一種利用微生物發(fā)酵將劍麻皂苷轉(zhuǎn)化成皂苷元的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用微生物發(fā)酵將劍麻皂苷轉(zhuǎn)化成皂苷元的方法。該微生物菌株現(xiàn)保藏于中國武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期：2013年7月9日，保藏編號：CCTCCM2013322，分類命名：GLHZB22。首先，將該菌株第一次發(fā)酵制備發(fā)酵用菌，在30℃時發(fā)酵擴大培養(yǎng)72小時；其次，取一定量的劍麻殘渣熱水浸提液，按照一定比例向提取液中接種菌種，并發(fā)酵培養(yǎng)，此液體不含皂苷元，培養(yǎng)3-5天后，在液體中能夠檢測出劍麻皂苷元，說明皂苷上的糖基被該菌株生物降解，同時在發(fā)酵液中有皂苷元。本發(fā)明方法使用的微生物具有安全環(huán)保、成本低、降解速度快、降解率高等特點，能夠推廣應(yīng)用于皂苷元工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】一種利用微生物發(fā)酵將劍麻皂苷轉(zhuǎn)化成皂苷元的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物發(fā)酵工程、生物化工和生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種利用微生物發(fā)酵將劍麻皂苷轉(zhuǎn)化成皂苷元的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]劍麻皂苷元(Tigogenin)是螺甾烷醇的衍生物(5 a，25D-螺甾烷_3_羥基)，是合成甾體激素類藥物的醫(yī)藥中間體和重要原料，廣泛應(yīng)用于腎上腺皮質(zhì)激素、性激素及蛋白同化激素，三大類激素可以制造200多種藥物。藥理研究表明，這些皂苷元成分具有較明顯的抗炎、抗菌、止血、抗衰老和降血糖的生物活性。
[0003]劍麻皂苷元是由劍麻皂苷糖基降解后得到的產(chǎn)物，而劍麻皂苷則主要來自于劍麻纖維傳統(tǒng)產(chǎn)品之后廢棄的麻汁和麻渣。目前工業(yè)上生產(chǎn)皂苷元的主要方法為硫酸加熱回流提取法，通過多次醇提酸解以及大孔樹脂吸附或活性炭吸附得到產(chǎn)品。此類方法存在很大的局限性。醇提酸解產(chǎn)生的工業(yè)廢水難以處理，處理不當將會對環(huán)境造成很大的影響，同時大量的使用化學(xué)試劑增加了生產(chǎn)成本，造成資源浪費；大孔樹脂法吸附色素成本高，樹脂不能多次重復(fù)利用，廢棄的樹脂對環(huán)境存在著污染，活性炭吸附法存在著吸附量少且使用局限性(對食品和藥品不適用)，廢棄活性炭難于處理等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種利用微生物發(fā)酵將劍麻皂苷轉(zhuǎn)化成皂苷元的方法。
[0005]具體步驟為:
(I)制備培養(yǎng)基:
a.稱取去皮土豆20(T250g，并將土豆切成1.8~2.2cm的方塊，加0.5~1.5L水后加熱煮沸25~35min,之后冷卻至室溫,用三層紗布過濾,定容濾液至0.5"?.5L,備用。
[0006]b.取0.1L步驟(1)第a制得的備用濾液置于250ml的三角瓶中，標記為I號備用，用于目的菌株的固體平面培養(yǎng)；取0.2L步驟(1)第a制得的備用濾液置于IL的三角瓶中，標記為2號備用，用于目的菌株的液體擴增培養(yǎng)。
[0007](2)目的菌株的固體平面培養(yǎng):
向步驟(1)第b步中標記為I號備用的三角瓶中加入1.5g瓊脂粉，用牛皮紙包扎瓶口，在1.103MPa、121°C下滅菌20min，取出后迅速地倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋，待瓊脂凝固后備用，即為固體培養(yǎng)基；在無菌條件下，將斜面保存的目的菌株涂布在固體培養(yǎng)基上，30°C下培養(yǎng)72小時，即完成目的菌株的固體平面培養(yǎng)。
[0008](3)目的菌株的液體擴增培養(yǎng):
將步驟(1)第b步中標記為2號備用的三角瓶在1.103MPa、121°C下滅菌20min，冷卻后降至室溫，然后向其中加入步驟(2)中完成目的菌株固體平面培養(yǎng)的菌落小餅10個，在300C以200轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖床振蕩培養(yǎng)72小時，即完成目的菌株的液體擴增培養(yǎng)；所述菌落小餅的直徑為1cm。[0009](4)目的菌株對底物發(fā)酵制得皂苷元:
稱取劍麻抽絲后的干殘渣200g，加入IL自來水，煮沸提取60min后三層紗布過濾，濾液定容至1L，在1.103MPa，121°C下滅菌20min，轉(zhuǎn)入2L玻璃瓶中，在無菌條件下，接入0.1L步驟(3)中完成目的菌株液體擴增培養(yǎng)的的菌液，30°C下以200轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖床振蕩發(fā)酵72小時，即制得產(chǎn)物。
[0010]所述目的菌株為有選擇性地從土壤樣品中篩選的目的菌株，該目的菌株在以劍麻殘渣提取液為發(fā)酵液的發(fā)酵過程中能夠降解劍麻皂苷糖基，同時制備出皂苷元，該目的菌株現(xiàn)保藏于中國武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該典型培養(yǎng)物保藏中心地址為:中國武漢武漢大學(xué)，郵編:430072，保藏日期:2013年7月9日，保藏編號:CCTCCM2013322，分類命名:GLHZB22。
[0011]通過色譜法能夠檢測到皂苷元，通過比色法能夠檢測出產(chǎn)物中皂苷和皂苷元的含量，檢測結(jié)果表明劍麻皂苷被有效地降解為皂苷元。
[0012]本發(fā)明方法利用目的菌株的發(fā)酵能夠降解劍麻皂苷糖基而轉(zhuǎn)化成皂苷元，它對劍麻皂苷糖基具有降解效率高、成本低、無殘留、無污染、安全環(huán)保等特點，符合綠色環(huán)保工業(yè)化生產(chǎn)的趨勢，同時也是和諧生態(tài)發(fā)展的需要。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為在1000倍下觀察到的本發(fā)明中微生物菌群的形態(tài)照片。
[0014]圖2為在20000倍下觀察到的本發(fā)明中微生物單一菌體的形態(tài)照片。
[0015]圖3為本發(fā)明實施例中劍麻皂苷元標準品的高壓液相色譜圖。
[0016]圖4為本發(fā)明實施例中劍麻皂苷元樣品的高壓液相色譜圖。
[0017]圖5為本發(fā)明實施例制得的劍麻皂苷元的分子結(jié)構(gòu)圖。
【具體實施方式】
[0018]實施例:
(I)制備培養(yǎng)基:
a.稱取去皮土豆220g,并將土豆切成2cm的方塊,加1.1L水后加熱煮沸30min,之后冷卻至室溫，用三層紗布過濾，定容濾液至1.1L,備用。
[0019]b.取0.1L步驟(1)第a制得的備用濾液置于250ml的三角瓶中，標記為I號備用，用于目的菌株的固體平面培養(yǎng)；取0.2L步驟(1)第a制得的備用濾液置于IL的三角瓶中，標記為2號備用，用于目的菌株的液體擴增培養(yǎng)。
[0020](2)目的菌株的固體平面培養(yǎng):
向步驟(1)第b步中標記為I號備用的三角瓶中加入1.5g瓊脂粉，用牛皮紙包扎瓶口，在1.103MPa、121°C下滅菌20min，取出后迅速地倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋，待瓊脂凝固后備用，即為固體培養(yǎng)基；在無菌條件下，將斜面保存的目的菌株涂布在固體培養(yǎng)基上，30°C下培養(yǎng)72小時，即完成目的菌株的固體平面培養(yǎng)。 [0021](3)目的菌株的液體擴增培養(yǎng):
將步驟(1)第b步中標記為2號備用的三角瓶在1.103MPa、121°C下滅菌20min，冷卻后降至室溫，然后向其中加入步驟(2)中完成目的菌株固體平面培養(yǎng)的菌落小餅10個，在300C以200轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖床振蕩培養(yǎng)72小時，即完成目的菌株的液體擴增培養(yǎng)；所述菌落小餅的直徑為1cm，菌株形態(tài)見圖1和圖2。
[0022](4)目的菌株對底物發(fā)酵制得皂苷元:
稱取劍麻抽絲后的干殘渣200g，加入IL自來水，煮沸提取60min后三層紗布過濾，濾液定容至1L，在1.103MPa，121°C下滅菌20min，轉(zhuǎn)入2L玻璃瓶中，在無菌條件下，接入0.1L步驟(3)中完成目的菌株液體擴增培養(yǎng)的的菌液，30°C下以200轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖床振蕩發(fā)酵72小時，即制得產(chǎn)物。
[0023]所述目的菌株現(xiàn)保藏于中國武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該典型培養(yǎng)物保藏中心地址為:中國武漢武漢大學(xué)，郵編:430072，保藏日期:2013年7月9日，保藏編號:CCTCCM2013322，分類命名:GLHZB22。
[0024]檢測如下:
一、比色法制備皂苷標準曲線:
稱量皂苷標準品5.0mg,用甲醇溶解并定容至5mL，然后分別吸取0.1,0.2,0.3,0.4、0.5、0.6和0.7mL置25mL具塞試管中，以空白管作對照，在70°C下烘干后冷卻至室溫；各管中依次加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,搖勻后置于70°C烘箱中加熱15min，取出后迅速流水冷卻至室溫，再分別加入5mL冰醋酸，搖勻，于450nm處測定吸光度；以含量為橫坐標，吸光度為縱坐標制備標準曲線，得到標準曲線y=l.4598X+0.0307，R2為
0.9922, x=0-0.7mg，相關(guān)性好。比色法檢測發(fā)酵前后發(fā)酵液中皂苷和皂苷元的含量，結(jié)果表明發(fā)酵液中劍麻皂苷被有效地降解為皂苷元，見表1。
[0025]表1發(fā)酵前后皂苷和皂苷元含量的變化(mg/mL)
【權(quán)利要求】
1.一種利用微生物發(fā)酵將劍麻皂苷轉(zhuǎn)化成皂苷元的方法，其特征在于具體步驟為: (1)制備培養(yǎng)基: a.稱取去皮土豆20(T250g，并將土豆切成1.8~2.2cm的方塊，加0.5~1.5L水后加熱煮沸25~35min,之后冷卻至室溫,用三層紗布過濾,定容濾液至0.5"?.5L,備用； b.取0.1L步驟(1)第a制得的備用濾液置于250ml的三角瓶中，標記為I號備用，用于目的菌株的固體平面培養(yǎng)；取0.2L步驟(1)第a制得的備用濾液置于IL的三角瓶中，標記為2號備用，用于目的菌株的液體擴增培養(yǎng)； (2)目的菌株的固體平面培養(yǎng): 向步驟(1)第b步中標記為I號備用的三角瓶中加入1.5g瓊脂粉，用牛皮紙包扎瓶口，在1.103MPa、121°C下滅菌20min，取出后迅速地倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋，待瓊脂凝固后備用，即為固體培養(yǎng)基；在無菌條件下，將斜面保存的目的菌株涂布在固體培養(yǎng)基上，30°C下培養(yǎng)72小時，即完成目的菌株的固體平面培養(yǎng)； (3)目的菌株的液體 擴增培養(yǎng): 將步驟(1)第b步中標記為2號備用的三角瓶在1.103MPa、121°C下滅菌20min，冷卻后降至室溫，然后向其中加入步驟(2)中完成目的菌株固體平面培養(yǎng)的菌落小餅10個，在300C以200轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖床振蕩培養(yǎng)72小時，即完成目的菌株的液體擴增培養(yǎng)；所述菌落小餅的直徑為Icm ； (4)目的菌株對底物發(fā)酵制得皂苷元: 稱取劍麻抽絲后的干殘渣200g，加入IL自來水，煮沸提取60min后三層紗布過濾，濾液定容至1L，在1.103MPa，121°C下滅菌20min，轉(zhuǎn)入2L玻璃瓶中，在無菌條件下，接入0.1L步驟(3)中完成目的菌株液體擴增培養(yǎng)的的菌液，30°C下以200轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖床振蕩發(fā)酵72小時，即制得含有皂苷元的產(chǎn)物； 所述目的菌株為有選擇性地從土壤樣品中篩選的目的菌株，該目的菌株在以劍麻殘渣提取液為發(fā)酵液的發(fā)酵過程中能夠降解劍麻皂苷糖基，同時制備出皂苷元，該目的菌株現(xiàn)保藏于中國武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期:2013年7月9日，保藏編號:CCTCCM2013322，分類命名:GLHZB22。
【文檔編號】C12P33/20GK103966300SQ201410221277
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月25日
【發(fā)明者】郝再彬, 孫昊, 王彥超, 周菲菲, 李霞, 王秀麗 申請人:桂林理工大學(xué)