用于檢測(cè)牛cwc15基因隱性致死突變的引物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于檢測(cè)牛CWC15基因隱性致死突變的特異性引物，包括：上游引物5’-GGGACTGAGGATGAAGTTGC-3’和下游引物5’-GGTTGGGAATACGGAAAGGT-3’。本發(fā)明還提供利用所述引物或含有所述引物的試劑盒檢測(cè)牛CWC15基因隱性致死突變的方法。本發(fā)明首次建立了基于PCR-RFLP技術(shù)的CWC15基因隱性致死突變的分子檢測(cè)方法。與已報(bào)道的基于SNP單倍型的檢測(cè)方法(VanRaden等，2011)相比，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。另外，本發(fā)明在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，巧妙利用了致死突變位點(diǎn)下游715bp處的另外一個(gè)相同的酶切位點(diǎn)，所設(shè)計(jì)的PCR引物能擴(kuò)增包含這兩個(gè)酶切位點(diǎn)的片段，且酶切后的條帶能夠通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳直接區(qū)分，避免了因酶切不完全或酶切反應(yīng)失敗而導(dǎo)致的假陽(yáng)性，從而確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)牛CWC15基因隱性致死突變的引物及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及家畜遺傳缺陷的分子診斷技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及一種用于檢測(cè)牛CWC15基因隱性致死突變的特異性引物及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]娟珊牛是一個(gè)著名的小型乳用牛品種，具有乳成分高、耐熱性好、綜合效益高等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，我國(guó)一些大型奶業(yè)企業(yè)，陸續(xù)進(jìn)口娟珊牛，豐富現(xiàn)有奶牛品種資源，生產(chǎn)特色牛奶。然而，由于娟珊牛在世界范圍內(nèi)都是一個(gè)小品種，種質(zhì)來(lái)源較為狹窄，群體近交程度普遍較高。據(jù)報(bào)道，美國(guó)1990年之后出生的荷斯坦牛平均近交系數(shù)為6.0%，娟珊牛為8.2%(VanRaden等，2011);在加拿大，2000 - 2007出生的荷斯坦牛平均近交系數(shù)為8 %，但娟姍牛達(dá)到14% (Stachowicz等，2011)。隨著近交程度的增加，群體內(nèi)遺傳缺陷基因快速擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增大。
[0003]2011年,美國(guó)農(nóng)業(yè)部家畜遺傳改良實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家VanRaden等首先發(fā)現(xiàn)在娟珊牛中存在一種隱性致死遺傳缺陷單倍型(JHl)，該單倍型純合后，導(dǎo)致母牛因胚胎早期死亡而流產(chǎn)，攜帶該遺傳缺陷的種公牛的配種妊娠率降低3.7% (VanRaden等，2011)。之后，Sonstegard等(2013)確定其分子機(jī)理為，牛15號(hào)染色體的CWC15基因編碼區(qū)內(nèi)的C — T突變，導(dǎo)致編碼氨基酸從精氨酸突變?yōu)榻K止密碼，造成其蛋白產(chǎn)物由原來(lái)的231個(gè)氨基酸減少到54個(gè)氨基酸。因CWC15基因在mRNA剪接中具有重要功能，故該突變最終導(dǎo)致胚胎發(fā)育早期死亡。系譜追溯發(fā)現(xiàn)，JHl致死單倍型最早可以追溯到1962年出生的美國(guó)公牛Observer Chocolate Soldier (Sonstegard等,2013)。該公牛家系在美國(guó)的娟珊牛群體中具有重要影響，據(jù)統(tǒng)計(jì)，過(guò)去30多年里，美國(guó)娟珊牛JHl攜帶率始終高達(dá)20~25%(Sonstegard等,2013)。隨著遺傳物質(zhì)在世界范圍內(nèi)的交流,該遺傳缺陷基因很可能已擴(kuò)散到世界各國(guó)娟珊牛群中。因此，亟需建立對(duì)該遺傳缺陷基因的分子檢測(cè)技術(shù)，從而對(duì)當(dāng)前的娟珊牛群進(jìn)行全面篩查，為今后實(shí)施科學(xué)的繁育管理提供技術(shù)手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)牛CWC15基因隱性致死突變的特異性引物及試劑盒。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供用于檢測(cè)牛CWC15基因隱性致死突變的特異性引物，包括:上游引物CWC15F15’ -GGGACTGAGGATGAAGTTGC-3’和下游引物CWC15R15’ -GGTTGGGAATACGGAAAGGT-3’。
[0006]本發(fā)明還提供含有上述引物的用于檢測(cè)牛CWC15基因隱性致死突變的試劑盒。
[0007]優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、內(nèi)切酶Taqa 1、酶切緩沖液中的一種或多種。
[0008]更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述引物或試劑盒在檢測(cè)牛CWC15基因隱性致死突變中的應(yīng)用，包括以下步驟:
[0010]I)提取待測(cè)牛的基因組DNA ；
[0011]2)以待測(cè)牛的基因組DNA為模板，利用所述引物CWC15F1和CWC15R1，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0012]3)采用RFLP法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0013]利用上述引物可擴(kuò)增出包含隱性致死突變位點(diǎn)的CWC15基因片段，長(zhǎng)度為1246bp。該片段的野生型等位基因包含2個(gè)Taqa I酶切位點(diǎn)(圖2)，將1246bp的片段切為3個(gè)片段，即(129bp、402bp和715bp);突變型等位基因，由于C — T突變，導(dǎo)致第I個(gè)酶切位點(diǎn)消失，從而只產(chǎn)生2個(gè)條帶(402bp和844bp)。因此通過(guò)觀察酶切產(chǎn)物是否存在844bp條帶，即可確定隱性有害基因的攜帶者。牛CWC15基因隱性有害突變攜帶者部分測(cè)序結(jié)果如圖1所示。
[0014]步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25 μ I計(jì)為:10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5 μ L，Taq DNA聚合酶0.75U, Mg2+2mM, dNTP200 μ M，上、下游引物各20pmol，基因組DNA模板20-50ng,用ddH20補(bǔ)齊至總體積25 μ I。
[0015]步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性8min ;然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán):95°C變性 30s，60。。復(fù)性 30s，72。。延伸 Imin ;最后 72°C延伸 1min0
[0016]步驟3)中檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所采用的RFLP法具體為:用內(nèi)切酶Taq α I對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物酶切后的條帶(圖3)來(lái)判定個(gè)體基因型。野生型純合子為3個(gè)條帶，即(129bp、402bp和715bp);攜帶者有4條帶，即(129bp、402bp、715bp和844bp)。理論上，突變純合子為2個(gè)條帶，即(402bp和844bp);但由于突變純合子的胚胎不可存活，在妊娠期流產(chǎn)，因此實(shí)踐中不會(huì)觀察到突變純合子的樣本。
[0017]酶切反應(yīng)總體積以50 μ L計(jì)為:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μ L，Taqa I內(nèi)切酶lyL，10X酶切緩沖液5 μ L，ddH2034 μ L。酶切反應(yīng)條件:水浴鍋中65°C溫浴30min。
[0018]本發(fā)明首次建立了基于PCR-RFLP技術(shù)的CWC15基因隱性致死突變的分子檢測(cè)方法。與已報(bào)道的基于SNP單倍型的檢測(cè)方法(VanRaden等，2011)相比，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。另外，本發(fā)明在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，巧妙利用了致死突變位點(diǎn)下游715bp處的另外一個(gè)相同的酶切位點(diǎn)，所設(shè)計(jì)的PCR引物能擴(kuò)增包含這兩個(gè)酶切位點(diǎn)的片段，且酶切后的條帶能夠通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳直接區(qū)分，避免了因酶切不完全或酶切反應(yīng)失敗而導(dǎo)致的假陽(yáng)性，從而確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為牛CWC15基因隱性有害突變攜帶者部分測(cè)序結(jié)果；其中，箭頭處為突變位點(diǎn)(C/T突變)，該突變的基因組物理位置為牛15號(hào)染色體的第15，707，169位(UMD3.1基因組圖譜)。
[0020]圖2為本發(fā)明引物及酶切位點(diǎn)在牛CWC15基因序列上的位置(基因組序列來(lái)源于Ensembl?；蛐蛄蠻MD3.1);其中，下劃線顯示引物所在位置，陰影處為Taq α I內(nèi)切酶識(shí)別序列；第一個(gè)酶切位點(diǎn)是CWC15基因隱性有害突變位點(diǎn)的野生型序列，如果是突變型等位基因(即C — Τ)，則該酶切位點(diǎn)消失。
[0021]圖3為本發(fā)明基于PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)CWC15基因隱性有害突變位點(diǎn)的基因型；其中，左圖為PCR產(chǎn)物的電泳膠圖，右圖為PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后的電泳膠圖；圖中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I和2為牛CWC15基因隱性致死突變攜帶者，泳道3為正常個(gè)體。

【具體實(shí)施方式】
[0022]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
[0023]實(shí)施例1檢測(cè)牛CWC15基因隱性致死突變的方法
[0024]本實(shí)施例以對(duì)3個(gè)娟珊牛樣本的檢測(cè)過(guò)程為例，說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施過(guò)程。
[0025](I) DNA 提取
[0026]采用天根生化科技(北京)有限公司DP318試劑盒，從牛血中提取基因組DNA。
[0027](2) PCR 擴(kuò)增
[0028]PCR 反應(yīng)體系(總體積 25 μ L) =1XPCR 緩沖液 2.5 μ L, Taq DNA 聚合酶 0.75U，Mg2+2mM, dNTP200 μ Μ,上、下游引物各20pmol，基因組DNA模板20_50ng，用ddH20補(bǔ)齊至25μ I。PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性8min ;然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán):95°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸 Imin ;最后 72°C延伸 1min0
[0029]儀器:AppliedB1systems9700 型 PCR 儀
[0030]上游引物CWC15F15，-GGGACTGAGGATGAAGTTGC-3 ’
[0031]下游引物CWC15R15’ -GGTTGGGAATACGGAAAGGT-3’
[0032](3) PCR產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)
[0033]制作濃度為2%的瓊脂糖凝膠，取每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物3 μ L點(diǎn)樣，在TAE緩沖液中130V電壓下電泳20分鐘。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果，為單一的約1246bp條帶。
[0034](3)限制性酶切
[0035]PCR產(chǎn)物酶切:酶切反應(yīng)總體積50 μ L，包括:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μ L，Taq α I內(nèi)切酶I μ L，1X酶切緩沖液5 μ L，ddH2034 μ L。酶切反應(yīng)條件:水浴鍋中65°C溫浴30min。
[0036](4)酶切產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)
[0037]制作濃度為3 %的瓊脂糖凝膠，取每個(gè)樣品的酶切產(chǎn)物8 μ L點(diǎn)樣，在TAE緩沖液中120V電壓下電泳20分鐘。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果(圖3)。根據(jù)酶切條帶模式判定每個(gè)樣品的基因型:泳道I和2內(nèi)觀察到4個(gè)條帶，大小符合(129bp、402bp、715bp、844bp)，因此判定為攜帶者；泳道3內(nèi)只有3個(gè)條帶，大小符合(129bp、402bp、715bp)，因此判定為野生型純合子。
[0038]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0039]參考文獻(xiàn)
[0040]Sonstegard TS, et al.(2013)Identificat1n of a nonsense mutat1n inCWC15associated with decreased reproductive efficiency in Jersey cattle.PLoS0NE8(I):e54872.do1:10.1371/journal, pone.0054872
[0041]Stachowicz K, et al.(2011) Rates of inbreeding and geneticdiversity in Canadian Holstein and Jersey cattle.2011Journal of DairySicence94(10):5160-5175.
[0042]VanRaden PM,et al.(20II)Harmful recessive effects on fertility detectedby absence of homozygous haplotypes.Journal of Dairy Sicence94 (12):6153-6161。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)牛CWC15基因隱性致死突變的特異性引物，其特征在于，包括:上游引物CWC15F15’ -GGGACTGAGGATGAAGTTGC-3’ 和下游引物 CWC15R15’ -GGTTGGGAATACGGAAAGGT-3’。
2.含有權(quán)利要求1所述引物的用于檢測(cè)牛CWC15基因隱性致死突變的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、內(nèi)切酶Taq α 1、酶切緩沖液中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求 2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104131084SQ201410311877
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】張毅, 郭剛, 劉林, 石萬(wàn)海, 李錫智, 張勝利 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)