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具有高純度x-染色體和y-染色體的精子群的制作方法

文檔序號:478637閱讀:289來源:國知局
具有高純度x-染色體和y-染色體的精子群的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有高純度X-染色體和Y-染色體的精子群。還涉及篩選非天然產(chǎn)生的具有高純度的精子細胞群(15)以及根據(jù)例如質(zhì)量、體積、取向或發(fā)射光特征區(qū)分精子細胞(28)的技術(shù),包括分析方法和裝置,例如成形光束的光學(xué)裝置(30)和檢測器(32)。
【專利說明】具有高純度X —染色體和Y —染色體的精子群
[0001]本申請是再次分案申請,其所針對的原分案申請的中國國家申請?zhí)枮?00810166001.8,申請日為2001年5月9日,發(fā)明名稱為“具有高純度X —染色體和Y —染色體的精子群”;該原分案申請的原申請的國際申請?zhí)枮镻CT/US01/15150,中國國家申請?zhí)枮?1810748.6,申請日為2001年5月9日,發(fā)明名稱為“具有高純度X —染色體和Y —染色體的精子群”。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]分離的具有高純度X—染色體或Y—染色體的精子群以及根據(jù)例如質(zhì)量、體積、DNA含量等等區(qū)別特征分離精子、粒子、或事件的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]分離的具有高純度X—染色體或Y—染色體的精子群可以被用于完成很多哺乳動物例如??苿游?、馬科動物、羊科動物、山羊、豬、狗、貓、駱駝、大象、公牛、水牛等等的卵細胞或卵母細胞的體內(nèi)或體外的授精或人工授精。另見,美國專利5,135,759,在此引入作為參考。
[0004]但是,傳統(tǒng)的將帶有X —染色體和Y —染色體的精子群分離開的方法會產(chǎn)生低純度的精子群。不論何種方法,精子一直都沒有被分離成具有例如90 %,95 %,或大于95 %的高純度的X —染色體或Y染色體的精子樣品。
[0005]有關(guān)直接或間接根據(jù)大小、質(zhì)量、或強度差異將帶有Y—染色體的精子同帶有X —染色體的精子分開的一些方法已經(jīng)被公開。如美國專利號4,474,875所公開的,對所有精子細胞同時應(yīng)用一種浮力而使分離培養(yǎng)基中帶有X—染色體或Y—染色體的精子分離到不同的位置。美國專利號5,514,537公開了一種技術(shù),其中精子穿過裝有兩種規(guī)格珠子的層析柱。帶有大的X —染色體的精子被分離到含有大珠子的層中,而帶有較小的Y —染色體的精子被分離到含有較小珠子的層中。美國專利N0.4,605,558公開了可以使精子對密度梯度差分敏感的方法。而美國專利N0.4,009, 260利用了帶有X —染色體的精子和帶有Y —染色體的精子在通過柱中阻礙介質(zhì)的遷移速率或游動速率的差異。
[0006]上面提到的每一項技術(shù)共同存在的問題是這些技術(shù)對精子以“大批量方式”起作用,意思是所有精子都在同一時間經(jīng)受相同的處理,而帶有Y—染色體的精子細胞比帶有X 一染色體的精子出來的更快更早,或處于不同的位置。這樣,單個的精子細胞不能被鑒定并且不存在實際的體積、質(zhì)量、密度或其它精子細胞特征的“量度”。逐個鑒定精子細胞在實際分離過程中所能帶來的益處可以被檢測到,并且甚至在分離過程中能夠生成實物定量數(shù)據(jù),和分離參數(shù)如所希望的發(fā)生變化。這些技術(shù)不能同流式細胞篩選裝置一塊使用。
[0007] 用于分離精子的流式細胞儀技術(shù)也已經(jīng)被公開。利用這些技術(shù)時應(yīng)當(dāng)用熒光染色劑對精子染色并使其在一束狹窄的流或譜帶一例如激光束一類的激發(fā)或照射源中流過。當(dāng)被染色的顆?;蚣毎?jīng)過激發(fā)或照射源時,熒光染色劑發(fā)出熒光。可以通過光學(xué)裝置收集熒光,聚焦在象光電倍增管一類能夠產(chǎn)生并倍增電信號的檢測器上,然后用分析器進行分析。接著用多參數(shù)或單一參數(shù)的色譜圖或直方圖顯示這些數(shù)據(jù)??梢杂眉毎臄?shù)目以及每個細胞的熒光作為坐標。見美國專利N0.5,135,759,在此引入作為參考。但是,針對這類技術(shù)仍然有大量沒有解決的問題并且分離高純度的帶有X—染色體或Y—染色體的精子細胞是困難的。
[0008]傳統(tǒng)的流式細胞儀技術(shù)的一個顯著問題是鞘液中的物質(zhì)、顆粒、或者細胞的定向。當(dāng)物質(zhì)或者細胞相對于超過一個軸一例如精子一而使得形狀不規(guī)則時候,這尤其成為問題。這一問題的一個方面應(yīng)當(dāng)是在鞘液中建立物質(zhì)的初始取向。這一問題的第二個方面是在被測物質(zhì)發(fā)光期間保持物體相對于檢測器(光電倍增管或其它類似的儀器)的取向。
[0009]傳統(tǒng)的流式細胞儀技術(shù)的另一個顯著問題是不能將物質(zhì)或細胞包裹在液滴中。尤其是,當(dāng)在不規(guī)則形狀物體的周圍形成液滴時,液滴的大小不足以完全覆蓋物質(zhì)或細胞的所有部分。例如,在流式細胞儀作用期間,如上所述的液滴能夠以很快的速度形成,甚至每秒10,000到90,000之多,在有些情況下每秒80,000個之多。當(dāng)精子被包封在液滴中時,特別是以這樣快的速率,精子的尾部或頸部的一部分沒有被包封在液滴中。沒有被包封在液滴中的尾和頸的那部分會以某種干擾后面液滴形成或液滴正確偏轉(zhuǎn)的方式與噴嘴或液滴的周圍環(huán)境起反應(yīng)。因此有些精子根本沒有被分析到從而降低了這一方法的效率,或者沒有被被消除到足以賦值給一個細胞群,或者偏離正常軌道,或者全部情況的組合發(fā)生。
[0010]傳統(tǒng)的流式細胞儀技術(shù)以及其它技術(shù)的另一個顯著問題是測量事件的巧合。這一問題的一個方面是來自第一個事件的入射光通量在來自第二個事件的入射光通量開始產(chǎn)生信號后繼續(xù)產(chǎn)生信號。這樣,兩個事件至少殘留有一部分不能相互區(qū)分開來。這一問題的另一方面是兩個或者更多的事件同時發(fā)生并且入射光通量包括了所有事件的貢獻。這樣,事件的多樣性根本沒有被解決并且針對事件多樣性的物體被錯誤地賦值給某一個精子群或者根本沒有賦值給精子群,或者兩種情況都存在。尤其是,有關(guān)流式細胞儀,懸浮的單個顆粒、物體、細胞 、或精子通過能夠使它們相互反應(yīng)的一束光時發(fā)生了一種可測量的反應(yīng),例如發(fā)射熒光。在傳統(tǒng)的流式細胞儀中,Hoechst染色的精子經(jīng)過一束激光時導(dǎo)致熒光發(fā)射。在實際發(fā)射事件結(jié)束之后,從被激發(fā)的結(jié)合到DNA上的熒光劑所發(fā)射的熒光的光亮度足以在傳統(tǒng)光電倍增管中產(chǎn)生一段時間的電子流。而且,在傳統(tǒng)的流式細胞儀中,激光束能夠產(chǎn)生具有30 μ m高和約80 μ m寬的圖案。含有同DNA結(jié)合的熒光染色劑的牛精子核可以是約9 μ m長,使激光束的高度比核大三倍。這種差別使得激光對激光束圖案中多于一個的精子中結(jié)合的熒光染色劑同時進行刺激。這些存在于傳統(tǒng)的流式細胞儀的每個問題降低了區(qū)分各個事件的能力。
[0011]傳統(tǒng)的流式細胞儀技術(shù)以及其它技術(shù)的另一個顯著的問題是不規(guī)則形狀物體,例如精子,根據(jù)激發(fā)/檢測途徑中它們的取向而產(chǎn)生不同的信號(形狀、持續(xù)時間或總數(shù))。這樣,均質(zhì)群體中的個體能夠產(chǎn)生一個較寬的發(fā)射光譜,其特點是可能同另一個均質(zhì)群體中的個體的發(fā)射特性重疊,避免或減少了分辨兩個群體中個體的能力。
[0012]傳統(tǒng)的流式細胞儀技術(shù)以及其它技術(shù)的另一個顯著問題是物體沒有均一地暴露給激發(fā)源。當(dāng)物體同光束周圍接近時,傳統(tǒng)光束成形光學(xué)不能提供均一的激光暴露。
[0013]傳統(tǒng)的流式細胞儀技術(shù)的另一個顯著問題是,物體例如精子不必要地長時間暴露于激發(fā)源中。用激光對細胞,例如精子的輻射可能導(dǎo)致細胞或細胞中的DNA被破壞。
[0014]傳統(tǒng)流式細胞儀技術(shù)的另一個顯著問題是可能會發(fā)生注射管破壞噴嘴中的片流膜。片流膜的破壞會改變流體中不規(guī)則形狀物體的取向并降低分類速度以及已被分類的帶有X —染色體和Y —染色體的精子群體的純度。
[0015]用染色劑結(jié)合到精子細胞的核DNA上的技術(shù)也可能存在其它問題。首先,由于核中的DNA是高度濃縮的并且形狀是平的,對DNA的化學(xué)計量染色是困難的或者不可能。其次,被染色的核具有較高的折射指數(shù)。第三,結(jié)合到DNA上的染色劑形成的DNA —染色劑復(fù)合物可能降低授精率或其后的胚胎的生存率。第四,DNA —染色劑復(fù)合物通常用紫外光照射以使染色劑發(fā)出熒光。這種照射可能影響精子的生存率。由于這些不同的問題,應(yīng)當(dāng)優(yōu)選的使用一種染色劑需求更低或者不需要染色劑,或者更少紫外照射或者不需要紫外照射,或者兩者的需要都更少或者都不需要的方法。
[0016]針對產(chǎn)生高純度的帶有X —染色體或Y —染色體精子細胞群(無論是活的、固定的、有活力的、沒有活力的、完整的、無尾的、或者作為核)的樣品,或者一般地,針對在具有相當(dāng)高的入射光通量的一系列事件之間的成像信號中檢測微小的差異,或者是針對在流體中確定不規(guī)則形狀物體的取向,或者在一個光學(xué)路徑中消除偶然事件,或者從分析中去除不需要的定向物體,本發(fā)明以一種實際的方式說明了對上面提到的每個問題的解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明的一個顯著的目的是提供分離的帶有高純度X-染色體和Y-染色體的精子群。分離的非天然存在的高純度精子群具有很多用途,包括哺乳動物后代的性別選擇,各種體外卵細胞授精方案,象人工授精一類的各種體內(nèi)授精方案,商業(yè)上的方法包括繁殖珍稀動物或者是肉用動物,或者保護珍稀或漸臨滅絕的動物,但是這只例舉了高純度精子細胞群的用途。 [0018]本發(fā)明的另一個顯著的目的涉及生產(chǎn)帶有高純度X-染色體和Y-染色體的精子樣品的設(shè)備和方法。
[0019]本發(fā)明描述的一個特別的實施例可以用于上述多種用途,可以用來成功地區(qū)分光發(fā)射事件的全部光通量中之微小可測量差異,在液流中確定不規(guī)則物體的取向,使一個光學(xué)路徑中的偶然事件減低到最小限度,去除光學(xué)路徑中由不需要的沒有取向的物體所貢獻的信號(包括物體本身的去除),以及液滴中不規(guī)則形狀物體的包封。這樣,本發(fā)明的具體目的應(yīng)當(dāng)非常廣泛。
[0020]本發(fā)明的另一個顯著目的是提供具有高純度X-染色體和Y-染色體的精子樣品(活的、固定的、有活力的、沒有活力的、完整的、無尾的、或者精子核),樣品具有的高純度梯度范圍是80%、85%、90%、95%或者甚至大于95%。
[0021]本發(fā)明的一個具體實施方案的另一個顯著目的是甚至以高分離率分離帶有高純度X-染色體和Y-染色體的精子細胞群。高速分離以生產(chǎn)每一個性別的活精子的速率約為每秒 500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000 個或者甚至每秒 10000 個或
者更聞。
[0022]本發(fā)明的一個具體實施方案的另一個顯著目的是在流式細胞儀的流動路徑的激發(fā)/檢測部分完全消除或者去除具有不需要取向的精子(活的、固定的、有活力的、沒有活力的、完整的、無尾的、或者精子核)。
[0023]本發(fā)明的一個具體實施方案的另一個重要目的是提供具有高純度X —染色體或者Y —染色體的人工授精樣品。
[0024]本發(fā)明的一個具體實施方案的另一個重要目的是提供具有高純度X —染色體或者Y —染色體的體外授精樣品。
[0025]本發(fā)明的一個具體實施方案的另一個重要目的是能夠?qū)?jīng)高純度人工授精樣品的雌性的后代的性別進行預(yù)選,用高純度人工授精樣品授精的授精卵的后代性別的選擇成功率為80%、85%、90%、95%或者甚至大于95%。
[0026]本發(fā)明的一個具體實施方案的另一個重要目的是區(qū)分總發(fā)射光通量具有較小差異的光發(fā)射事件。
[0027]本發(fā)明的具體實施方案的另一個重要目的是能夠完全消除或者降低由光電倍增管在暴露于高入射光通量中一段時間后,甚至在無光的情況下所產(chǎn)生的背景噪聲量。
[0028]本發(fā)明的具體實施方案的另一個重要目的是能夠完全消除同流式細胞儀或者其它儀器一起使用的光電倍增管光電陰極的飽和度。
[0029]本發(fā)明的具體實施方案的另一個重要目的是能夠減少從光電倍增管光電陰極遷移到第一個二次發(fā)射極的電子數(shù)目。
[0030]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠減少光電倍增管中流向N極的電子總數(shù)。
[0031]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠在不相應(yīng)地增加由光電倍增管產(chǎn)生的背景信號的情況下使光電倍增管光電陰極的光通量增加。
[0032]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠增加來自測量的光發(fā)射事件的信號在背景信號中的比率。
[0033]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠在高入射光通量事件或者連續(xù)高入射光通量事件期間使光電倍增管產(chǎn)生的放大信號強度增大而光電倍增管的陰極并不飽和。
[0034]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠提高由于對用熒光染色的精子或其它細胞或其它物體的分類而得到的色譜圖或者直方圖的表觀分辨率,對熒光染色劑的激發(fā)會產(chǎn)生具有微小差異的光通量。
[0035]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是在用分類流式細胞儀裝置對精子進行分類時能夠提高裝置的校準。
[0036]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠提高流式細胞儀系統(tǒng)的精子分類率。
[0037]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠提高用流式細胞儀分類的精子樣品的純度。
[0038]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠提供將帶有X-染色體的精子從帶有Y-染色體的精子中分出來的技術(shù),兩種精子的核DNA總數(shù)中Y染色體的DNA和X染色體的DNA的量略有差別。
[0039]本發(fā)明的一個具體實施方案的另一個重要目的是提供在用流式細胞儀將帶X-染色體的精子同帶Y-染色體的精子分離開的步驟中提高生成的直方圖表觀分辨率的技術(shù)。
[0040]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠提供將激發(fā)/檢測路徑中目標的重疊降低到最小程度的成形光束的光學(xué)裝置。[0041]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠提供將物體暴露經(jīng)過激發(fā)光束時的總流明數(shù)減少到最小的成形光束的光學(xué)裝置。這一目的的一個方面是降低物體暴露到的光強的總流明數(shù)。該目的第二個方面是提高光源的強度而不提高被暴露物體的總流明數(shù)。
[0042]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是提供當(dāng)物體通過光學(xué)路徑時使之均勻暴露的成形光束的光學(xué)裝置。
[0043]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是提供能夠使液流中不規(guī)則物體定向的噴嘴。該目的的一個方面是使物體在相同方向上定向延長。該目的的第二個方面是使平板物體的背側(cè)在相同方向定向。
[0044]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠在將不規(guī)則形狀物體完全包封在一個液滴內(nèi)。
[0045]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是能夠?qū)⒁毫髦胁恍枰ㄏ虻奈矬w同需要定向的物體區(qū)分開來。
[0046]本發(fā)明具體實施方案的另一個重要目的是提供區(qū)分干擾對比技術(shù),據(jù)此平面物體是由帶有目標物體的液流組成的,以及據(jù)此平面圖像可以用來測量來自經(jīng)過物體的信號。
[0047]本發(fā)明一個實施方案的另一個目的是能夠提供一種光學(xué)裝置以形成使每個物體的兩個側(cè)面分開的 圖像,以使一個用于測量物體的實際體積,而另一個用來確定物體的取向。這樣,因取向不正確而不能精確測量其體積的物體能夠被拋棄掉。這可以通過改進而完成,所以利用用圖像平面中的兩個針孔從而使由這些雙圖像產(chǎn)生的光脈沖被獨立檢測出來。調(diào)諧光學(xué)裝置以使第一個圖像產(chǎn)生的光脈沖同物體的體積成比例,并且第二個圖像產(chǎn)生的光脈沖取決于物體在被測量時的取向。
[0048]本發(fā)明的一個實施方案的另一個目的是能夠提供一種補償方式,因為物體被包含在液流之內(nèi)。例如液流可以是一柱水,它起了柱面透鏡的作用,因此使物體的圖像扭曲。從光學(xué)上講,這相當(dāng)于柱體的折射指數(shù)(水)比它周圍環(huán)境(空氣)高。盡管其它不同形狀和折射指數(shù)的補償元件可以根據(jù)需要設(shè)定,但本發(fā)明中所公開的補償能夠由例如具有比它周圍環(huán)境的折射指數(shù)低的柱體所組成。通過確保光通過這一補償元件,可以由該補償元件正好相反的行為來補償液流的光學(xué)效果。
[0049]通過說明書和權(quán)利要求書的其他部分公開了由本發(fā)明自然延伸的物體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0050]圖1顯示了一般的流式細胞儀。
[0051]圖2顯示了一般的流式細胞儀的第二種視圖。
[0052]圖3顯示了沒有放大器的發(fā)明(圖3a)的單變量流式細胞儀的單變量直方圖(#1,#2,以及#3)同相同流式細胞儀一利用了特定的放大作用的發(fā)明的實施方案的單變量直方圖(圖3b)之間的比較,說明了在帶有X-染色和Y-染色體的牛精子細胞群之間分辨
率的改善。
[0053]圖4顯示的單變量和雙變量直方圖說明了帶X-染色體和帶Y-染色體的牛精子細胞群之間的常規(guī)分辨率。
[0054]圖5顯示的單變量和雙變量直方圖說明了利用放大作用的發(fā)明的一個特定實施方案使帶X-染色體和帶Y-染色體的牛精子細胞群之間的分辨率提高。[0055]圖6顯示的單變量和雙變量直方圖的第二個例子說明了帶X-染色體和帶Y-染色體的牛精子細胞群之間的常規(guī)分辨率。
[0056]圖7顯示的單變量和雙變量直方圖的第二個例子說明了利用放大發(fā)明的一個特定實施方案使帶X-染色體和帶Y-染色體的牛精子細胞群之間的分辨率提高。
[0057]圖8顯示的單變量和雙變量直方圖說明了帶X-染色體和帶Y-染色體的馬精子細胞群之間的常規(guī)分辨率。 [0058]圖9顯示的單變量和雙變量直方圖說明了利用放大作用的發(fā)明的一個特定實施方案使帶X-染色體和帶Y-染色體的馬精子細胞群之間的分辨率提高。
[0059]圖10顯示的單變量和雙變量直方圖說明了利用放大作用的發(fā)明的一個特定實施方案使帶X-染色體和帶Y-染色體的馬精子核之間的分辨率提高。
[0060]圖11顯示了一個改進的電路板的特定的實施方案將放大發(fā)明用于MoFlos流式細胞儀。
[0061]圖12顯示了針對MoF1s'流式細胞儀的一個放大發(fā)明的特定的實施方案的電路圖。
[0062]圖13顯示了用傳統(tǒng)成形光束的光學(xué)裝置(圖13a)的激光束圖案和用降低高度的成形光束的光學(xué)裝置的激光束圖案(圖13b)。
[0063]圖14顯示的條形圖比較了用常規(guī)技術(shù)或者單獨使用放大發(fā)明技術(shù)或者結(jié)合降低高度的成形光束的光學(xué)裝置來分離的帶X-染色體(圖14a)的精子和帶Y-染色體(圖14b)的精子的純度。
[0064]圖15顯示了降低高度的成形光束的光學(xué)裝置的正視圖。
[0065]圖16顯示了降低高度的成形光束的光學(xué)裝置的俯視圖。
[0066]圖17顯示了物體定向噴嘴發(fā)明的透視圖和兩個交叉部分。
[0067]圖18顯示了物體定向噴嘴發(fā)明的一系列分級交叉部分。
[0068]圖19顯示了實施方案的斜面注射管發(fā)明的正視圖和側(cè)視圖。
[0069]圖20描述了通過比較定向精子的信號(圖20a和20b)和未定向精子的信號(圖20c和20d)來去除不需要的未定向的精子(RUUS)的發(fā)明。
[0070]圖21顯示了另一個實施方案的具有一個劃槽狀斜面葉片的斜面注射管發(fā)明的透視圖。
[0071]圖22顯示了同流式細胞儀配合的傳統(tǒng)光學(xué)技術(shù)。
[0072]圖23a顯示了典型的精子形狀和大小,而圖23b顯示了正確取向和不正確取向的精子之間的差異。
[0073]圖24顯示了本發(fā)明的實施方案所具有的能夠測量例如體積和取向兩種信號的一種構(gòu)造。
[0074]圖25a和b顯示了本發(fā)明的一個實施方案所具有的相應(yīng)于每一個半圓的部分所具有的針孔,圖25c顯示了本發(fā)明的一個實施方案的一個平面圖,圖25d顯示了本發(fā)明一個實施方案所具有的兩個獨立的可旋轉(zhuǎn)偏振器。
[0075]圖26a和26b說明了本發(fā)明的一個實施方案的對液流的補償方法,圖26c顯不了一個實施方案的補償元件,26d顯示了另一個補償元件的實施方案,液流以及來自補償元件的圖像在平面圖中彼此落在頂端。[0076]圖27顯示了干涉光學(xué)裝置發(fā)明的一個實施方案。
[0077]圖28顯示了干涉光學(xué)裝置發(fā)明的第二個視圖。
【具體實施方式】
[0078]本發(fā)明涉及分離帶有高純度X-染色體和Y-染色體的精子或者精子細胞群。根據(jù)需要,帶有高純度X-染色體和Y-染色體的精子群可以包括完整的活的精子,也可以包括無尾的精子群(精核),或者其它有活力的或者沒有活力的精子群形式。當(dāng)發(fā)明所提供的具體的實施例上下文中描述的每個分離的完整的活精子細胞都具有精子細胞的頭部、頸部和尾部時,應(yīng)當(dāng)清楚所描述的技術(shù)也可以在精子核中有各種不同的應(yīng)用。帶有X-染色體和Y-染色體的精子群應(yīng)當(dāng)進一步理解為包括但是不限于來自任何雄性哺乳動物物種的精子,來自人的精子和來自象??苿游铩ⅠR科動物、羊科動物、犬科動物、貓、山羊或豬的公知動物,以及象大象、斑馬、駱駝、或者條紋羚一樣的公眾較少知道的動物。這份動物清單的目的是舉例說明其精子可以通過常規(guī)方法以90%或更高純度分離的各種動物,而不是對本發(fā)明說明書中描述的精子可以來自任何哺乳動物的特定的種進行限制。
[0079]從哺乳動物的不同的種所分離的高純度精子可以成為產(chǎn)品并能夠用于各種人工授精方案或者作為商業(yè)方法的一部分,例如在那些美國專利申請60/211,093,60/224, 050或者PCT/US99/17165中所描述的那樣;或者可以用于如PCT/US98/27909申請中所描述的低劑量授精方案,或者如美國專利申請60/253,785中所描述的用于給動物包括人的卵母細胞進行體外授精,每個上面描述的引用都在此引入作為參考。
[0080]這里所用的術(shù) 語純度或者高純度應(yīng)當(dāng)被理解為分離的具有特定區(qū)別特征或所需的各種特征的組合的精子群的百分比。例如,當(dāng)精子群的分離是基于帶有與Y-染色體相反的X-染色體,純度為90%的帶有X-染色體的精子群是指所含精子群中有90%的單個精子帶有X-染色體而該精子群的其它10%可能是帶有Y-染色體的精子。因此,帶有高純度X-染色體或者Y-染色體的精子群應(yīng)當(dāng)包括的純度選自由90%到約100%之間,約91%到約100%之間,約92%到約100%之間,約93%到約100%之間,約94%到約100%之間,約95%到約100%之間,約96%到約100%之間,約97%到約100%之間,約97%到約100%之間,約98%到約100%之間,約99%到約100%之間所組成的組。
[0081]重要的是,當(dāng)本發(fā)明的許多實施方案描述分離的帶有高純度X-染色體和Y-染色體的精子群時,以及當(dāng)說明書進一步公開用高純度精子分離裝置和方法如何分離以及如何利用分離的高純度精子群時,應(yīng)當(dāng)清楚本發(fā)明的基本概念是可以用于其他類型的具有粒子區(qū)別特征的粒子或具有事物區(qū)別特征的事物。應(yīng)當(dāng)清楚本發(fā)明可以應(yīng)用于各種各樣的需要解決成像信號的微小差異的事項中,例如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的產(chǎn)品缺陷檢測、場流分級分離法、液相色譜、電泳、計算機X線斷層攝影術(shù)、Y攝像、飛行測試儀的時間檢測等。
[0082]另外,當(dāng)這種公開提供了對流式分離帶X-染色體的精子和帶Y-染色體的精子的裝置和方法的實施方案的描述時,對本發(fā)明中這些實施方案的描述并不意味著將本發(fā)明的范圍縮小到僅僅是精子的流式分離或者僅僅是高純度流式細胞儀精子分離系統(tǒng),而是用這些實施例以一種實際的方式對本發(fā)明的基本概念進行舉例說明以說明他們能夠用于廣泛的用途。
[0083]現(xiàn)在參見圖1和圖2,圖示的本發(fā)明實施方案的流式細胞儀包括一個起固定或提供用至少一種熒光染色劑染色的粒子或者細胞以用于分析作用的粒子或細胞源I。這些粒子或細胞以一種方式被保藏在噴嘴2中,這種方式使得粒子或者細胞被引入液流或者鞘液3中。通常將一些鞘液從鞘液源4提供到鞘液3中從而當(dāng)粒子或者細胞源I將粒子或細胞供給鞘液4時,他們并行地通過噴嘴2提供。
[0084]從這種形式中可以容易地理解鞘液3是如何為粒子或細胞形成鞘液環(huán)境的。由于各種液體是以某種壓力提供到流式細胞儀中的,它們流出噴嘴2并離開噴嘴口 5。通過提供可以用振蕩控制器7進行精確控制的某一類型振蕩器6,可以在噴嘴2內(nèi)建立壓力波并將壓力波傳送到在噴嘴口 5處離開噴嘴2的流體中。由于振蕩器6在鞘液3上起作用,離開噴嘴口 5的流體8最終形成規(guī)則排列的液滴9。由于粒子或細胞被液體流或鞘液環(huán)境所包圍,液滴9可能在其內(nèi)部帶走單個分離的粒子或者細胞,這些粒子和細胞在本發(fā)明的某些實施方案中是精子細胞。
[0085]由于液滴9能夠帶走粒子或細胞,因此根據(jù)粒子或細胞的特征,該流式細胞儀可被用于分離粒子、細胞、或者精子細胞等類似的物質(zhì)。這可以通過粒子或細胞感應(yīng)系統(tǒng)10來完成。這種粒子或細胞感應(yīng)系統(tǒng)至少包含可以對液流8中所含有的粒子或細胞產(chǎn)生響應(yīng)的某種類型的檢測器或傳感器11。粒子或細胞感應(yīng)系統(tǒng)10可根據(jù)是否具有某一特征而產(chǎn)生響應(yīng),例如結(jié)合到粒子或細胞或細胞中的DNA上的熒光染色劑,熒光染色劑在被如激光勵磁機12所產(chǎn)生的能夠使粒子產(chǎn)生響應(yīng)的光束的照射源激發(fā)后產(chǎn)生響應(yīng)。當(dāng)每種類型的粒子、細胞或精子細胞的核DNA被用至少一種熒光染色劑染色時,根據(jù)所用特定類型的熒光染色劑所能夠結(jié)合到的所述部位的數(shù)量的不同,結(jié)合到每一個單個粒子或細胞的熒光染色劑的量是不同的。對于精子細胞,Hoechst33342染色劑可以結(jié)合到的部位取決于每個精子細胞所含的DNA的量。由于帶X-染色體的精子所含有的DNA的量比帶Y-染色體的精子所含的DNA的量多, 因此,帶X-染色體的精子比帶Y-染色體的精子所結(jié)合的熒光染色劑的量就多。因此,通過激發(fā)后,通過測量結(jié)合的熒光染色劑所發(fā)出的熒光,就能夠區(qū)別帶X-染色體的精子和帶Y-染色體的精子。
[0086]為了根據(jù)粒子或細胞的特性而達到分離的目的,可以通過傳感器11接收所發(fā)射的光并且反饋給某種類型的連接到液滴充電器上的分離辨別系統(tǒng)或分析器13,液滴充電器根據(jù)液滴9所含的粒子或細胞的特征而使每個液滴9帶上不同的電荷。以這種方法根據(jù)液滴中是否含有合適的粒子或細胞,分離辨別系統(tǒng)或分析器13起到了讓靜電偏轉(zhuǎn)極板14使液滴9偏移的作用。
[0087]因此,流式細胞儀起到通過使粒子或細胞指向一個或多個收集容器15而達到使粒子或細胞16分離的作用。例如,當(dāng)分析器基于精子細胞的特征區(qū)別精子細胞時,含有帶X-染色體的精子液滴被帶上正電并且因此在一個方向上偏移,而含有帶Y-染色體的精子液滴被充上相反的負電荷并且因此向另一個方向偏移,并且廢棄的液流(不帶粒子或細胞或帶有不需要的或者帶有未篩選細胞的液滴)被留下而未被充電并且因此在未發(fā)生偏移的液流中被收集到抽吸管或者類似的容器中,如美國專利申請09/001,394中所論述的,在此引入作為參考。自然地,可以建立很多偏移軌道并同時收集。
[0088]為了常規(guī)的將粒子、細胞、精子細胞或精子(完整的、活的、固定的、有活力的、沒有活力的或者是核)分離成高純度的帶有X-染色體和Y-染色體的群體,所用的粒子鑒別裝置或方法應(yīng)當(dāng)提供高分辨率的區(qū)別特征以作為分析和分離的基礎(chǔ)。[0089]針對精子,如上面所述,對結(jié)合到帶有X-染色體的精子細胞的核DNA上的熒光染色劑所發(fā)出的光和結(jié)合到帶有Y-染色體的精子細胞的核DNA上的熒光染色劑所發(fā)出的光之間的區(qū)別進行鑒定可能是困難的。
[0090]在許多應(yīng)用中,由多個發(fā)射事件入射到可以是光電倍增管的檢測器上的總發(fā)射光可以較高,而待區(qū)分的各發(fā)射事件的發(fā)射光之間的差別可以較小。
[0091]當(dāng)光發(fā)射事件以高速率連續(xù)發(fā)生并且光發(fā)射事件之間的間隔時間很短時,就象用流式細胞儀進行高速細胞篩選一樣,這樣的問題會加重。當(dāng)根據(jù)所結(jié)合的熒光染色劑的區(qū)別來分離粒子、細胞或者精子細胞時,可以產(chǎn)生流過激發(fā)源的細胞并且每秒有大量的發(fā)光事件發(fā)生。因此,液流中能夠發(fā)光的粒子、細胞或者精子細胞的數(shù)量可能很多。隨著流速的增加,激發(fā)源的截取點變得非常明亮。光電倍增管光電陰極上的這種高水平的入射光會導(dǎo)致與背景信號比例非常低的信號。當(dāng)使用象Hoechst33342 —類的熒光染色劑標記精子細胞的核DNA時,背景信號的量會進一步加重。
[0092]解決這一問題的許多方法集中在通過在光電倍增管前放置光學(xué)濾光片來降低光電陰極管的總光通量。這種方法并未改變信號與背景信號的比例,后來的提高光電倍增光的靈敏度的嘗試產(chǎn)生了額外的背景信號,因為來自背景信號的數(shù)量使光電倍增管達到了飽和。
[0093]典型地,光電倍增管的工作電壓范圍約為400伏特到約900伏特。由Hamamatsu公司提供的象光電倍增管R928以及R1477 —類的標準光電倍增管的線性操作下限約為300伏特。因此,裝配用光電倍增管的設(shè)備或裝置在等于或大于400伏特下操作光電倍增管。即使陽極電子數(shù)減少到所需要的程度,如美國專利4,501,366和5,880,457所公開的,光電陰極和一號二次發(fā)射極之間的電壓保持高伏特數(shù)并且通過降低剩余二次發(fā)射極的電壓或者過濾掉電子所固有的暗噪音和散粒噪聲來實現(xiàn)陽極電子的減少。
[0094]出乎意料的,將光電倍增管的伏特數(shù)降低到低于400伏特到約280伏特,或者約250伏特,或者甚至到O伏特時,即使當(dāng)從每一個光發(fā)射事件的總發(fā)射光量較高或者甚至當(dāng)每秒發(fā)生的光系列事件數(shù)很多時,也可以使光發(fā)射的細微差別能夠被區(qū)分開。針對照射結(jié)合到精子細胞的核DNA上的熒光染色劑所產(chǎn)生的光發(fā)射事件的速率,在分離帶X-染色體的精子和帶Y-染色體的精子期間,本發(fā)明允許光發(fā)射事件所能夠達到的速率增加到每秒至少5000個可分離事件,每秒至少6000個可分離事件,每秒至少7000個可分離事件,每秒至少8000個可分離事件,每秒至少9000個可分離事件,每秒至少10,000個可分離事件,每秒至少11,000個可分離事件,每秒至少12,000個可分離事件,每秒至少13,000個可分離事件,每秒至少14,000個可分離事件,每秒至少15,000個可分離事件,每秒至少16,000個可分離事件,每秒至少17,000個可分離事件,每秒至少18,000個可分離事件,每秒至少19,000個可分離事件,每秒至少20,000個可分離事件,每秒至少25,000個可分離事件,每秒至少30,000個可分離事件,每秒至少35,000個可分離事件或者更高。
[0095]作為一個具體的實施例,裝配現(xiàn)有的Cytomation SX MoFlo?流式細胞儀在400伏特低限下 操作光電倍增管??烧{(diào)整增益值在高壓而不是在低壓下操作光電倍增管。SX MoFlo?流式細胞儀可以通過再裝配光電倍增管調(diào)節(jié)器被改換??梢杂?.0K的電阻器替換第三通道的R16C電阻器(2.49千歐姆)以改變放大器的增益值從而控制光電倍增管。這種轉(zhuǎn)換使光電倍增管可在約280伏特下被操作。類似的轉(zhuǎn)換可以是平行使用兩個帶3.75千歐姆電阻器的SX MoFtos流式細胞儀,或者使用一個可以使光電倍增管分別在約200伏特或略高于零伏特的電壓下被操作的1.3千歐姆的電阻器。針對這種轉(zhuǎn)換,由于在典型的操作電壓范圍之外操作光電倍增管,也可以去除在光電陰極前的中密度濾光片。
[0096]出乎意料的是,由于通過光電倍增管將信號轉(zhuǎn)換成電信號使這種轉(zhuǎn)換提高了光發(fā)射事件的信號對噪聲的比率,然后通過提高增益放大器到分析器13的模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器的合適水平以放大更清晰的信號并且輸出生產(chǎn)的單變量或雙變量直方圖。
[0097]現(xiàn)在參考圖3,在利用本發(fā)明(圖3a)之前,比較三個不同的SX VloF1li (#1,#2,#3)流式細胞儀的單變量直方圖,并且顯示了用本發(fā)明(圖3b)中有關(guān)分離完整的活的噴射出的牛精子。正如從單變量直方圖中所能夠理解的,利用本發(fā)明實質(zhì)上可以提高完整的活的帶X-染色體的精子17和活的帶Y-染色體的精子18的分離度(由峰谷所代表的帶X-染色體的精子和帶Y-染色體的精子的表觀差異)。
[0098]在利用本發(fā)明實施方案之前用SX MoFkf流式細胞儀對于帶X-染色體的精子和
帶Y-染色體的精子的完整活精子分離速度或篩選速度約為17.9xl06/4.5小時(即在兩種流束中-第一種流束是帶X-染色體的精子而第二種流束是帶Y-染色體的精子的分離或篩選速度約為每秒1,100),純度約為87%,范圍是84%到93%。對于三種篩選的可分離事件的速率分別為22000,23000,以及20000。
[0099]經(jīng)過上述轉(zhuǎn)換后活精子的平均篩選速率約為40.3x106/4.5小時(即約每流束每秒約為2,500),純度為90.8%,范圍是89%到92%。對于三種篩選的事件速率分別是每秒13000,15, 000、以及 19,500。
[0100]從數(shù)據(jù)中可以看出本發(fā)明這一實施方案不僅能導(dǎo)致分離的精子群的純度提高而且能使分離或者篩選速率超過一倍,而可分離事件的速率實際上降低了。
[0101]類似的,現(xiàn)在參見圖4和圖5,它們顯示了在利用本發(fā)明之前(圖4)和按照上述轉(zhuǎn)
換之后(圖5)利用SX MoFloei流式細胞儀#I對牛的完整的活精子篩選的雙變量直方圖。在利用本發(fā)明之前,先于440伏特下在光電陰極處將激光調(diào)整到135MW,I倍的增益以及1.0中密度濾光片(1/10振幅)操作SX MoF1r'流式細胞儀,每秒約10,000事件。接著用本發(fā)明,在光電陰極處于約262伏特下操作SX MoFlo?流式細胞儀,將激光調(diào)整到大約100MW,
4倍增益并且不用中密度濾光片,每秒約10,000可分離事件。由這些數(shù)據(jù)中可以理解,帶X-染色體群體19和帶Y-染色體的群體20之間峰谷深度的增加證明了分辨率有很大的提聞。
[0102]類似的,現(xiàn)在參考圖6和圖7,分別顯示了在如圖3和圖4所示的相同參數(shù)下,在用本發(fā)明實施方案之前用SX MoFlog流式細胞儀#2對公牛完整的活精子篩選得到的雙變量直方圖(圖6)以及使用本發(fā)明實施方案進行操作的直方圖(圖7)。又一次通過帶X-染色體群體21和帶Y-染色體的群體22之間峰谷的深度證明了分辨率有大幅度提高。
[0103]現(xiàn)在參見圖8和圖9,顯示了在利用本發(fā)明實施方案前(圖8)和之后(圖9)用SX MoFlo?流式細胞儀 對完整的活馬精子分離或篩選得到的雙變量直方圖。當(dāng)用本發(fā)明的實施方案時,用光電倍增管在低于300伏特的電壓下在IOOmW功率的激光下分離或篩選活馬精子時,分離速率或篩選速率超過每秒4,800,平均每秒12,000事件。帶X-染色體的群體23和帶Y-染色體的群體24提高的分辨率是驚人的。數(shù)據(jù)顯示同不用本發(fā)明實施例的5個分離通道之間的峰值相比較,利用本發(fā)明實施方案可以達到約8到9個分離通道,已被篩選的帶X-染色體的群體和帶Y-染色體的群體的純度約為93%。
[0104]現(xiàn)在參見圖10,它顯示了用本發(fā)明實施方案篩選的分離的用Hoechst33342染色的種馬精子核(S-05400)點繪制的單變量和雙變量直方圖。精子核是由新射出的種馬精子制備的。通過離心,超聲處理洗滌精子并且所得到的用Percoll密度梯度離心分離頭部和尾部。用2%的福爾馬林洗滌,固定分離的頭部,然后用Hoechst33342染色。用疊氮化鈉(0.5%)固定被染色的核。樣品在每秒5000事件下流出以制得直方圖。然后染色的核被用于對按照上述本發(fā)明的實施方案所轉(zhuǎn)化的合并了光電倍增管的SX MoF1b流式細胞儀進行校準。補償被用于校準兩種群體的雙變量繪制中(染色的X和染色的Y)。注意馬精子核的兩個群體如單變量繪制所示,幾乎完全被基線消除。
[0105]現(xiàn)在參考圖11,對SX MoFloe流式細胞儀的特別改進包括平行使用兩個電阻器以提供1.8K的修正值。兩個3.57K的電阻器25和26相當(dāng)于約1.785K,足夠接近有效值。利用這種改進,在這一特定的儀器上的光電倍增管可以在200伏特下運行。自然的,可以對用光電倍增管的其它流式細胞儀或其它儀器進行改進以測量來自特定事件的發(fā)射光量。圖12提供了本發(fā)明特定實施方案的電子概要圖。
[0106]本發(fā)明的另一個重要的實施方案是降低了光束的光學(xué)圖案的高度。如圖13a所示,形成常規(guī)的照射光束的光學(xué)裝置產(chǎn)生的光束圖案27的高度比通過光束的精子細胞頭部28更高或高很多。因此,有多于一個的含有結(jié)合到DNA上的熒光染色劑的精子頭部同時進入光束圖案中。在這種情況下,多個含有結(jié)合到DNA上的熒光染色劑的精子頭部可以同時被激發(fā)而在單一 發(fā)射事件中發(fā)出熒光。這樣,在先前或后來的發(fā)射事件可能包括了光束圖案27中其它精子頭部所貢獻的偶然光通量。這導(dǎo)致能夠辨別帶X-染色體的精子和帶Y-染色體的精子的光發(fā)射事件之間平均光通量的差異降低。這也使得帶X-染色體的精子或帶Y-染色體的精子的比較光發(fā)射事件之間的平均光通量的差異降低。重要的是,結(jié)合到多個DNA上的熒光染色劑被同時激發(fā)提高了事件的平均亮度,使得事件之間的可測量光通量差異占總發(fā)射光通量的百分比更小。這使得對事件之間的差異進行定量更加困難。
[0107]如圖13b所示,通過減少光束形狀的高度,在同一測量事件期間高度降低了的光束圖案29中多個精子頭部重合的情況減少。這導(dǎo)致區(qū)別帶X-染色體的精子和帶Y-染色體的精子的光發(fā)射事件之間的平均差異變大。這也能夠使所測量的每一個發(fā)射事件的總平均光通量減少。對于用于對具有約9 μ m的牛精子進行篩選的本發(fā)明的特定的實施方案,發(fā)現(xiàn)光束的高度可以約為20 μ m。在本申請中,發(fā)現(xiàn)小于20 μ m的垂直光束高度不能提供分辨率的額外的增益。
[0108]參見圖14,應(yīng)當(dāng)理解利用降低了光束圖案高度的光學(xué)裝置可以提高已經(jīng)用Hoechst33342染色的篩選的帶X-染色體的牛精子群(圖14a)和篩選的帶Y-染色體的精子群(圖14b)的純度。這對于單變量峰的25%和40%的篩選通道都是正確的。正如可以從圖14中進一步理解的,不依賴本發(fā)明的任何其它方面只降低了光束圖案高度的光學(xué)裝置就可以提高分離精子的純度,例如上述本發(fā)明實施方案中對光電倍增管電路系統(tǒng)的改進(新PMT),或者可以結(jié)合使用本發(fā)明實施方案的改進的光電倍增管以進一步提高分離精子樣品的純度。
[0109]降低了光束圖案高度的光學(xué)部件的另一個優(yōu)點是精子通過激發(fā)激光束或者照射光束的時間可以減少。減少激發(fā)激光束的照射時間可以減少對精子的壓力和破壞。
[0110]再次參考圖14b,可以理解降低了高度的光束圖案可以結(jié)合比常規(guī)使用的具有更大面積的照射光束圖案一起使用。例如,如圖14a所示的常規(guī)橢圓型光束圖案27約30 μ mX80 μ m,而本發(fā)明用于使帶X-染色體的精子和帶Y-染色體的精子之間產(chǎn)生最佳分辨率以對牛精子分類的光束具有20 μ mX 160 μ m的光束圖案29。20 μ mX 160 μ m的光束圖案的面積是3(^111\8(^111光束圖案的1.3倍。這時,入射點的能量損失成反比。這使得在不考慮加強照射對精子的破壞的情況下能夠提高激發(fā)激光的強度。例如,如果具有常規(guī)光束圖案的光學(xué)裝置產(chǎn)生30 μ mX80 μ m放射光束圖案并且常規(guī)的以150mW對勵磁激光器充電,然后以300mW對本發(fā)明特定實施方案中具有20 μ mX 160 μ m光束圖案的勵磁激光器進行充電而不增加入射點的總強度。另外,勵磁激光器可以在150mW下運行以得到降低單位面積照射能量,減少照射損害,延長激光器壽命等的好處。
[0111]同傳統(tǒng)成形光束的光學(xué)裝置以及傳統(tǒng)的光電倍增管放大設(shè)備相比較,降低了高度的光束圖案的光學(xué)裝置的發(fā)明以及光電倍增管放大作用的發(fā)明能夠?qū)-染色體和帶Y-染色體的精子群的純度提高約4%或者更多。
[0112]可將成形光束的光學(xué)裝置30安裝到如圖15和圖16所示的流式細胞儀上。正如可以理解的,通過激光激發(fā)結(jié)合到精子所含DNA上的熒光染色劑所發(fā)出的光31能夠用相對于精子頭部平面28為O度和90度的光電倍增管32在 其流經(jīng)勵磁激光器光束圖案時進行檢測。
[0113]正如所能夠理解的,必須以精確的形式抽吸染色的精子以通過激發(fā)光束或者照射束從而使每個精子的頭部同精子頭部的表平面取向一致朝向光電倍增管零度檢測器。對精子的DNA含量的精確檢測只可以通過測量漿形精子頭部28的表面來測定。這樣,只有那些能夠以合適的取向進入激發(fā)光束的精子群可以根據(jù)DNA含量被精確測量并被分類。
[0114]現(xiàn)在參見圖17,18和19,本發(fā)明特定實施方案也可以由粒子或精子細胞的定向噴嘴33在精子經(jīng)過光電倍增管前面時通過液壓動力迫使扁平的精子頭部取向正確。如圖17所示,定向噴嘴具有內(nèi)表面34形成類似圓錐形狀。內(nèi)部的錐形從入口端35的圓形逐漸變成流出口尖端管口 36的非常橢圓的形狀。管口 36應(yīng)當(dāng)是圓形而不是橢圓形。因此,定向噴嘴34的內(nèi)部樣貌(internal aspect)由一個圓形入口到一個狹窄的橢圓形再到一個緊靠管口 36前面的圓形出口??梢酝ㄟ^圖18所示的定向噴嘴的交叉部分進一步闡明內(nèi)部形狀。
[0115]如圖19和21所示,注射管37直徑約為0.061英寸可以同定向噴嘴(或者常規(guī)噴嘴)33 —起使用,注射管可以在末端附近傾斜以形成葉片38。扁平葉片38以與定向噴嘴33中橢圓的最大徑向成90度角定向。注入針的內(nèi)徑可以約為0.010英寸以扁平針管葉片38中心形成圓形的管口 39。
[0116]在傾斜的注射管的特定實施方案中通過圖21說明了傾斜葉片可以漿形安裝。漿形傾斜的葉片可有助于在噴嘴(常規(guī)噴嘴或定向噴嘴)中保持鞘液層流。這樣,通過漿形傾斜葉片保持液體層流而顯示出對注入其中的物質(zhì)的破壞更少。通過本發(fā)明的一個特別實施方案中的具有漿形傾斜葉片的注射器管保持了引入鞘液層流的精子,并使精子分類速率比用常規(guī)注射管技術(shù)提高了 20%、30%、40%、50%或者甚至更高。高速的精子分類速率可以實現(xiàn)每秒每種性別的分類速率約為4,000到10,000。甚至可以在這樣高的分類速率下產(chǎn)生高純度(90%或者甚至更高)的帶X-染色體和帶Y-染色體群體。具有傾斜漿形頂端的注射器管的發(fā)明可以獨立使用或者結(jié)合使用這里所描述的其它發(fā)明如美國專利申請09/454,488或PCT/US00/42350中所描述的其它技術(shù),在此引入作為參考。
[0117]如圖21所示,傾斜的葉片注射管發(fā)明或者傾斜的漿形葉片發(fā)明的實施方案可以還包括層流增強凹槽40。層流增強凹槽40有助于保持層流流入注射器管的管口。再一次,增強的層流使更多的精子在層鞘液中保持正確的取向從而導(dǎo)致可分類事件速率更高接著導(dǎo)致每一個性別或精子的分類速率提高。
[0118]在本發(fā)明的另一個實施方案中,可以調(diào)整定向噴嘴口 39或其它常規(guī)噴嘴口大小使形成的液滴包封離開管口 39的完整的活精子。在常規(guī)的精子細胞夾帶技術(shù)中沒有包封精子細胞的技術(shù)。相當(dāng)一部分精子細胞的尾部留在液滴外。例如當(dāng)液流的壓力為約每平方英寸50磅時牛精子細胞具有約13.5微秒的長度(即完整長度的精子細胞以每平方英寸50磅的液流壓力通過照射光束的時間長度)。用于夾帶牛精子細胞的常規(guī)液滴成形技術(shù)從直徑約為70微米管口的噴嘴中形成一個14微秒液滴(即在液流中形成一個液滴波形所需要的時間),該液滴可以對35千赫下運轉(zhuǎn)的振蕩器產(chǎn)生響應(yīng)。因此,一部分精子細胞尾易于從液滴中伸出。為了防止精子細胞尾從液滴中伸出,液滴包封發(fā)明中的一個實施方案提供了一個約100微米的管口,它在約30千赫下,每平方英寸約50磅下,產(chǎn)生一個約28微秒的液滴。通過對完整活精子細胞的完全包封,包括尾部,精子細胞同噴嘴之間的因液滴充電造成的相互影響更小并且液滴的偏轉(zhuǎn)更加精確。這導(dǎo)致帶X-染色體的精子和帶Y-染色體的精子之間減少了交叉污染并且也使偏移的精子被更均一的收集。偏移一致的精子指向由不同液體緩沖的收集面。如美國專利申請09/001,394中所描述的,對分離的精子進行緩沖對于減少壓力是重要的, 在此引入作為參考。針對來自其它哺乳動物物種的精子,可以改變本發(fā)明以產(chǎn)生各種大小的液滴來包封不同長度的精子細胞。根據(jù)精子的長度和液流的壓力,液滴包封的發(fā)明仍然能夠達到液滴形成速率至少為每秒10,000個液滴,每秒至少20,000個液滴,每秒至少30,000個液滴,每秒至少40,000個液滴,每秒至少50,000個液滴,每秒至少60,000個液滴,每秒至少70,000個液滴,每秒至少80,000個液滴,每秒至少90,000個液滴,每秒至少100,000個液滴,等等直到在液滴包封發(fā)明的一些實施方案中達到約每秒200, 000個液滴。
[0119]即使用定向噴嘴發(fā)明,光束圖案中仍然有一定量的取向不正確的精子或者粒子。如上面所描述的,如果精子頭的取向不正確,那么根據(jù)發(fā)射光測定的DNA含量就不準確。本發(fā)明的特定實施方案提供了去除液流中不需要的取向不正確的精子(RUUS)或者粒子。
[0120]現(xiàn)在參見圖16和20a,可以理解對精子DNA含量的精確測定取決于槳形精子頭部28表面對于檢測器的取向是正確的。因此,只有那部分如圖16和20a所示的以正確取向進入了激發(fā)光束的精子可以被精確測定并且根據(jù)DNA含量被分成帶X-染色體和帶Y-染色體的群體。如圖20a和20b所示,以正確取向通過激發(fā)光束的精子產(chǎn)生一個定向的發(fā)射信號圖40,其形狀同圖20d所示的由未定向的精子產(chǎn)生的未定向的發(fā)射信號圖41不同。自然,由未定向的精子產(chǎn)生未定向發(fā)射信號圖41的變化是取決于激發(fā)光束中精子的不正確取向的程度。這些不正確的取向包括圖20c所示的取向,但是也包括轉(zhuǎn)動精子頭部取向的所有形式,任何一部分旋轉(zhuǎn)使得槳形頭部表面的取向沒有同檢測器對準(正確的對準如圖16所示),或者任何一種使得精子頭部的軸42的取向轉(zhuǎn)到流向準線外的旋轉(zhuǎn)。自然地,對不同物種之間的正確取向的定義是不同的。對于某些精子頭部不是槳形的物種,可以通過其它解剖學(xué)特性或者信號特性,對激發(fā)光束中精子的正確取向,或者相對于檢測器的正確取向或相反進行定義。不過,可以將激發(fā)窗口內(nèi)取向正確的不同物種精子生成的最佳信號作為后面與之比較的一系列發(fā)光事件的標準發(fā)射信號圖。
[0121]通過每一個發(fā)射信號圖(或完整區(qū)域或者兩者同時比較)與定向的哺乳動物精子確定的標準發(fā)射信號圖(或標準完整區(qū)域或者兩者同時比較)的形狀比較,可鑒定未定向的精子,從單變量或者雙變量直方圖中減去未定向精子的信號,并且如果需要可以確定地去除未定向的精子,從而未定向的精子既沒有被收集到帶X-染色體的群體中也沒有被收集到帶Y-染色體的群體中。
[0122]重要的是,本發(fā)明提高了要分離的兩種精子群之間的分辨率從而提高了從一種群體中分離出另一種群體的速率,并且提高了分離群體的純度。因此,現(xiàn)在就可以以極高的速度對精子分類。可分類或者可分離事件的速率可以到達每秒約35,000個(不包括同時發(fā)生事件一多個精子同時在激發(fā)/檢測窗口)。與可分類或者可分離事件的速率相關(guān)的高分離或分類速率可以為每秒約5000到約11,000個每種性別的完整活精子,并具有90%、92%、93%、95%或者更高的純度。上面描述的發(fā)明可以通過將分類或分離速率降低到每秒約2000個每種性別的活精子而使得甚至更高純度的帶X-染色體和帶Y-染色體群體能夠以約97%到約98%或者甚至更高的純度獲得。
[0123]正如可以理解的,上面描述的發(fā)明對于達到最高可能分類或分離事件的速率以及最高可能獲得的分離速率是特別重要的,分離速率可以為每種性別每秒至少1,000個分離物,每秒至少2,000個分離物,每秒至少3,000個分離物,每秒至少4,000個分離物,每秒至少5,000個分離物,每秒至少6,000個分離物,每秒至少7,000個分離物,每秒至少8,000個分離物,每秒至少9,000個分離物,每秒至少10,000個分離物或者更高。
[0124]如上所述,本發(fā)明可以供精子的高速分類之用,即使當(dāng)對這些精子染色困難,或者由于具有其它解剖學(xué)或化學(xué)特性而使得區(qū)分帶X-染色體和帶Y-染色體群體之間的差別更加困難。即使在這些困難的情況下,仍然能夠按如上所述通過使可分離事件的速率為約每秒15,000-20,000個可分離事件而達到將高純度的帶X-染色體和帶Y-染色體牛精子群以92%到93%的純度分離,并且每種性別(帶X-染色體以及帶Y-染色體)分類或分離完整的活精子的速率為每秒2000個每種性別的完整活精子。
[0125] 現(xiàn)在參見圖23和24,本發(fā)明的一個實施方案利用差別干擾對比技術(shù)以測量粒子或囊狀物的體積。本發(fā)明的一個基本的實施方案可以包括具有不同體積的粒子,例如帶X-染色體以及帶Y-染色體的精子細胞的頭部28的體積差異。電磁輻射源43產(chǎn)生具有對粒子或者精子細胞頭部28之間的體積差異產(chǎn)生不同的響應(yīng)的初始波形特征的電磁輻射或者電磁輻射光束44。電磁輻射可以是激光,但是也可以是各種類型的電磁輻射,包括但是不限于微波輻射、紫外輻射等。當(dāng)穿過含有相位移動材料的粒子或囊狀物或精子頭部的體積時,電磁輻射通過物鏡45聚焦到對電磁輻射波形特征產(chǎn)生響應(yīng)的檢測器上46。檢測器可以同分析器47聯(lián)合使用。分析器可以根據(jù)穿過粒子體積前后的波形特征的變化區(qū)分粒子并且能夠根據(jù)積分面積或者信號形狀或者根據(jù)兩者對信號進行分析。在本發(fā)明的特定實施方案中,對波形特征的分析包括當(dāng)穿過粒子、囊狀物或者精子細胞頭部的體積時,將初始波形特征同改變的波形特征疊加。將初始波形特征和相位移動的波形特征疊加能夠以同電磁輻射穿過的相移介質(zhì)的量相關(guān)的形式分別調(diào)整電磁輻射束的強度。本發(fā)明也應(yīng)當(dāng)包括有色濾光片一類的附加過濾設(shè)備48。
[0126]現(xiàn)在參見圖24,光學(xué)裝置發(fā)明的實施方案涉及到使用差別干擾對比光學(xué)裝置,同常規(guī)的與顯微鏡分辨率限度一致的DIC顯微鏡檢測相比較,能夠使實際距離超過光裂縫。在本發(fā)明的這一實施方案中,誘導(dǎo)裂縫比物體的尺寸大,因此導(dǎo)致產(chǎn)生側(cè)面分開的源自一個物體的兩個獨立圖像。第二個改進涉及在離開物鏡的位置用雙折射材料板,例如Savart板。由于雙折射材料不需要放置在物鏡盒中,因此本發(fā)明實施方案易于構(gòu)建。常規(guī)DIC顯微鏡中用的雙折射材料是被稱作Wollaston的棱鏡,它必須放置于物鏡盒中,這就不得不使用為這一目的特別生產(chǎn)的昂貴的物鏡鏡片。
[0127]本發(fā)明實施方案的組件可以互相之間排成一列并且由電磁輻射源43,例如水銀弧光燈;光譜調(diào)節(jié)部件,例如帶通濾波器;偏振調(diào)整部件49,例如薄層起偏器53和對可旋轉(zhuǎn)載片發(fā)生響應(yīng)的光波板54 ;能夠使光線聚集到粒子或者精子細胞上的聚光器51,例如聚光透鏡,或者一套透鏡,或者是顯微鏡物鏡;含有粒子或精子細胞28的液流8,例如在壓力下由噴嘴噴出的液體;收集來自粒子或細胞的光線的光線收集器45,例如50倍高工作距離的顯微鏡物鏡以及管透鏡;將光束分成兩部分或者更多種成分的束分離設(shè)備50,例如Savart板形式的一片雙折射材料,以取向和位置能夠被精確控制的形式裝配;只選擇相應(yīng)于粒子或精子細胞的光的圖像光選擇器,例如一系列的針孔,每個針孔53針對每個形成的圖像,所組成。
[0128]在本發(fā)明的一個實施方案中,可以將部件以通常被稱作Kohler式照明的形式安裝,即光源43或其圖 像位于聚光器45的后聚焦面上。物體的平面圖像最好同物體的光線選擇器55或者針孔53相符合,以捕獲來自單個粒子或精子的光。如圖27和28所示,可以用配件、支柱、和支架將部件安裝在穩(wěn)定的光學(xué)桌或光學(xué)臺上。部件可以以某種形式安裝以使物體平面可以被精確地聚焦。這可以通過用流束位置控制器裝液流來完成,例如測微儀,從而使流束轉(zhuǎn)向以進入焦點或從焦點出來。另外可以給聚光器51裝配一個聚光器位置控制器61以使其在物體平面上聚焦。需要特別注意的使有關(guān)雙折射部件或者束分離器50的裝配,優(yōu)選的是三軸旋轉(zhuǎn)部件。
[0129]現(xiàn)在參見圖25,本發(fā)明實施方案也可以包括利用兩個生成的圖像以確定液流中不對稱粒子的取向,包括但是不限于牛精子細胞一類的精子。本發(fā)明的取向測定的實施方案包括便于對進入能使兩個獨立生成圖像的系統(tǒng)的光偏振化狀態(tài)進行控制的光學(xué)裝置。干涉光學(xué)裝置的發(fā)明可以進一步提供控制進入裝置的光的偏振化狀態(tài)的偏振調(diào)節(jié)元件56。對于取向檢測發(fā)明,對偏振調(diào)節(jié)元件56的選擇可以由兩部分組成,它們在本發(fā)明一個實施方案中帶針孔53的圖像光選擇器55上成像。這可以通過在圖像平面55的結(jié)合面中間放置偏振調(diào)節(jié)部件56來完成,或者使用其它光學(xué)裝置來完成相同的事情。這種部件的一個簡單的例子是一種‘半影板’片,例如由兩個偏振材料的半圓部分組成的,例如可以獨立選擇朝向角度的薄片起偏器。圖像平面中的每個針孔可以落入到所述半球中的一個??梢赃@樣選擇偏振角從而使一個針孔信號53對應(yīng)所述體積,并且與經(jīng)過的物體的方向角度相對獨立,而其它針孔所具有的信號53則在很大程度上取決于這一方向角??梢杂梅治銎?7對這兩種信號進行處理,方式同用常規(guī)多通道流式細胞儀相似,但是僅僅作為一個例子。對于這一實施例,可以制作雙變量點狀圖,并且允許使用者也可以在這一圖上選孔。
[0130]如上面描述的對‘半影板’片的一種改進可以是如圖25d所示的構(gòu)造。所述的兩個相同的半球部分被投影到圖像平面上但是其產(chǎn)生的方式是不同的。反射鏡57將光44分裂成半圓形,并且使它們背靠背再次結(jié)合。每一個半圓穿過一個控制其偏振狀態(tài)的分離工具。本實施方案的優(yōu)點是可以連續(xù)獨立的控制偏振角,因此便于對裝置進行調(diào)整。本實施方案所用的材料可以由標準的光學(xué)供應(yīng)廠商提供,并且能夠用類似用于干涉光學(xué)裝置的裝配材料安裝在設(shè)備中。
[0131]現(xiàn)在參見圖26,為了修正由于讓光線通過了透明物質(zhì)的非平面區(qū)域而引入的人為假相,例如一個大體上是圓柱形但是也包括了其它幾何形狀的液流,本發(fā)明的實施方案公開了將一個同非平面區(qū)域形狀相似但是相對折射指數(shù)相反的結(jié)合部件。流式細胞儀中的特定情況是一個近似圓柱的形狀。由于事實上要把將要被測評的物體置于柱狀水流內(nèi),對因此引入的人工假相進行修正是在折射指數(shù)更高的透明材料59中合并放置一個能夠形成透明柱面形狀的光學(xué)部件58。優(yōu)選的是液流和補償元件的圖像相互落在各自圖像平面的頂端。這可以通過在物鏡和圖像平面之間放置補償元件并結(jié)合使用輔助透鏡來完成。
[0132]光學(xué)部件58的一個實施方案是放置于具有更高折射指數(shù)的透明材料的薄片內(nèi)59,例如玻璃或者有機玻璃,在材料上鉆一個柱形孔。有機玻璃的好處是比較容易在其上鉆一個圓形通道。可以用透明材料填充柱形孔,填充的透明材料的折射指數(shù)低于周圍的材料。該材料與其周圍材料之間折射指數(shù)的差異同某些應(yīng)用中流束中的水和周圍空氣之間折射指數(shù)的差異一樣但是相反。只要所用透鏡的放大率能夠使圖像平面中得到圖像的大小一樣,就沒有必要使柱面的大小同水流相同。在一些應(yīng)用中,希望或需要調(diào)整折射指數(shù)的差異以補償這種放大。用有 機玻璃制造這種元件十分簡單,并且可以由眾多的對有機玻璃或者所挑選材料進行機械加工具有經(jīng)驗的機械工場完成。可以將其規(guī)格制備成符合光學(xué)裝配零件的標準以便于結(jié)合到光學(xué)裝置中。
[0133]完全匹配的折射指數(shù)是困難的。本發(fā)明的一個便于調(diào)整的實施方案是使得有機玻璃,或其它所選擇的材料中的物質(zhì)一即一種透明折射指數(shù)液體58 —可以是有機油類,或者是具有同想要的折射指數(shù)相近的油類的混合物,但這些僅僅是舉例。由于許多液體的折射指數(shù)比固體或玻璃更容易隨溫度變化,有可能通過溫度對折射指數(shù)的差異進行精細調(diào)整。這可以通過連接一個溫度控制器60來完成。
[0134]光學(xué)部件58的透明液體或者折射指數(shù)液體可以由化學(xué)供應(yīng)廠商提供。這些廠商通常有針對其可供液體折射指數(shù)的數(shù)據(jù)。有些廠商甚至提供專門用于折射液體的液體,并且具有保證和穩(wěn)定的折射指數(shù)。許多廠商提供溫度控制器和恒溫器。對折射指數(shù)液體應(yīng)用熱量的一種實際方式是由熱傳導(dǎo)材料,例如金屬(僅是舉例),所制備的中空裝置,其中含有折射指數(shù)液體。利用許多實驗室擁有的常規(guī)浸式恒溫循環(huán)控制裝置,可以通過該裝置抽水從而保持元件的溫度穩(wěn)定并且可以被控制。
[0135]在本PCT申請中所做的討論的目的是作為一個基本的說明。讀者應(yīng)當(dāng)清楚具體的討論沒有詳細描述所有可能的實施方案;許多替代方式?jīng)]有說明。也沒有對本發(fā)明的一般性質(zhì)做出充分的說明并且沒有清楚地顯示每一個特征或者元件如何能夠?qū)嶋H代表廣泛的功能或者各種替代或者等同元件。這些又一次隱含在本公開中。本發(fā)明以功能取向的術(shù)語描述的地方,功能的每一個方面是通過裝置、子程序、或者程序而實現(xiàn)的。裝置的權(quán)利要求不應(yīng)當(dāng)僅僅包括在描述過的裝置中,也應(yīng)當(dāng)包括方法或者步驟權(quán)利要求以說明本發(fā)明和每個元件行使的功能。說明書或者術(shù)語的目的都不是要限制權(quán)利要求所沒有包括的范圍。
[0136]此外,本發(fā)明和權(quán)利要求的每一個不同元件也可以通過多種方式完成。應(yīng)當(dāng)理解本公開包括了每一個種類似的改變,可以是實施方案中的任何裝置實施方案的變化,一種方法或步驟實施方案的變化,或者甚至僅僅是其中任何元件的改變。尤其是,應(yīng)當(dāng)理解由于本公開涉及到本發(fā)明的元件,對每種元件所用的文字可以用相當(dāng)?shù)难b置術(shù)語或者方法術(shù)語來表達一即使僅僅功能或結(jié)果是一樣的。這些相等的,更廣泛的,或者甚至更一般的術(shù)語應(yīng)當(dāng)被認為是包括在每一個元件或者作用的說明書中。在需要對隱含在本發(fā)明權(quán)利中所覆蓋的廣泛范圍進行詳細說明的地方,這樣的術(shù)語可以被替換。作為但是僅僅一個實施例,應(yīng)當(dāng)理解所有的作用應(yīng)當(dāng)以實施該作用的方法或者導(dǎo)致該作用的元件來表述。類似的,應(yīng)當(dāng)理解所公開的每一個種物理元件都包括了該物理元件所促進的作用。針對這最后一方面,作為但是僅僅是一個實施例,應(yīng)當(dāng)理解“液滴分離器”的公開包括了“分離液滴”作用的公開一不管是否詳細討論過一并且相反的,如果僅僅公開了 “轉(zhuǎn)化液體一氣體”的作用,應(yīng)當(dāng)理解這樣的公開包括了 “液滴分離器”的公開以及甚至“分離液滴”的方法的公開。應(yīng)當(dāng)理解這樣的術(shù)語的替換和改變顯然包括在本說明書中。
[0137]另外,可以建立和出現(xiàn)對所有元件或者應(yīng)用進行各種的組合以及改變。所有這些都可以用于優(yōu)化一個具體應(yīng)用的設(shè)計或性能。
[0138]本申請為取得專利權(quán)所提到的任何法律,法令,條例,或者規(guī)則的行為:專利,或者公開出版物,或者其他本申請為取得專利權(quán)所提及的參考材料在此引入作為參考。具體地說,美國專利申請60/267571,60/239,752,以及60/203,089都在此引入作為參考,這里包括任何數(shù)據(jù)或者附件,并且引入下面表格中的每一篇參考材料作為參考。
[0139]
【權(quán)利要求】
1.分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,該方法包括如下步驟: a.從雄性的哺乳動物物種中收集精子細胞; b.確定所述精子細胞的性區(qū)別特征; c.根據(jù)所述的性區(qū)別特征區(qū)分所述精子細胞; d.將區(qū)分的精子細胞分離成帶X-染色體的精子細胞群和帶Y-染色體的精子細胞群;并且 e.生產(chǎn)分離的帶X-染色體的精子細胞群和帶Y-染色體的精子細胞群,每種精子細胞群的純度大于90%。
2.如權(quán)利要求1所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中所述的根據(jù)所述性區(qū)別特征區(qū)分所述精子細胞的步驟包括,測定所述精子細胞的核DNA的量。
3.如權(quán)利要求2所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其還包括步驟: a.將精子細胞引入液流; b.分析所述液流中夾帶的精子細胞; c.形成液滴,其多數(shù)液滴具有一個所述被夾帶的精子細胞; d.根據(jù)所述液滴夾帶的精子細胞的性區(qū)別特征,使所述的每一個液滴帶上不同的電荷; e.使所述的每一個液滴發(fā)生偏轉(zhuǎn);以及 f.根據(jù)所述液滴夾帶的精子細胞的性區(qū)別特征,區(qū)分收集所述液滴。
4.如權(quán)利要求3所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其還包括,對所述精子細胞核內(nèi)的所述量的DNA進行染色的步驟。
5.如權(quán)利要求4所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其還包括,對所述精子細胞核內(nèi)的被染色的DNA進行照射的步驟。
6.如權(quán)利要求5所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其還包括,檢測經(jīng)照射的所述精子細胞核內(nèi)的被染色的DNA所發(fā)射的熒光的步驟。
7.如權(quán)利要求6所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中所述的檢測經(jīng)照射的所述精子細胞核內(nèi)的被染色的DNA所發(fā)射的熒光的步驟包括,用光電倍增管生成信號。
8.如權(quán)利要求7所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其還包括,在典型的操作電壓以外操作光電倍增管的步驟。
9.如權(quán)利要求5所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中對所述精子細胞核內(nèi)的被染色的DNA進行照射的步驟還包括,產(chǎn)生具有降低高度的照射光束的圖案。
10.如權(quán)利要求9所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中所述降低的高度為,等于所述精子細胞沿縱軸的長度至是所述的精子細胞沿縱軸的長度的三倍。
11.如權(quán)利要求 10所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中所述的精子細胞沿縱軸的長度約為9微米,并且所述照射光束圖案的高度約為20微米。
12.如權(quán)利要求9所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中所述的形成液滴的步驟包括,形成具有足夠大小的液滴以包封所述精子細胞。
13.如權(quán)利要求12所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其還包括,從具有管口的噴嘴中噴出所述液流的步驟,其中所述的管口具有70微米的直徑。
14.如權(quán)利要求13所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其還包括步驟: a.針對檢測器,定向所述的精子細胞; b.檢測對精子細胞針對所述檢測器的取向具有不同響應(yīng)特征的光; c.將對精子細胞的取向具有不同響應(yīng)特征的所述光轉(zhuǎn)換成至少一種包含精子細胞的取向信息的信號;和 d.確定所述精子細胞針對所述檢測器的取向。
15.如權(quán)利要求14所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其還包括,根據(jù)所確定的精子細胞針對檢測器的取向,區(qū)別收集所述液滴。
16.如權(quán)利要求1、4、8、9、12或14所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中所述的帶X-染色體的精子細胞群和帶Y-染色體的精子細胞群的純度為選自由約90%到約100%之間,約91%到約100%之間,約92%到約100%之間,約93%到約100%之間,約94%到約100%之間,約95%到約100%之間,約96%到約100%之間,約97%到約100%之間,約98%到約100%之間,約99%到約100%之間所組成的組。
17.如權(quán)利要求1、4、8、9、12或14所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其還包括建立可分離事件的速率的步驟,該可分離事件的速率為選自由每秒至少5000個可分離事件,每秒至少6000個可分離事件,每秒至少7000個可分離事件,每秒至少8000個可分離事件,每秒至少9000個可分離事件,每秒至少10,000個可分離事件,每秒至少11,000個可分離事件,每秒至少12,000個可分離事件,每秒至少13,000個可分離事件,每秒至少14,000個可分離事件,每秒至少15,000個可分離事件,每秒至少16,000個可分離事件,每秒至少17,000個可分離事件,每秒至少18,000個可分離事件,每秒至少19,000個可分離事件,每秒至少20,000個可分離事件,每秒至少21,000個可分離事件所組成的組。
18.如權(quán)利要求1、4、9、12或14所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中所述的分離所述精子細胞的步驟包括分離速率,該速率為選自由每秒至少500個分離物,每秒至少1,000個分離物,每秒至少2,000個分離物,每秒至少3,000個分離物,每秒至少4,000個分離物,每秒至少5,000個分離物,每秒至少6,000個分離物,每秒至少7,000個分離物,每秒至少8,000個分離物,每秒至少9,000個分離物,每秒至少10,000個分離物所組成的組。
19.如權(quán)利要求1、4、9、12或14所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中所述的形成具有一個被夾帶的精子細胞的液滴的步驟包括液滴形成速率,該速率選自由每秒至少10,000個液滴,每秒至少20,000個液滴,每秒至少30,000個液滴,每秒至少40,000個液滴,每秒至少50,000個液滴,每秒至少60,000個液滴,每秒至少70,000個液滴,每秒至少80,000個液滴,每秒至少90,000個液滴,每秒至少100,000個液滴所組成的組。
20.如權(quán)利要求1所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中所述的哺乳動物物種包括牛科哺乳動物。
21.如權(quán)利要求1所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中所述的哺乳動物物種包括馬科哺乳動物。
22.如權(quán)利要求1所述的分離帶X-染色體的精子細胞和帶Y-染色體的精子細胞的方法,其中所述的哺乳動物物種 包括羊科哺乳動物。
【文檔編號】C12N5/071GK104004710SQ201410254362
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2001年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2000年5月9日
【發(fā)明者】肯尼思·M·埃文斯, 埃里克·B·范·芒斯特 申請人:Xy有限責(zé)任公司
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