制備管中，再將制 備管置于2ml離心管中，以相對離心力12000Xg離心lmin后，棄濾液； ② 將制備管置回2ml離心管，加入700 μ L Buffer W2,再以相對離心力12000 Xg離心 1 min后，棄濾液； ③ 再次將制備管置回2 ml離心管，加入400yL Buffer W2,再以相對離心力12000Xg 離心1 min ; ④ 將制備管置于潔凈的1.5 ml離心管中，在制備管膜中央加入25-30 μ L Eluent或去 尚子水，室溫靜直1 min后，再以相對尚;L·、力12000Xg尚;L·、1 min洗脫DNA。 (4) 連接反應(yīng)：將所得純化產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)結(jié)束后，加入體積百分比為 75%的乙醇200μ L，混勻5min，再以相對離心力12000Xg離心10 min后，去除上清液，去鹽 純化DNA，干燥后加入20 μ L去離子水溶解DNA備用；所述連接反應(yīng)采用30 μ L反應(yīng)體系： 純化 DNA 20yL，10XT4 Buffer 3yL，T4 ligase lyL，ddH20 6 yL;反應(yīng)程序?yàn)椋?6°C條 件下連接4h。 (5) 巢式PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物鑒定： ①第一次PCR擴(kuò)增：將上步所得連接產(chǎn)物作為模板DNA，進(jìn)行第一次擴(kuò)增 反應(yīng)，引物對核苷酸序列為：FxRBl :5 ' -GGCACTGGCCGTCGTTTTACA-3 '，F(xiàn)xLBl : 5 ' -GAAATTGGGGGTTTCGGAATGT-3 '，采用 25 μ L 反應(yīng)體系：5 μ L 的 5 X PCR buffer，1 μ L 的 lU/yL LongAmp Taq DNA聚合酶，0.75yL 的 10mmol/L dNTP，lyL 的 lOymol/L FxLBl， 1 μ L的10 μ mol/L FxRBl，50?200ng的模板DNA，并加水補(bǔ)充至25 μ L ;擴(kuò)增反應(yīng)運(yùn)行程 序：94°C預(yù)變性30s，94°C變性30s，55°C退火45s，65°C延伸6min，擴(kuò)增30個(gè)上述循環(huán)反應(yīng) 后，再在65°C下延伸lOmin，第一次PCR擴(kuò)增完成后，產(chǎn)物4-10°C下保存； ② 第二次PCR擴(kuò)增：將第一次所得擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋2000倍后，作為模板DNA進(jìn)行第 二次擴(kuò)增反應(yīng)，引物對核苷酸序列為：FxRB2 :5 ' -ACGTCGTGACTGGGAAAACCC-3 '，F(xiàn)xLB2 : 5' -GGGAACCAATTTGAGTA -CCCAA-3，，采用 25 μ L 反應(yīng)體系：5 μ L 的 5XPCR buffer，1 μ L 的川/^1^1^〇叩六1^丁&9〇嫩聚合酶，0.75 4 1^的10臟〇1/1(1階13，14 1^的1(^111〇1/1卩叉1^2， 1 μ L的10 μ mol/L FxRB2, 50?200ng的模板DNA，并加水補(bǔ)充至25 μ L ;擴(kuò)增反應(yīng)運(yùn)行程 序：94°C預(yù)變性30s，94°C變性30s，55°C退火45s，65°C延伸6min，擴(kuò)增30個(gè)上述循環(huán)反應(yīng) 后，再在65°C下延伸lOmin，第二次PCR擴(kuò)增完成后，產(chǎn)物4-KTC下保存； 擴(kuò)增反應(yīng)前先混勻反應(yīng)液，快速離心收集反應(yīng)液至離心管底部，反應(yīng)時(shí)可采用熱蓋或 者樣品頂部添加石蠟油防止揮發(fā)； ③ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定：采用IX TAE電泳緩沖液、lwt%瓊脂糖水平電泳鑒定第一、二次 PCR反應(yīng)產(chǎn)物，電泳結(jié)果見圖6 ; (6)巢式PCR產(chǎn)物的克隆及其T-DNA插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組DNA序列分析：將所得 第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后切膠回收，克隆到pMD19-T載體上并測序，所測得DNA序列經(jīng) 去除載體序列、T-DNA右邊界序列后，即為T-DNA插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組DNA序列。
[0029] 所述切膠回收采用Axyprep DNA凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物，具體包括以下步 驟： ① 在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎凝 膠；稱重凝膠，以lmg=l μ L計(jì)，以所稱重量數(shù)作為1個(gè)凝膠體積； ② 在凝膠中加入3倍凝膠體積的buffer DE-A，混合均勻后于75°C加熱，每2-3min 間斷混合，直至凝膠塊完全融化； ③ 再加入0.5倍buffer DE-A體積的buffer DE-B，混合均勻；當(dāng)分離的DNA片段小于 400bp時(shí)，需要再加入1個(gè)凝膠體積的異丙醇； ④ 吸取上步所得混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，置于試劑盒內(nèi)提供的2ml離心管中，以 相對離心力12000 Xg離心1 min，棄濾液； ⑤ 將制備管回置2ml離心管，加入500yL buffer W1，以相對離心力12000Xg離心 30s，棄濾液； ⑥ 將制備管回置2ml離心管，加700yL buffer W2,以相對離心力12000Xg離心30s， 棄濾液；再重復(fù)本步驟一次； ⑦ 將制備管回置2ml離心管，以相對離心力12000Xg離心lmin ; ⑧ 將制備管置于潔凈的1.5 ml離心管中，在制備管膜中央加25-30 μ L Eluent或去離 子水，室溫靜置1 min后，以相對離心力12000Xg離心1 min,洗脫DNA。
[0030] 所述克隆、測序包括以下步驟： (1) 在200 μ L離心管中配制5 μ L DNA溶液，其中PMD19-T載體1 μ L，PCR回收產(chǎn)物 0. 1?0. 3 pmol，補(bǔ)充去離子水至5 μ L ; (2) 加入5yL的solution I，16°C條件下反應(yīng)4h ; (3) 將所得連接反應(yīng)液加入100μ L JM109感受態(tài)細(xì)胞中，在冰中放置30min ;然后，在 42°C加熱45s后，再在冰中放置1 min ; (4) 加入890yL S0C培養(yǎng)基，37°C條件下振蕩培養(yǎng)60min后，再在含有X-Gal、IPTG、 Amp的LB平板上培養(yǎng)，直至形成單菌落，計(jì)數(shù)白色和藍(lán)色菌落； (5) 挑選白色菌落，采用M13 primers引物對，PCR擴(kuò)增插入DNA片段，確認(rèn)載體中插入 片段的長度大??； (6) PCR產(chǎn)物克隆鑒定正確后，進(jìn)行測序； (7 )從測得DNA序列中去除pMD 19-T載體序列和T-DNA右邊界序列（CGTTACCCAA CTTAATCGCC TTGCAGCACA TCCCCCTTTC GCCAGCTGGC GTAATAGCGA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CTGGGCGAAT GCTAGAGCAG CTTGAGCTTG GATCAGATTG TCGTTTCCCG CCTTCAGTTT AAACTATCAG TGTTTGA)后，所得到的序列即為T-DNA插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組 DNA序列。
[0031] 實(shí)施例5 利用實(shí)施例3所述引物對實(shí)施例1所述T-DNA的稻瘟病菌插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組 DNA序列的進(jìn)行鑒定：提取含有特異T-DNA插入的稻瘟病菌A15A6菌株，并采用限制性內(nèi)切 酶PstI單酶切處理，其它步驟與實(shí)施例4相同。
[0032] 實(shí)施例6 利用實(shí)施例3所述引物對實(shí)施例1所述T-DNA的西瓜尖孢鐮刀菌插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基 因組DNA序列的進(jìn)行鑒定：提取含有特異T-DNA插入的西瓜尖孢鐮刀菌T46B1菌株，并采用 限制性內(nèi)切酶BamHI單酶切處理，其它步驟與實(shí)施例4相同。
[0033] 實(shí)施例7 利用實(shí)施例3所述引物對實(shí)施例1所述T-DNA的西瓜尖孢鐮刀菌插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基 因組DNA序列的進(jìn)行鑒定：提取含有特異T-DNA插入的西瓜尖孢鐮刀菌M15A6菌株，并采用 限制性內(nèi)切酶ΚρηΙ單酶切處理，其它步驟與實(shí)施例4相同。
[0034] 本發(fā)明并不局限于上述【具體實(shí)施方式】，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可據(jù)此做出多種變化， 但任何與本發(fā)明等同或者類似的變化都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種T-DNA，包括左臂DNA、右臂DNA，其特征在于：在左、右臂DNA之間還依次包括多 克隆位點(diǎn)MCS和eGFP基因，該T-DNA具有SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列。
2. -種載體,含有權(quán)利要求1所述的T-DNA。
3. -種權(quán)利要求2所述載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 以真菌trpC啟動子的潮霉素基因 DNA序列代替植物pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體中 T-DNA左臂區(qū)中CaMV35S啟動子和CaMV35S終止子之間的潮霉素基因 DNA序列； (2) 在T-DNA多克隆位點(diǎn)右邊添加一段eGFP基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟（1)采用如下具體方 法： ① PCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體T-DNA左臂區(qū)潮霉素基因改造，S卩pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn) 化載體限制性內(nèi)切酶Hpal酶切，去除T-DNA左臂區(qū)CaMV35S啟動子和CaMV35S終止子之間 的潮霉素基因 DNA序列，并對酶切產(chǎn)物切膠回收、酶切產(chǎn)物磷酸化和磷酸化后產(chǎn)物純化處 理，獲得T-DNA左臂區(qū)無潮霉素基因的pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體線性DNA片段； ② 再以含有真菌潮霉素基因的PCB1004載體為模板，采用引物對HPH-F/HPH-R PCR擴(kuò) 增PCB1004載體的潮霉素基因，并把PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體中，采用Hpal酶切回收潮 霉素克隆DNA片段；所述HPH-F 引物序列為：Hpal 5' -GGATCCGTCGACGTTAACGTCGAG-3'; ③ 最后，將潮霉素克隆DNA片段與上述無潮霉素基因的pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體線 性DNA片段通過T4連接酶連接，實(shí)現(xiàn)pCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體T-DNA左臂區(qū)潮霉素基因 改造。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟（2)采用如下具體方 法： ① 先將上步改造后的PCAMBIA1300雙元轉(zhuǎn)化載體采用限制性內(nèi)切酶Hindlll酶切， 并對酶切產(chǎn)物切膠回收、酶切產(chǎn)物磷酸化和磷酸化后產(chǎn)物純化處理，獲得去磷酸化的具有 Hindlll粘性末端的雙元轉(zhuǎn)化載體線性DNA片段； ② 再以含有真菌eGFP基因的pHBt2載體為模板，采用引物對eGFP-F/eGFP-R PCR擴(kuò)增 pHBt2載體的eGFP基因，并把PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體中，采用Hindlll酶切回收含 有Hindlll粘性末端的eGFP基因克隆DAN片段；所述eGFP-F引物序列為：5^ -ACAAGCTT GAATTGGGTA CTCAAATTGG TTC-3' ；所述 eGFP-R 引物序列為：5' -ACAAGCTT ATCATCATGC AACATGCATG TAC-3;； ③ 最后，將eGFP基因克隆DNA片段與上述具有Hindlll粘性末端的雙元轉(zhuǎn)化載體線 性DNA片段通過T4連接酶連接，實(shí)現(xiàn)T-DNA多克隆位點(diǎn)右臂區(qū)一段eGFP基因添加，即完成 T-DNA區(qū)改造。
6. -種權(quán)利要求1所述T-DNA的真菌插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組序列的巢式PCR擴(kuò)增引 物，其特征在于：所述巢式PCR的上游引物對應(yīng)于權(quán)利要求1所述eGFP基因的左端序列，所 述巢式PCR的下游引物對應(yīng)于權(quán)利要求1所述右臂DNA的左端序列，具體引物序列如下 ： 第一次擴(kuò)增引物對的核苷酸序列為fxRBlj' -GGCACTGGCC GTCGTTTTAC A-3'， FxLBl：5/ -GAAATTGGGG GTTTCGGAAT GT-3/ ； 第二次擴(kuò)增引物對的核苷酸序列為：FxRB2 :5 ' -ACGTCGTGAC TGGGAAAACC C-3 '， FxLB2:5^ -GGGAACCAATTTGAGTACCCAA-3'。
7. -種利用權(quán)利要求6所述擴(kuò)增引物對權(quán)利要求1所述T-DNA真菌插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼 基因組序列的鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟： (1)基因組DNA提?。喝『袡?quán)利要求1所述特異T-DNA插入的真菌體，采用CTAB法 提取基因組DNA ; (2 )酶切處理：選擇9種與T-DNA多克隆位點(diǎn)相對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶EcoRI、Sac I、 Kpnl、Smal、BamHI、Xbal、SphI、Sail 和 PstI，任選一種單酶切基因組 DNA，然后，再在 75°C 條件下水浴20min，使限制性內(nèi)切酶完全失去活性后備用； (3) 純化處理：將所得酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化處理； (4) 連接反應(yīng)：將所得純化產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)結(jié)束后，加入體積百分比為 75%的乙醇200μ L，混勻5min，再以相對離心力12000Xg離心10 min后，去除上清液，去鹽 純化DNA,干燥后加入20 μ L去離子水溶解DNA備用； (5) 巢式PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物鑒定： ① 第一次PCR擴(kuò)增：將上步所得連接產(chǎn)物作為模板DNA，進(jìn)行第一次擴(kuò)增反應(yīng)，采用 的 10mmol/L dNTP，1 μ L 的 10 μ mol/L FxLBl，1 μ L 的 10 μ mol/L FxRBl，50 ?200ng 的模 板DNA，并加水補(bǔ)充至25 μ L ;擴(kuò)增反應(yīng)運(yùn)行程序：94°C預(yù)變性30s，94°C變性30s，55°C退 火45s，65°C延伸6min，擴(kuò)增30個(gè)上述循環(huán)反應(yīng)后，再在65°C下延伸10min，第一次PCR擴(kuò) 增完成后，產(chǎn)物4-KTC下保存； ② 第二次PCR擴(kuò)增：將第一次所得擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋2000倍后，作為模板DNA進(jìn)行第二 次擴(kuò)增反應(yīng)，采用25yL反應(yīng)體系：5yL的5XPCR buffer，lyL的lU/yL LongAmp Taq DNA 聚合酶，0· 75 μ L 的 10mmol/L dNTP，1 μ L 的 10 μ mol/L FxLB2,1 μ L 的 10 μ mol/L FxRB2, 50?200ng的模板DNA，并加水補(bǔ)充至25 μ L ;擴(kuò)增反應(yīng)運(yùn)行程序：94°C預(yù)變性30s， 94°C變性30s，55°C退火45s，65°C延伸6min，擴(kuò)增30個(gè)上述循環(huán)反應(yīng)后，再在65°C下延伸 10min，第二次PCR擴(kuò)增完成后，產(chǎn)物4-KTC下保存； ③ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定：采用1XTAE電泳緩沖液、1%瓊脂糖水平電泳鑒定第一、二次PCR 反應(yīng)產(chǎn)物； (6) 巢式PCR產(chǎn)物的克隆及其T-DNA插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組DNA序列分析：將所得 第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后切膠回收，克隆到pMD19-T載體上并測序，所測得DNA序列經(jīng) 去除載體序列、T-DNA右邊界序列后，即為T-DNA插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組DNA序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的鑒定方法，其特征在于，步驟（2)所述酶切采用50 μ L酶切反 應(yīng)體系：1U/μ L restriction enzyme 1 μ L，10 X buffer 5 μ L，基因組 DNA 1-20 μ g，加去 離子水補(bǔ)充至50 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)椋夯蚪MDNA在37°C酶切4h。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的鑒定方法，其特征在于，步驟（4)所述連接反應(yīng)采用30 μ L反 應(yīng)體系：純化產(chǎn)物 20yL，10XT4 Buffer 3yL，T4 ligase lyL，ddH20 6 yL;反應(yīng)程序?yàn)椋?16°C條件下連接4h。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的鑒定方法，其特征在于，步驟（6)所述克隆、測序包括以下步 驟： ①在200μ L離心管中配制5μ L DNA溶液，其中PMD19-T載體1μ L，PCR回收產(chǎn)物0. 1? 0. 3 pmol，補(bǔ)充去離子水至5yL; ② 加入5 μ L的solution I，16°C條件下反應(yīng)4h ; ③ 將所得連接反應(yīng)液加入l〇〇yL JM109感受態(tài)細(xì)胞中，在冰中放置30min ;然后，在 42°C加熱45s后，再在冰中放置1 min ; ④ 加入890 μ L S0C培養(yǎng)基，37°C條件下振蕩培養(yǎng)60min后，再在含有X-Gal、IPTG、Amp+ 的LB平板上培養(yǎng)，直至形成單菌落，計(jì)數(shù)白色和藍(lán)色菌落； ⑤ 挑選白色菌落，采用M13 primers引物對，PCR擴(kuò)增插入DNA片段，確認(rèn)載體中插入 片段的長度大??； ⑥ PCR產(chǎn)物克隆鑒定正確后，進(jìn)行測序； ⑦ 從測得DNA序列中去除pMD19-T載體序列和T-DNA右邊界序列后，所得到的序列即 為T-DNA插入位點(diǎn)右臂側(cè)翼基因組DNA序列。
【文檔編號】C12N15/66GK104152442SQ201410336970
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】梁慎, 徐小利, 趙衛(wèi)星, 常高正, 李曉慧, 程丹丹 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所