一種桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合pcr檢測(cè)試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法。本發(fā)明的試劑盒包括：(1)10×PCR?Buffer；(2)25mmol/LMg2+；(3)10mmol/L?dNTP；(4)10mmol/LEF-S-4，10mmol/LEF-A-4，10mmol/LBT-S-9，10mmol/LBT-A-9；其中，引物EF-S-4序列為5＇－CAAGAGTCGGATGGAATCAA－3＇，引物EF-A-4序列為5＇－CACAGGAGGTCGTCAAAC－3＇，引物BT-S-9序列為5＇－TGCGTAAGTGCTCATTCTG－3＇，引物BT-A-9序列為5＇－AACTGGAGGTCGGAGGTA－3＇；(5)5U/μLTag聚合酶；(6)ddH2O。本發(fā)明能夠快速、準(zhǔn)確的對(duì)桉樹(shù)焦枯病原菌(Cylindrocladium?scoparium)進(jìn)行分子鑒定和桉樹(shù)焦枯病的早期診斷，對(duì)控制桉樹(shù)焦枯病的檢疫及病害的防治具有意義重大。
【專利說(shuō)明】—種桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及的是一種桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]桉樹(shù)與松樹(shù)、楊樹(shù)并成為三大世界速生用材林樹(shù)種，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和開(kāi)發(fā)價(jià)值。調(diào)查顯示，世界上的100多個(gè)國(guó)家均對(duì)桉樹(shù)不同品種有所引進(jìn)和栽培，但隨著桉樹(shù)種植區(qū)域的增加，由Cylindrocladium屬病原菌引起的桉樹(shù)焦枯病發(fā)生范圍也越來(lái)越普遍，其中主要以桉樹(shù)焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)為主要致病菌。桉樹(shù)焦枯病作為一種世界性土傳病害，嚴(yán)重影響著桉樹(shù)的正常生長(zhǎng)和材積量的生產(chǎn)，對(duì)林業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展產(chǎn)生極大威脅。目前，經(jīng)報(bào)道，在中國(guó)廣西、福建、海南、四川等多個(gè)省市和地區(qū)具有桉樹(shù)焦枯病的發(fā)生，桉樹(shù)焦枯病發(fā)生面積甚廣，已嚴(yán)重威脅著中國(guó)現(xiàn)今桉樹(shù)的林業(yè)生產(chǎn)建設(shè)。因此，我國(guó)在1996年I月5日便將其列入森林植物檢疫對(duì)象。綜上，檢測(cè)桉樹(shù)是否攜帶焦枯病原菌對(duì)于桉樹(shù)焦枯病的防治意義重大，同時(shí)也是減少桉樹(shù)經(jīng)濟(jì)損失的重要保障，亟需建立快速靈敏的檢測(cè)方法，為桉樹(shù)焦枯病的防治提供依據(jù)。
[0003]伴隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，越來(lái)越受到人們的接受和認(rèn)可，如今以利用分子生物學(xué)技術(shù)為支撐的快速PCR檢測(cè)技術(shù)也被廣泛的應(yīng)用到植物真菌、細(xì)菌、放線菌、病毒的檢測(cè)鑒定中。PCR技術(shù)及基于PCR的檢測(cè)方法因其具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，使其在植物病害的檢測(cè)上發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。雙重PCR是標(biāo)準(zhǔn)PCR的發(fā)展和完善。雙重PCR是指在同一反應(yīng)體系里加上二對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出二個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)。雙重PCR較普通PCR具有更高的特異性和準(zhǔn)確度，不僅具有普通PCR操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，而且大大減少了因單一基因PCR擴(kuò)增而出現(xiàn)假陽(yáng)性或者檢測(cè)特異性差的可能性。多基因聯(lián)合檢測(cè)是指利用不同的靶基因選擇分別進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)，共同建立檢測(cè)體系的一種快速檢測(cè)技術(shù)，其各靶基因直接無(wú)影響，使得各檢測(cè)條帶清晰明了，對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的可靠性具有進(jìn)一步提升。因此，建立桉樹(shù)焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)的多基因聯(lián)合快速PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)桉樹(shù)焦枯病的準(zhǔn)確、快速鑒定提供了必須保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在檢測(cè)桉樹(shù)焦枯病原菌中存在的不足，提供了一種桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)試劑盒及其使用方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)試劑盒，其包括:
[0007](I) IOXPCR Buffer ；
[0008](2)25mmol/L Mg2+ ；[0009](3) lOmmol/LdNTP ；
[0010](4)10mmol/LEF-S-4,10mmol/LEF_A-4，10mmol/LBT-S-9,10mmol/LBT-A_9 ;其中，引物 EF-S-4 序列為 5 ' - CAAGAGTCGGATGGAATCAA - 3 ;，引物 EF-A-4 序列為 5 '—CACAGGAGGTCGTCAAAC - 3 ;，引物 BT-S-9 序列為 5 ; — TGCGTAAGTGCTCATTCTG - 3 ;，引物 BT-A-9 序列為 5 ; — AACTGGAGGTCGGAGGTA - 3 ;；
[0011](5) 5U/μ LTag 聚合酶；
[0012](6)ddH20。
[0013]所述的桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法，其步驟如下:
[0014](I)提取純培養(yǎng)菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA ；
[0015](2)PCR 擴(kuò)增體系 50μ L:10XPCR Buffer5.0μ L，25mmol/LMg2+3y L，IOmmol/LdNTP1.5 μ L，10mm。VLEF-S-41.0yL, 10mmol/LEF-A-41.0yL, 10mmol/LBT-S-91.0yL,10mmol/LBT-A-91.0yL, 5U/ μ LTag 聚合酶 0.3 μ L, ddH2032.2 μ L,加提純的培養(yǎng)菌株基因組DNA或植物組織樣總DNA提取液4.0 μ L,組成反應(yīng)混合液；
[0016](3)PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，57°C退火30s，72°C延伸40s，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；
[0017](4) PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè):擴(kuò)增結(jié)束后取5.0 μ LPCR產(chǎn)物上樣于含0.5 μ g/mLEB的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為9V/cm、時(shí)間為30min，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照；如果存在分子量為157bp和272bp的雙片段，則判定所述菌株中或植株組織樣中存在桉樹(shù)焦枯病原菌。
[0018]本發(fā)明提供了用于桉樹(shù)焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)的兩對(duì)特異性引物EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9，以及含有兩對(duì)特異性引物的試劑盒。本發(fā)明可快速、準(zhǔn)確的對(duì)桉樹(shù)焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium進(jìn)行分子鑒定和桉樹(shù)焦枯病的早期診斷，對(duì)控制桉樹(shù)焦枯病的檢疫及病害的防治具有意義重大。
[0019]本發(fā)明利用beta-tubulin gene 序列分析和 factor 1-alpha (tef I) gene 序列分析技術(shù)，設(shè)計(jì)雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)引物。該方法可以克服常規(guī)PCR檢測(cè)的穩(wěn)定性差、重復(fù)性差等缺點(diǎn)，同時(shí)提高了病害檢測(cè)的準(zhǔn)確性，為其它病害的分子檢測(cè)提供技術(shù)參考，特別對(duì)于ITS區(qū)同源性高難以區(qū)分的種屬真菌的鑒定和檢測(cè)提供參考依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)圖。
[0021 ] 圖2為已知供試菌的EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9特異性擴(kuò)增結(jié)果；圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量大小，泳道1-22是引物EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9對(duì)表1中所對(duì)應(yīng)的供試菌株DNA溶液PCR擴(kuò)增，CK為陰性對(duì)照。
[0022]圖3為雙重PCR靈敏度檢測(cè)；圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量大小DL2000Marker，泳道CK為陰性對(duì)照,泳道1-8的桉樹(shù)焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium基因組DNA濃度分另Ij為 550ng/ μ L, 55ng/ μ L, 5.5ng/ μ L, 550pg/ μ L, 55pg/ μ L, 5.5pg/ μ L, 550fg/ μ L, 55fg/μ L0[0023]圖4為桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)流程。
[0024]圖5為雙基因聯(lián)合PCR引物檢測(cè)田間發(fā)病植株；圖中，泳道M為DL2000Marker，l_8泳道分別為雅安、攀枝花、廬山、廣元、重慶、新津、天全、寶興8個(gè)地區(qū)的桉樹(shù)焦枯病組織樣品，9為健康組織樣品，泳道CK為陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0026]實(shí)施例1
[0027]圖1為桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)圖。
[0028]主要試劑:DNA提取試劑盒及回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技公司，引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序交由上海生工生物工程公司完成。
[0029]1、桉樹(shù)焦枯病原菌快速分子檢測(cè)的PCR引物的設(shè)計(jì)
[0030]供試菌株來(lái)源、名稱、寄主、數(shù)量等信息詳見(jiàn)表1。
[0031]表1桉樹(shù)焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)及其它參試菌株
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其包括:
(1)IOXPCR Buffer ；
(2)2Smmol /I, Mg2+ ；
(3)IOmmo I/L dNTP ；
(4)IOmmoI/L EF-S-4，10mmol/LEF_A-4，10mmol/LBT-S-9,10mmol/LBT-A_9 ;其中，引物 EF-S-4 序列為 5 ' — CAAGAGTCGGATGGAATCAA - 3 ;，引物 EF-A-4 序列為 5 '—CACAGGAGGTCGTCAAAC - 3 ;，引物 BT-S-9 序列為 5 ; — TGCGTAAGTGCTCATTCTG - 3 ;，引物 BT-A-9 序列為 5 ; — AACTGGAGGTCGGAGGTA - 3 ;；
(5)5U/ μ L Tag 聚合酶；
(6)ddH20。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桉樹(shù)焦枯病原菌雙基因聯(lián)合PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征是，其步驟如下: (1)提取純培養(yǎng)菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA； (2)PCR擴(kuò)增體系 50μ L:10XPCR Buffer5.Ομ L，25mmol/LMg2+3y L，IOmmol/LdNTP1.5 μ L，10mmol/LEF-S-41.0yL, 10mm。VLEF-A-41.0yL, 10mmol/LBT-S-91.0yL,10mmol/LBT-A-91.0yL, 5U/ μ LTag 聚合酶 0.3 μ L, ddH2032.2 μ L,加提純的培養(yǎng)菌株基因組DNA或植物組織樣總DNA提取液4.0 μ L,組成反應(yīng)混合液； (3)PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min;94°C變性45s，57°C退火30s，72°C延伸40s，共.35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；
(4)PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè):擴(kuò)增結(jié)束后取5.0 μ L PCR產(chǎn)物上樣于含0.5 μ g/mL EB的.1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為9V/cm、時(shí)間為30min，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照；如果存在分子量為157bp和272bp的雙片段，則判定所述菌株中或植株組織樣中存在桉樹(shù)焦枯病原菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104017885SQ201410273196
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】朱天輝, 張靜, 朱涵明月, 李姝江, 譙天敏, 韓珊, 王淋敏, 張麗娜 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)