一種檢測鮭魚種類的方法及其檢測試劑盒和引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測鮭魚種類的方法及其檢測試劑盒和引物。該方法包括以下步驟：(1)以待檢測樣本的基因組DNA為模板，以特異性擴增引物擴增待檢測樣本的基因組DNA，該特異性擴增引物的序列分別如序列表中SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:10所示，(2)將所得PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，有特異性條帶的待測樣本屬于大西洋鮭魚(Salmo?salar)或大馬哈魚(Oncorhynchus?keta)。和傳統(tǒng)方法相比，該方法具有準確性及唯一性。操作人員不需要大量的從業(yè)經(jīng)驗，只需按照操作步驟實驗即可。本發(fā)明所述試劑盒具有所需檢測時間短，成本低，檢測結果特異性高，檢測結果判定方法簡單的優(yōu)點。
【專利說明】一種檢測鮭魚種類的方法及其檢測試劑盒和引物
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及魚類檢測領域，具體涉及一種檢測鮭魚種類的方法及其檢測試劑盒和引物。
【背景技術】
[0002]鮭魚是一類洄游性魚類，廣泛分布在大西洋、太平洋，在大陸淡水湖也能找到。研究發(fā)現(xiàn)，游進溪流的鮭魚，90%都在同一溪流誕生。太平洋品種的鮭魚，一般在繁殖后數(shù)周便會死亡。鮭魚肉、肝、精巢和頭均有藥用價值。其肉有補虛勞、健脾胃、暖胃和中之功效，可以治療水腫、消瘦、消化不良、膨悶脹飽、嘔吐酸水、抽搐、腫瘡等癥。其肝可提制魚肝油。其精巢可提制魚精蛋白和配制成多種魚精蛋白制劑，適應治療過量注射肝素所引起的反應；它對某些出血癥(如上消化道急性出血、肺咳血等)也有明顯的止血作用，是提取制作魚精蛋白注射液和精蛋白鋅胰島素的重要原料。
[0003]鮭魚是魚精蛋白制備的原材料來源。目前，用于魚類鑒別的方法主要是采用傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒別法，即對完整魚體進行形態(tài)特征比對，操作復雜，專業(yè)性強，但是，其最大缺陷在于需要結構完整的魚體，不能有損壞。如果僅以魚組織樣品為材料，采用傳統(tǒng)的整體形態(tài)學手段，則無法進行魚類鑒別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題在于克服傳統(tǒng)的鮭魚傳統(tǒng)形態(tài)學鑒別法需要完整的魚體進行形態(tài)特征比對 ，需要結構完整、不能有損壞的魚體，使傳統(tǒng)鮭魚形態(tài)學鑒別法具有操作復雜，專業(yè)性強的缺陷。采用本發(fā)明的檢測方法檢測鮭魚的種類，所需檢測時間短，成本低，檢測結果特異性高，檢測結果判定方法簡單。
[0005]為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案之一是:(I)提取待檢測樣本的基因組DNA,以其為模板，以特異性擴增引物對擴增待檢測樣本的基因組DNA，所述特異性擴增引物對的序列分別如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2，或SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4,或 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO: 6，或 SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO: 8，或 SEQ ID NO: 9 和 SEQID NO: 10 所示，
[0006](2)將步驟(1)所得PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，有特異性條帶的待測樣本屬于大西洋鮭魚(Salmo salar)或大馬哈魚(Oncorhynchus keta)。
[0007]根據(jù)本發(fā)明，步驟(1)中所述待測樣本為本領域常規(guī)的待測樣本，較佳地為待測魚體的一部分，包括:魚肉，內(nèi)臟，魚頭，魚白，魚籽和魚鱗中的一種或多種。
[0008]步驟(1)中所述提取待檢測樣本的基因組DNA的方法為本領域常規(guī)方法，所述方法較佳地包括以下步驟:
[0009]取魚組織樣品加液氮碾磨IOmin,或者100°C烘5-8小時,待烘干后碾磨lOmin。
[0010]取碾碎后的樣品加入EP管，加入細胞裂解液1ml，加入蛋白酶Κ20μ 1，混勻。
[0011]在60-70°C的恒溫水浴箱水浴10-40min，也可在30_40°C水浴12_24h，間歇震蕩EP管數(shù)次。
[0012]裂解好后，臺式離心機以12000-13000rpm離心5_10min,取上清液小心吸入另一
離心管中。
[0013]加入2倍體積異丙醇，倒轉混勻后，可以看見絲狀物，用吸頭挑出，晾干。
[0014]加入200 μ ITE重洗溶解，加入等量的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)震蕩混勻，轉速12000-13000rpm 離心 5-lOmin。
[0015]取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，震蕩混勻，轉速12000-13000rpm 離心 5-lOmin。
[0016]取上層溶液至另 一管，加入1/2體積的7.5mol/L的乙酸銨，然后加入2倍體積的無水乙醇，混勻后，轉速12000-13000rpm離心5-lOmin。
[0017]小心倒出上清液，吸水紙將管壁殘余液滴除掉。
[0018]用lml70%的乙醇洗滌沉淀物2-3次，轉速12000-13000rpm離心5-lOmin。
[0019]小心倒掉上清液，EP管置烘箱37°C烘3-5小時。
[0020]其中步驟(1)中所述PCR反應的體系較佳地為I XPCR反應緩沖液，10~15mmol/L Mg2+，0.2 ~0.3mmol/L dNTP，0.1 ~0.3 μ M 特異性擴增引物對，0.01 ~0.lU/yLTaq 酶，10 ~IOOng/μ LDNA模板。更佳地為:1 XPCR反應緩沖液，12.5mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTP,
0.2 μ M特異性擴增引物對，0.04U/ μ LTaq酶和50ng/ μ L DNA模板。
[0021]步驟(1)中所述PCR反應的擴增程序較佳的為:(1)93~95°C預變性2~4min，
(2)93~95°C變性28~32，(3) 56~60°C退火28~32s，(4) 72°C延伸I~2min，其中步驟(2)~(4)循環(huán)次數(shù)30~35次，(5)72°C延伸3~5min，(6)4°C終止反應。更佳地為:
(1)94°C預變性 3min，(2) 94 °C 變性 30s，(3) 58°C 退火 30s，(4)72°C 延伸 lmin，其中步驟
(2)~(4)循環(huán)次數(shù)30次，(5)72°C延伸4min，(6)4°C終止反應。
[0022]本發(fā)明所述的方法更佳地還包括步驟(3):將步驟(1)所得PCR擴增產(chǎn)物進行測序，將測序結果與鮭魚科的COI基因進行序列比對，樣品序列與大西洋鮭魚(Salmo salar)或大馬哈魚(Oncorhynchus keta)的COI基因的匹配度≥99%,則確定待測樣本為大西洋鮭魚(Salmo salar)或大馬哈魚(Oncorhynchus keta)。
[0023]基因之間的匹配度由Ident值表示，Ident值是指兩段核酸序列的匹配度，該值越接近100%，說明兩個核酸序列的相似度越高。考慮到基因基因擴增和測序的準確度影響，當Ident值≥99%時，就可以判斷待測物種的基因與目的基因來自同一物種。因此當測序結果與鮭魚屬的COI基因進行序列比對時，若樣品序列與大西洋鮭魚或者大馬哈魚COI基因的Ident值≥99%，則確定待測樣本為大西洋鮭魚或者大馬哈魚。
[0024]步驟(3)所述的測序和序列比對方法均為本領域常規(guī)方法，其中所述的測序的方法較佳地為利用核酸測序儀進行測序，所述序列比對的方法較佳地為利用Blast方法進行序列比對。
[0025]為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案之二是:一種檢測鮭魚種類的試劑盒，其包括特異性擴增引物對，所述特異性擴增引物對的序列分別如序列表中SEQ ID NO:1和SEQID NO: 2，或 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO: 4，或 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO: 6，或 SEQ ID NO: 7和 SEQ ID N0:8，或 SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 10 所示。
[0026]本發(fā)明所述試劑盒較佳地還包括10 X PCR緩沖液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl2。所述的IOXPCR緩沖液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl2都如本領域常規(guī)所述。
[0027]為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案之三是:一種檢測鮭魚種類的引物，其序列如SEQ ID NO:1所示或者如SEQ ID NO: 2所示。
[0028]為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案之四是:一種檢測鮭魚種類的引物，其序列如SEQ ID N0:3所示或者如SEQ ID N0:4所示。
[0029]為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案之五是:一種檢測鮭魚種類的引物，其序列如SEQ ID N0:5所示或者如SEQ ID N0:6所示。
[0030]為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案之六是:一種檢測鮭魚種類的引物，其序列如SEQ ID N0:7所示或者如SEQ ID N0:8所示。
[0031]為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案之七是:一種檢測鮭魚種類的引物，其序列如SEQ ID N0:9所示或者如SEQ ID NO: 10所示。
[0032]本發(fā)明所述檢測鮭魚種類的引物的制備方法為本領域常規(guī)制備方法，較佳地為人工合成全序列，或通過商業(yè)合成本發(fā)明所述引物。
[0033]在符合本領域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。 [0034]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0035]本發(fā)明的積極進步效果在于:本發(fā)明設計的引物依據(jù)為魚類線粒體DNA的COI基因，該基因在不同科的魚類之間既有特異性，又有保守序列。因此，采用該基因的保守序列設計PCR引物，保證擴增出來的DNA具有種的特異性，保證能被測序和鑒定。該方法鑒別魚種準確度高，可重復性強，誤差小，操作人員不需要深厚的物種鑒定背景。
[0036]同時，I)本檢測方法所需樣品為魚的一小塊組織，不需要完整的魚體。2)采用具有特異性的引物擴增cytochrome oxidase subunit I (COI)基因,確保鑒定方法的準確性及唯一性。3)和傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明的操作人員不需要大量的從業(yè)經(jīng)驗，只需按照操作步驟實驗即可。4)本發(fā)明所述試劑盒具有所需檢測時間短，成本低，檢測結果特異性高，檢測結果判定方法簡單的優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0037]下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0038]實施例1檢測鮭魚引物的設計與合成
[0039]1、根據(jù)NCBI (美國國立生物技術信息中心)官方網(wǎng)站，查找三種鮭魚Salmosalar、Oncorhynchus mykiss 和 Oncorhynchus keta 的 COI 基因共計 445 種，羅列部分如下:
[0040]鮭魚的cytochrome oxidase subunit I (COI)基因如下所不:
[0041]FJ999166 FJ998966 FJ998729
[0042]FJ999161 FJ998953 FJ998718
[0043]FJ999155 FJ998950 FJ998712
[0044]FJ999148 FJ998803 EU525057[0045]FJ999131FJ998799 HQ712702
[0046]FJ999122FJ998788 HQ611128
[0047]FJ999118FJ998777 ⑶440432
[0048]FJ999109FJ998767 FJ918927 [0049]FJ998992FJ998756 EF609449
[0050]FJ998986FJ998745 FJ999539
[0051]FJ998973FJ998739 FJ999511
[0052]FJ999508JN007787 EU524353
[0053]FJ999503JN007784 EU524349
[0054]FJ999485JN007779 ⑶324184
[0055]FJ999472HQ961026 HQ339988
[0056]FJ999469HQ960962 EU752177
[0057]FJ999458HQ025008
[0058]KC015282.1
[0059]KCO15281.1
[0060]KC015280.1
[0061]⑶324181.1
[0062]JF693779.1
[0063]JF693777.1
[0064]JF693778.1
[0065]JF693776.1
[0066]JF693775.1
[0067]JF693774.1
[0068]HQ611122.1
[0069]HQ611121.1
[0070]HQ611120.1
[0071]AM911176.1
[0072]2、根據(jù)所得到的基因，利用DNAMAN5.0軟件，通過多基因序列比對，查找這些基因的保守區(qū)域，得到的保守區(qū)域的DNA序列如序列表中SEQ ID N0:11所示。
[0073]3、制備引物
[0074]根據(jù)以上得到的cytochrome oxidase subunit I (COI)基因保守區(qū)域序列，采用DNAMAN5.0設計引物，引物設計參數(shù)設置為:產(chǎn)物長度400~600bp，引物長度18~22bp，Tm值為56~62°C，GC含量為45~55%。
[0075]得到初始引物對22對，根據(jù)多基因序列比對結果，剔除在保守區(qū)域之外的引物對，同時根據(jù)PCR擴增反應的結果，剔除無法得到特異性條帶的引物對，最終選擇制備了 5對引物(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)，所得5對引物分別命名為引物1，引物2，引物3，引物4和引物5。
[0076]所述5對引物的10條核酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 10所
/Jn ο[0077]實施例2檢測鮭魚種類
[0078]1、提取樣品基因組DNA
[0079]取市售鮭魚肉樣品lg，加液氮碾磨lOmin，取碾碎后樣品0.1g加入到2ml的EP管，加入細胞裂解液1ml、蛋白酶Κ20μ 1，混勻；
[0080]在62°C恒溫水浴箱水浴20min,臺式離心機12000rpm離心5min,取上清液小心移入另一離心管中，加入2倍體積異丙醇，倒轉混勻后可以看見絲狀物，用100μ I吸頭挑出，晾干；
[0081]加入200 μ ITE重洗溶解，加入等量的酚:氯仿:異戊醇(25: 24: I)震蕩混勻，12000rpm 離心 5min ；
[0082]取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿:異戊醇(24: I)震蕩混勻，12000rpm離心5min ；
[0083]取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸銨，然后加入2倍體積的無水乙醇，混勻后，12000rpm離心10min ；
[0084]小心倒出上清液，吸水紙將管壁殘余液滴除掉，用lml70 %乙醇洗滌沉淀物3次，12000rpm離心10min,小心倒掉上清液，EP管置烘箱37。。烘3h，得至Ij DNA約0.2 μ g。
[0085]2、PCR方法擴增目的基因
[0086](I)PCR 反應
[0087]a、引物:取實施例1所得引物1，所述引物I中的正反向引物序列分別如序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。按照合成引物給定的濃度，配制成濃度為10 μ mol/L的溶液備用。
[0088]b、PCR反應體系為:將步驟I制備所得基因組DNA加入200μ 1TE，重新溶解作為模板；取DNA樣品(模板)30μ 1，加入IOX緩沖液10μ 1、dNTPMix8y 1、Tap DNAPolymerase0.5 μ 1、正反向游引物各 5 μ 1，補充 ddH20 至 100 μ I。
[0089]C、PCR擴增程序:
[0090]PCR擴增程序包括以下步驟:(1)94°C預變性3min，(2)94°C變性30s，(3)58°C退火30s，(4)72°C延伸lmin，其中步驟(2)~(4)循環(huán)次數(shù)30次，(5)72。。延伸4min, (6)4。。終止反應。得到DNA溶液50 μ 1，其濃度約為IOOng/μ I。
[0091]3、目的基因的測序和比對
[0092]將擴增后所得目的基因樣品經(jīng)過凝膠電泳分析，回收目的片段送至測序公司測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)，測得基因序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。
[0093]將所得目的基因測序結果的5’_>3’序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast運行比對，與所得PCR擴增產(chǎn)物的序列相似度最高的序列為JX960940 (Max ident = 100% )，在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢序列JX960940，得到該基因序列的種屬信息為:Salmo salar，確定該魚組織樣品屬于大西洋鮭魚(Salmo salar)。
[0094]實施例3檢測鮭魚種類
[0095]1、提取樣品基因組DNA
[0096]取鮭魚組織樣品，依據(jù)實施例2所述樣品基因DNA組提取方法抽提組織樣品DNA。
[0097]2、PCR方法擴增目的基因 [0098](I)PCR 反應[0099]a、引物:取實施例1所得引物2，所述引物2中的正反向引物序列分別如序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。按照合成引物給定的濃度，配制成濃度為10 μ mol/L的溶液備用。
[0100]b、PCR反應體系中Mg2+濃度為15mmol/L，dNTP濃度為0.3mmol/L，擴增引物濃度為0.3 μ M，Taq酶濃度為0.1U/ μ L，DNA模板濃度為IOOng/ μ L。
[0101]C、PCR 擴增程序為(1)93°〇預變性211^11，(2) 93 °C 變性 28s，(3) 56 °C 退火 28s，(4)72°C延伸lmin，其中步驟(2)~(4)循環(huán)次數(shù)30次，(5)72。。延伸3min, (6)4°C終止反應。
[0102]3、目的基因的測序和比對
[0103]將擴增后所得目的基因樣品經(jīng)凝膠電泳分析，回收目的片段送至測序公司測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)，測得基因序列如序列表中SEQ ID N0:13所示。
[0104]將所得目的基因測序結果的5’_>3’序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫，Blast運行，與所得PCR擴增產(chǎn)物的序列相似度最高的序列為KF597049 (Max ident = 99% )，在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢序列KF597049，得到其種屬信息為:Salmo salar,從而判斷該魚組織樣品屬于大西洋鮭魚種(Salmo salar)。 [0105]實施例4檢測鮭魚種類
[0106]1、提取樣品基因組DNA
[0107]取鮭魚組織樣品，依據(jù)實施例2所述樣品基因組DNA提取方法抽提組織樣品DNA。
[0108]2、PCR方法擴增目的基因
[0109](I) PCR 反應
[0110]a、引物:取實施例1所得引物3，所述引物3中的正反向引物序列分別如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示。按照合成引物給定的濃度，配制成濃度為10 μ mol/L的溶液備用。
[0111]b、PCR反應體系中Mg2+濃度為10mmol/L，dNTP濃度為0.2mmol/L，擴增引物濃度為0.1 μ M，Taq酶濃度為0.01U/ μ L，DNA模板濃度為IOng/ μ L。
[0112]c、PCR 擴增程序為(1)95°〇預變性411^11，(2)95°C變性 32s，(3)60°C退火 32s，(4)72°C延伸2min，其中步驟(2)~(4)循環(huán)次數(shù)35次，(5)72。。延伸5min, (6)4°C終止反應。
[0113]3、目的基因的測序和比對
[0114]將擴增后所得目的基因樣品經(jīng)凝膠電泳分析，回收目的片段送至測序公司測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)，測得基因序列如序列表中SEQ ID N0:14所示。
[0115]將所得目的基因測序結果的5’ ->3’序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫，運行Blast進行序列比對，與所得PCR擴增產(chǎn)物的序列相似度最高的序列為的序列為FJ999537 (Max ident =99% )，在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢序列FJ999537，得到其種屬信息為:Salmo salar,從而判斷該魚組織樣品屬于大西洋鮭魚種(Salmo salar)。
[0116]實施例5檢測鮭魚種類
[0117]1、提取樣品基因組DNA
[0118]取鮭魚組織樣品lg，依據(jù)實施例2所述樣品基因組DNA提取方法抽提組織樣品DNA。[0119]2、PCR方法擴增目的基因
[0120](I) PCR 反應
[0121]a、引物:取實施例1所得引物4，所述引物4中的正反向引物序列分別如序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。按照合成引物給定的濃度，配制成濃度為10 μ mol/L的溶液備用。
[0122]b、PCR反應體系如實施例2所述。
[0123]c、PCR擴增程序如實施例2所述。
[0124]3、目的基因的測序和比對
[0125]將擴增后所得目的基因樣品經(jīng)凝膠電泳分析，回收目的片段送至測序公司測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)，測得基因序列如序列表中SEQ ID NO:15所示。
[0126]將所得目的基因測序結果的5’ ->3’序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫，Blast運行，與所得PCR擴增產(chǎn)物的序列相似度最高的序列為HQ693265(Max ident = 99% )，在NCBI查詢序列HQ693265,得到其種屬信息為:0ncorhynchus keta,從而判斷該魚組織樣品屬于大馬哈魚(Oncorhynchus keta)。
[0127]實施例6檢測鮭魚種類
[0128]1、提取樣品基因組DNA
[0129]取鮭魚組織樣品lg，依據(jù)實施例2所述樣品基因組DNA提取方法抽提組織樣品DNA。
[0130]2、PCR方法擴增目的基因
[0131](I) PCR 反應
[0132]a、引物:取實施例1所得引物5，所述引物5中的正反向引物序列分別如序列表中SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:10所示。按照合成引物給定的濃度，配制成濃度為10 μ mol/L的溶液備用。
[0133]b、PCR反應體系如實施例2所述。
[0134]c、PCR擴增程序如實施例2所述。
[0135]3、目的基因的測序和比對
[0136]將擴增后所得目的基因樣品經(jīng)凝膠電泳分析，回收目的片段送至測序公司測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)，測得基因序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。
[0137]將所得目的基因測序結果的5’ ->3’序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫運行Blast，與所得PCR擴增產(chǎn)物的序列相似度最高的序列為JX960914(Max ident = 99% )，在NCBI查詢序列JX960914,得到其種屬信息為:0ncorhynchus keta,從而判斷該魚組織樣品屬于大馬哈魚(Oncorhynchus keta)。
[0138]對比實施例1
[0139]1、提取樣品基因組DNA
[0140]取市售鯉魚魚肉組織，提取方法同實施例2，得到基因組DNA約0.2 μ g。
[0141]2、PCR方法擴增目的基因
[0142](I) PCR 反應
[0143] a、引物:取實施例1所得引物1，所述引物I中的正反向引物序列分別如序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。按照合成引物給定的濃度，配制成濃度為lOymol/L的溶液備用。
[0144]b、PCR反應體系如實施例2所述。
[0145]c、PCR擴增程序如實施例2所述，所述PCR擴增程序中的陰性對照為以蒸餾水為模板進行PCR擴增，其中的陽性對照組為以實施例1所述大西洋鮭魚的基因組DNA為模板進行PCR擴增實驗。
[0146]3、目的基因的測序和比對
[0147]利用實施例2所述PCR方法，無法從陰性對照組和鯉魚的魚肉組織中擴增出特異性的目的基因條帶，在陽性對照組中能夠擴增出特異性條帶，說明樣品中完全不含與引物I匹配的DNA模板，因此所檢測樣品不是來自鮭魚。
[0148]對比實施例2
[0149]1、提取樣品基因組DNA
[0150]取金魚的魚肉組織，基因組DNA的提取方法同實施例2，得到基因組DNA約
0.2 μ go
[0151]2、PCR方法擴增目的基因
[0152](I) PCR 反應 [0153]a、引物:取實施例1所得引物2，所述引物2中的正反向引物序列分別如序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。按照合成引物給定的濃度，配制成濃度為10 μ mol/L的溶液備用。
[0154]b、PCR反應體系如實施例2所述。
[0155]c、PCR擴增程序如實施例2所述，該PCR擴增程序中的陰性對照為以蒸餾水為模板進行PCR擴增，其中的陽性對照組為以實施例2所述大西洋鮭魚的基因組DNA為模板進行PCR擴增實驗。
[0156]3、PCR擴增結果及其分析
[0157]利用實施例2所述PCR方法，無法從陰性對照組和金魚的魚肉組織中擴增出特異性條帶，在陽性對照組中能夠擴增出特異性條帶，說明樣品中完全不含與引物I匹配的DNA模板，因此所檢測樣品不是來自鮭魚。
[0158]對比實施例3
[0159]1、提取樣品基因組DNA
[0160]取不同來源的魚肉組織，其基因組DNA的提取方法同實施例2，得到基因組DNA約
0.2 μ go
[0161]2、PCR方法擴增目的基因
[0162](I) PCR 反應
[0163]a、引物:取實施例1中所有引物1-5。按照合成引物給定的濃度，配制成濃度為
10μ mol/L的溶液備用。
[0164]b、PCR反應體系如實施例2所述。
[0165]c、PCR擴增程序如實施例2所述，該PCR擴增程序中的陰性對照為以蒸餾水為模板進行PCR擴增，其中的陽性對照組為以實施例2所述大西洋鮭魚的基因組DNA為模板進行PCR擴增實驗。
[0166]3、PCR擴增結果及其分析[0167]目的基因的分析、測序和比對方法如實施例2所述。在陰性對照組中無法擴增出特異性條帶，在陽性對照組中能夠擴增出特異性條帶。
[0168]所得結果及分析如表1-5所示:
[0169]表1引物I的擴增結果和測序結果
[0170]
【權利要求】
1.一種檢測鮭魚種類的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)提取待檢測樣本的基因組DNA，以其為模板，以特異性擴增引物對擴增待檢測樣本的基因組DNA，所述特異性擴增引物對的序列分別如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2，或 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO: 4，或 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO: 6，或 SEQ ID NO: 7 和 SEQID NO: 8，或 SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 10 所示， (2)將步驟⑴所得PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，有特異性條帶的待測樣本屬于大西洋鮭魚(Salmo salar)或大馬哈魚(Oncorhynchus keta)。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟(3)，將步驟(1)所得PCR擴增產(chǎn)物進行測序，將測序結果與鮭魚科的COI基因進行序列比對，樣品基因序列與大西洋娃魚(Salmo salar)或大馬哈魚(Oncorhynchus keta)的COI基因的匹配度> 99%,則確定待測樣本為大西洋娃魚(Salmo salar)或大馬哈魚(Oncorhynchus keta)。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑴中，所述PCR反應中，PCR的反應體系為:1XPCR 反應緩沖液，10 ~15mmol/L Mg2+，0.2 ~0.3mmol/L dNTP，0.1 ~0.3 μ M特異性擴增引物對，Taq酶0.01~0.1U/ μ L, DNA模板10~100ng/ μ L。
4.一種檢測鮭魚種類的試劑盒，其特征在于，其包括特異性擴增引物對，所述特異性擴增引物對的序列分別如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID Ν0:2，或SEQ ID Ν0:3和SEQ IDNO: 4，或 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO: 6，或 SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO: 8，或 SEQ ID NO: 9 和SEQ ID NO: 10 所示。
5.一種檢測鮭魚種類的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:1所示或者如SEQ IDNO:2所示。
6.一種檢測鮭魚種類的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID Ν0:3所示或者如SEQ IDNO:4所示。
7.一種檢測鮭魚種類的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID Ν0:5所示或者如SEQ IDNO:6所示。
8.一種檢測鮭魚種類的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID Ν0:7所示或者如SEQ IDNO:8所示。
9.一種檢測鮭魚種類的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID Ν0:9所示或者如SEQ IDNO: 10所示。
【文檔編號】C12N15/11GK103966347SQ201410231413
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權日:2014年5月28日
【發(fā)明者】江文濤, 黃臻輝 申請人:上海第一生化藥業(yè)有限公司