一株多環(huán)芳烴降解菌s8-t8-L9及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株多環(huán)芳烴降解菌s8-t8-L9及其應(yīng)用，涉及環(huán)境污染物生物處理。所述一株多環(huán)芳烴降解菌(Bacillus?sp.)s8-t8-L9，登記入冊編號為CGMCC?No.9032?？稍诮到飧鞣N有機化合物中應(yīng)用。所述有機化合物為多環(huán)芳烴類化合物，所述多環(huán)芳烴類化合物包括但不限于萘，菲，芘等化合物。該菌含有與多環(huán)芳烴相關(guān)的基因。這些基因在該菌降解多環(huán)芳烴時發(fā)揮重要作用。該菌能夠利用混合PAHs，萘，菲，芘等多環(huán)芳烴以及柴油作為唯一能源和碳源生長繁殖，該菌20天能將無機鹽培養(yǎng)基中的混合PAHs，萘，菲，芘，柴油降解57.94％，58.46％，52.14％，23.14％，47.54％。
【專利說明】—株多環(huán)芳烴降解菌s8-t8-L9及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境污染物生物處理，尤其是涉及一株多環(huán)芳烴降解菌S8-t8-L9及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]多環(huán)芳經(jīng)(polycyclic aromatic hydrocarbon,PAHs)是分子中含有兩個以上苯環(huán)的碳氫化合物，包括萘、蒽、菲、芘和苯并芘等在內(nèi)的150余種。它們化學(xué)結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，不易揮發(fā)(蒸氣壓:0.0015Χ10-9 ~0.0051mm Hg, 25°C)，難溶于水(0.00014 ~2.lmg/L, 25。。)，溶沸點高(>100 °C ) (Sato H, Aoki Y.Mutagenesis by environmental pollutants andbio-monitoring of environmental mutagens [J].Curr Drug Metab.2002, 3(3): 311-319 ；Phillips DH.Fifty years of benzo (a)pyrene[J].Nature.1983, 303(5917):468-472 ；Sternberg SS.The carcinogenesis, mutagenesis and teratogenesis of insecticides.Review of studies in animals and man[J].Pharmacology&Therapeutics.1979, 6(I):147-166.)。高環(huán)多環(huán)芳烴(四個環(huán)以上)具有“三致”用，即:“致畸”、“致癌”和“致突變”作用。美國環(huán)境保護局列出地優(yōu)先治理污染物黑名單中就包括16種PAHs，其中7種是可能的致癌物質(zhì)，而苯并花是第一個被發(fā)現(xiàn)的環(huán)境化學(xué)致癌物(Autrup H, Harris CC, Trump BF etal.Metabolism of benzo (a) pyrene and identification of the major benzo (a) pyrene-DNAadducts in cultured human colon [J].Cancer Res.1978, 38 (IlPtl): 3689-3696.)。
[0003]海洋中PAHs的主要行為有揮發(fā)、與沉積物互作和生物積累。揮發(fā)過程取決于PAHs的蒸氣壓和溶解度等特征，蒸氣壓越低揮發(fā)率越低，發(fā)生揮發(fā)作用的PAHs主要是兩環(huán)的，四環(huán)以上的PAHs的揮發(fā)作用是很小的；由于PAHs的憎水性使得它易于分配進入富含有機物的沉積物和顆粒物，這給微生物對PAHs降解造成了困難；生物積累其實也是一個PAHs在水和有機物之間平衡分配過程，由于它的高脂溶性，所以易被水生生物吸收(林穎，蔡容華.芳香族化合物生物降解的研究進展[J].福建輕紡.2006，(002):6-10.)。在上世紀80年代就發(fā)現(xiàn)，將烏賊暴露于原油90d后，發(fā)現(xiàn)其組織中的主要PAHs與原油中相同，而萘的富集倍數(shù)高達150倍。1997年，俄羅斯油輪在日本海發(fā)生油的泄漏事故，在該漏油事件發(fā)生后的第I個月，該環(huán)境中一種魚體內(nèi)的PAHs迅速上升，但到第2個月該魚體內(nèi)PAHs濃度又恢復(fù)到原來的濃度。
[0004]微生物降解是海洋環(huán)境(尤其是沉積物環(huán)境)中PAHs去除的最主要途徑，微生物降解分好氧降解和厭氧降解(Dua M, Singh, A.，Sethunathan, N.，Johri, A.Κ..Biotechnology and bioremediation:successes and limitations [J].ApplMicrobiolBiotechnol.2002, 59 (2-3): 143-152.)。多數(shù)好氧降解限速步驟是第一步雙加氧酶對苯環(huán)氧化生成二氫二醇，然后通過斷裂加氧酶的作用使雙羥基化的PAHs開環(huán)，生成中間產(chǎn)物兒茶酚或兒茶酸，再開環(huán)生成乙醛和琥珀酸進入三羧酸循環(huán)。白腐菌或木質(zhì)素降解菌降解PAHs的第一步是通過過氧化氫或蟲漆酶催化生成喹啉，而后苯環(huán)開裂生成羧酸。目前從海洋環(huán)境中分離到的好氧PAHs降解菌主要集中在以下菌屬:Sphingomonas、Novosphingobium、Cyclocasticus、NeptunomonasΛPseudomonasΛ MarinobacterΛ Halomonas0
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株多環(huán)芳烴降解菌(Bacillus sp.) s8_t8_L9。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供一株多環(huán)芳烴降解菌(Bacillus sp.) s8-t8_L9在降解各種有機化合物中的應(yīng)用。
[0007]所述一株多環(huán)芳烴降解菌(Bacillus sp.) s8-t8_L9,已于2014年04月09日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101，登記入冊編號為CGMCC N0.9032。多環(huán)芳烴降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9來源于南大西洋的海底表層沉積物，經(jīng)人工富集培養(yǎng)、分離純化得到。該菌為革蘭氏染色陽性的芽孢屬(Bacillus sp.)的菌株S8_t8_L9，生物學(xué)特性為觸酶陽性，氧化酶陽性，非發(fā)酵型，專性需氧，菌體形態(tài)為呈圓形，乳白色不透明，邊緣規(guī)則，表面光滑凸起，無暈環(huán)，直徑3~4_。該菌的最適生長條件為:pH = 6.5~
8.5’溫度 28 ~30°C。
[0008]所述一株多環(huán)芳烴降解菌(Bacillus sp.) S8_t8_L9可在降解各種有機化合物中應(yīng)用。
[0009]所述有機化合物為多環(huán)芳烴類化合物，所述多環(huán)芳烴類化合物包括但不限于萘，菲，芘等化合物。
[0010]對所述多環(huán)芳烴降解菌(Bacillus sp.) S8_t8_L9進行基因組測序發(fā)現(xiàn)，該菌含有與多環(huán)芳烴相關(guān)的基因。這些基因在該菌降解多環(huán)芳烴時發(fā)揮重要作用。
[0011]實驗證明，該菌能夠利用混合PAHs，萘，菲，芘等多環(huán)芳烴以及柴油作為唯一能源和碳源生長繁殖，該菌20天能將無機鹽培養(yǎng)基中的混合PAHs，萘，菲，芘，柴油降解57.94%, 58.46%, 52.14%, 23.14%,47.54%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為s8-t8_L9在各種碳源中的降解率。
【具體實施方式】
[0013]實施例一:Bacillus sp.s8_t8_L9的分離與降解混合多環(huán)芳烴的性能
[0014]現(xiàn)場采集南大西洋的海底表層沉積物，采用IOOmL海水培養(yǎng)基加入萘、菲、芘混合多環(huán)芳烴在25°C 180r/min條件下進行富集培養(yǎng)。兩周后，在固體培養(yǎng)基(M2)中稀釋涂布平板，得到多株純菌，純菌經(jīng)過接種至液體培養(yǎng)基中驗證其降解石油烴的能力，最后得到一株多環(huán)芳烴烴的高效降解菌s8-t8-L9，該菌經(jīng)16S rDNA鑒定為芽孢菌屬(Bacillussp.)。固體培養(yǎng)基(M2)的成分:乙酸鈉5g/L，檸檬酸鈉0.05g/L，普通肉湯培養(yǎng)基0.5g/L，蛋白胨0.lg/L,酵母粉0.lg/L,蘋果酸0.05g/L,葡萄糖lg/L,鹿糖0.5g/L,硝酸銨lg/L,氯化銨0.2g/L，酒石酸鈉0.05g/L，可溶性淀粉0.5g/L，瓊脂粉15g/L，加海水至1L，調(diào)pH7.5，115°C高壓蒸汽滅菌30min后補加I %體積已滅菌的KH2PO4溶液(10g/L，pH6.7)及0.1%體積 0.22 μ m 濾膜除菌的 FeSO4 (0.4g/L)。
[0015]將BaciIlussp.S8_t8_L9接種至含萘、菲、芘混合多環(huán)芳烴的海水培養(yǎng)基中，在180r/min、25°C搖床中培養(yǎng)20天后，測定該菌對于混合多環(huán)芳烴的降解能力，經(jīng)過測定得到，該菌對含萘、菲、芘混合多環(huán)芳烴的降解率為57.94% (圖1)。
[0016]實施例二:Bacillus sp.s8_t8_L9單多環(huán)芳烴的降解性能測定
[0017]將Bacillus sp.s8-t8_L9接種至不同碳源(萘，菲，芘，柴油)的人工海水培養(yǎng)基(MMC)中，同時設(shè)置底空白對照(只加底物不加菌)，在180r/min、28°C搖床中培養(yǎng)20天后觀察菌株的生長狀況，并測定該菌對各底物的降解率。結(jié)果表明該菌株能夠利用萘，菲，芘，柴油生長，降解率分別為58.46%、52.14%,23.14%,47.54% (見圖1)。
[0018]人工海水培養(yǎng)基(MMC):NaC124g/L，MgSO4.7H207g/L, NH4NO3lg/L, KC10.7g/L,KH2P042g/L, Na2HP043g/L, pH7.4。滅菌后補加適量微量元素混合液,微量元素經(jīng)0.22 μ M濾膜過濾除菌。
[0019]MMC 微量元素混合液=CaCl2, 2mg/L ；FeCl3.6H20, 50mg/L ；CuSO4, 0.5mg/L ；MnCl2.4H20, 0.5mg/L ；ZnSO4.7H20, 10mg/L。
[0020]實施例三:Bacillus sp.s8_t8_L9相關(guān)芳香烴降解基因的應(yīng)用
[0021]將Bacillus sp.S8_t8_L9進行基因組測序，從基因組中尋找與石油烴和芳香烴降解相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)了與芳香烴降解相關(guān)的基因(表1)。
[0022]表1Bacillus sp.s8_t8_L9基因組中與石油烴和芳香烴降解相關(guān)基因
【權(quán)利要求】
1.一株多環(huán)芳烴降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9，于2014年04月09日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，登記入冊編號為CGMCC N0.9032。
2.如權(quán)利要求1所述一株多環(huán)芳烴降解菌(Bacillussp.) s8-t8-L9在降解各種有機化合物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述有機化合物為多環(huán)芳烴類化合物。
4.如權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述多環(huán)芳烴類化合物包括但不限于萘，菲，芘等化合物。
5.如權(quán)利要求1所述一株多環(huán)芳烴降解菌(Bacillussp.) s8-t8_L9,其特征在于其具有與多環(huán)芳烴降解相關(guān)的單加氧酶、P450基因；
6.如權(quán)利要求5所述一株多環(huán)芳烴降解菌(Bacillussp.) S8_t8_L9，其特征在于所述基因在降解芳香烴中應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/07GK104004684SQ201410247988
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】邵宗澤, 王萬鵬, 王淋, 莊玲萍 申請人:國家海洋局第三海洋研究所, 中國大洋礦產(chǎn)資源研究開發(fā)協(xié)會