一種鑒別天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒別天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法，是以天然蜂蜜在一定濃度下對(duì)大腸桿菌DH5α有殺菌作用，而人造蜂蜜對(duì)大腸桿菌DH5α沒有殺菌作用為原理，該方法是將待測(cè)蜂蜜配成的檢測(cè)樣品加入大腸桿菌DH5α培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌落，然后觀察菌落生長情況；若檢測(cè)樣品的蜂蜜濃度為100％時(shí)，仍有菌落存活，則該待測(cè)蜂蜜是人造蜂蜜，若在某一蜂蜜濃度(＜100％)下菌落全部被殺滅，則該待測(cè)蜂蜜不是人造蜂蜜。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、易于操作、效率高、成本低，本發(fā)明對(duì)人造蜂蜜的鑒別具有較大的實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】一種鑒別天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種對(duì)天然蜂蜜和人造蜂蜜進(jìn)行鑒別的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蜂蜜是一種成分復(fù)雜、營養(yǎng)豐富的過飽和糖溶液，具有極高的滲透壓和較低的pH值，含有過氧化氫(hydrogen peroxide, H202)及丙酮醒類(Methylglyoxal, MG0)等殺菌成分，具有廣譜的抗菌活性，且其抗菌活性不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。
[0003]一般微生物適宜生長在滲透壓相當(dāng)于3-6個(gè)大氣壓的溶液中，僅少數(shù)真菌和酵母菌能在滲透壓相當(dāng)于40-90個(gè)大氣壓中生長，而在常溫下天然成熟的蜂蜜的滲透壓相當(dāng)于105個(gè)大氣壓，足以使細(xì)胞脫水而死亡。同時(shí)，蜂蜜呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的酸度，pH介于
3.2-4.5之間，而細(xì)菌生長的最佳pH值位于7.2-7.4左右，故蜂蜜在未稀釋時(shí)能夠抑制大多數(shù)細(xì)菌生長。另外，當(dāng)細(xì)菌持續(xù)暴露在H202氣霧中，細(xì)菌生長受抑制的H202濃度只需0.02mM-0.05mM。雖然蜂蜜中H202濃度很低，但它仍然是蜂蜜中一種有效的抗微生物成分。研究發(fā)現(xiàn)MGO也是蜂蜜中的一種重要的抗菌成分，MGO對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌等都具有很高的抗菌活性?；诜涿垡陨系目咕匦裕涿蹖?duì)許多致病菌具有殺菌活性，包括沙門氏菌、志賀菌屬及腸道內(nèi)的致病菌如埃希氏菌屬、霍亂弧菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性及陽性菌。
[0004]由于蜂蜜的主要成分是果糖和葡萄糖，兩者都是很容易得到的工業(yè)產(chǎn)品，因此在利益的驅(qū)動(dòng)下，有不少不法廠家及商販用葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉等原料，再添加色素、蜂蜜香精等制作出人造蜂蜜來謀取暴利，因?yàn)槿嗽旆涿鄹静缓刑烊环涿壑械亩喾N營養(yǎng)成分，僅是感官指標(biāo)和部分理化指標(biāo)與天然蜂蜜極為相似，并且難以辨別其真假，于是人造蜂蜜也叫做假蜂蜜。還有一些商家為了迷惑消費(fèi)者，為了通過產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)，在天然蜂蜜里混入不同比例的人造蜂蜜。本發(fā)明中只將不含有天然蜂蜜成分的蜂蜜叫做人造蜂蜜。目前，鑒別天然蜂蜜和人造蜂蜜的手段主要是檢測(cè)蜂蜜中人為加入的一些糖漿成分，而到現(xiàn)在為止還沒有一種方法能對(duì)任何種類糖漿進(jìn)行確證，若要得出可靠結(jié)論，需要結(jié)合一整套的方法，復(fù)雜的檢測(cè)程序，不僅費(fèi)時(shí)、效率低，而且成本高，不利于應(yīng)用到大批量樣品。因此急需建立一種鑒別方法來評(píng)價(jià)蜂蜜的真假。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述現(xiàn)有鑒別蜂蜜方法的缺陷，本發(fā)明的主要目的是提供一種效率高、成本低的鑒別天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法，具體操作為:將由待測(cè)蜂蜜配成的蜂蜜濃度不同的檢測(cè)樣品分別與 相同量的大腸桿菌DH5CI菌液混合后加入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌落，觀察菌落是否能夠在所述檢測(cè)樣品達(dá)到某一蜂蜜濃度后全部被殺滅；若檢測(cè)樣品達(dá)到該蜂蜜濃度后，菌落全部被殺滅，則該待測(cè)蜂蜜不是人造蜂蜜；當(dāng)檢測(cè)樣品的蜂蜜濃度達(dá)到100%菌落仍然存活，則該待測(cè)蜂蜜是人造蜂蜜。[0006]所述檢測(cè)樣品是將所述待測(cè)蜂蜜用無菌液稀釋成不同蜂蜜濃度得到的。
[0007]所述無菌液為無菌的LB液體培養(yǎng)基。
[0008]所述固體培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)為在37°C恒溫培養(yǎng)16_29h。
[0009]所述方法，包括以下步驟:
[0010](I)配制LB液體培養(yǎng)基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用水配制，混合均勻后高壓滅菌，即得；
[0011]配制LB固體培養(yǎng)基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂粉15g/L，用水配制，混合均勻后高壓滅菌， 600C時(shí)倒板即得；
[0012](2)將大腸桿菌DH5a加入到按步驟(1)方法配制好的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm搖菌10-12h，即得大腸桿菌DH5a菌液，其中所述大腸桿菌DH5 a與所述LB液體培養(yǎng)基的體積比為1:100 ;
[0013](3)用步驟(1)中配制好的LB液體培養(yǎng)基稀釋待測(cè)蜂蜜得到蜂蜜濃度(體積百分含量)分布在100%-0%之間(不含端值)的多個(gè)檢測(cè)樣品，另取待測(cè)蜂蜜和LB液體培養(yǎng)基分別作為蜂蜜濃度(體積百分含量)為100%和0%的檢測(cè)樣品，即得多個(gè)不同蜂蜜濃度的檢測(cè)樣品；
[0014](4)將步驟(2)得到的大腸桿菌DH5a菌液分別加入到按步驟(3)方法配制好的檢測(cè)樣品中，37°C 200rpm搖菌16-20h混合均勻后，即得培養(yǎng)液樣品，其中所述大腸桿菌DH5 a菌液與所述檢測(cè)樣品的體積比為1:100 ;
[0015](5)將步驟(4)得到的培養(yǎng)液樣品接種在步驟(1)方法配制的LB固體培養(yǎng)基上37°C恒溫培養(yǎng)16-29h ;優(yōu)選37°C恒溫培養(yǎng)16_20h ；
[0016](6)觀察步驟(5)方法培養(yǎng)的菌落生長情況，菌落全部被殺滅的檢測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的最小蜂蜜濃度記為最低殺菌濃度，若該蜂蜜濃度數(shù)值小于100%，則該待測(cè)蜂蜜不是人造蜂蜜；若檢測(cè)樣品的蜂蜜濃度達(dá)到100%菌落仍然存活，則該待測(cè)蜂蜜是人造蜂蜜。
[0017]所述檢測(cè)樣品的蜂蜜濃度(體積百分含量)依次為100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、0%。
[0018]步驟(5)中是將步驟(4)得到的培養(yǎng)液樣品接種在步驟(1)方法配制的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。
[0019]步驟(5)中的恒溫培養(yǎng)時(shí)間為16_20h。
[0020]本發(fā)明的另一目的在于提供一種鑒別人造蜂蜜的方法，具體操作為:將待測(cè)蜂蜜與大腸桿菌DH5a菌液混合后加入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌落，然后觀察菌落生長情況；若有存活菌落，則該待測(cè)蜂蜜是人造蜂蜜，否則，該待測(cè)蜂蜜不是人造蜂蜜。
[0021]所述固體培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基，在37°C恒溫培養(yǎng)16_29h。
[0022]本發(fā)明的方法不是通過檢測(cè)蜂蜜中糖類、酶類等成分，而是利用天然蜂蜜和人造蜂蜜對(duì)大腸桿菌DH5a具有截然不同的滅菌效果，即天然蜂蜜對(duì)此菌有殺滅作用，而人造蜂蜜則沒有的原理，以此數(shù)據(jù)對(duì)蜂蜜進(jìn)行鑒別，本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、易于操作、效率高、成本低，本發(fā)明對(duì)人造蜂蜜的鑒別具有較大的實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】[0024]圖1:天然蜂蜜HH培養(yǎng)大腸桿菌DH5 α培養(yǎng)板菌落生長情況；
[0025]圖2:人造蜂蜜AH培養(yǎng)大腸桿菌DH5 α培養(yǎng)板菌落生長情況；
[0026]圖3:商品蜂蜜A培養(yǎng)大腸桿菌DH5 α培養(yǎng)板菌落生長情況；
[0027]圖4:商品蜂蜜B培養(yǎng)大腸桿菌DH5 α培養(yǎng)板菌落生長情況；
[0028]圖5:商品蜂蜜C培養(yǎng)大腸桿菌DH5 α培養(yǎng)板菌落生長情況；
[0029]圖6:商品蜂蜜D培養(yǎng)大腸桿菌DH5 α培養(yǎng)板菌落生長情況。
【具體實(shí)施方式】
[0030]本發(fā)明利用天然蜂蜜對(duì)大腸桿菌具有殺菌作用，而人造蜂蜜則沒有的原理，實(shí)現(xiàn)對(duì)天然蜂蜜和人造蜂蜜的鑒別。本發(fā)明中，大腸桿菌確定為DH5ci，由于實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)人造蜂蜜也能夠殺死其他大腸桿菌，唯獨(dú)不能殺死這種大腸桿菌，因此用其它種類的大腸桿菌不能直觀鑒別蜂蜜的真假。
[0031]實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù) 范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0032]下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、瓊脂粉均為現(xiàn)有試劑。
[0033]實(shí)施例1、天然蜂蜜(homemade honey, HH)培養(yǎng)大腸桿菌DH5 α
[0034]天然蜂蜜來自養(yǎng)蜂廠，為中華蜜蜂采集多種花源釀制的天然成熟蜂蜜，并經(jīng)60Co- Y射線照射滅菌，照射劑量為25kGy，劑量率為2000cGy/min。
[0035](I)配制LB液體培養(yǎng)基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用水配制，混合均勻后高壓滅菌，即得；
[0036]配制LB固體培養(yǎng)基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L,瓊脂粉15g/L，用水配制，混合均勻后高壓滅菌，600C時(shí)倒板即得；
[0037](2)將液體大腸桿菌DH5 α 100 μ L加入到IOmL按步驟⑴方法配制好的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm搖菌12h，即得大腸桿菌DH5 α菌液；
[0038](3)用步驟⑴中配制好的LB液體培養(yǎng)基稀釋待測(cè)蜂蜜得到蜂蜜濃度(體積百分含量)分布在100% -O%之間的多個(gè)檢測(cè)樣品，體積至2mL，再另取2mL蜂蜜和LB液體培養(yǎng)基分別作為蜂蜜濃度(體積百分含量)為100%和0%的檢測(cè)樣品，即得蜂蜜濃度為100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、0%的 11 個(gè)檢測(cè)樣品；
[0039](4)將步驟(2)得到的大腸桿菌DH5 α菌液20 μ L分別加入到2mL按步驟(3)方法配制好的檢測(cè)樣品中，37°C 200rpm搖菌16h混合均勻后，即得培養(yǎng)液樣品；
[0040](5)用接種環(huán)分別挑取少許步驟(4)得到的培養(yǎng)液樣品，分別接種在11個(gè)步驟(I)方法配制的同樣的LB固體培養(yǎng)基上,37°C恒溫劃線培養(yǎng)16h ；
[0041](6)觀察步驟(5)方法培養(yǎng)的各LB固體培養(yǎng)基上的菌落生長情況。
[0042]結(jié)果示于圖1，蜂蜜濃度在0% -40 %的檢測(cè)樣品均出現(xiàn)菌落，蜂蜜濃度在50%-100%的檢測(cè)樣品均未出現(xiàn)菌落，表明該待測(cè)蜂蜜(HH)具有殺菌作用，不是人造蜂
處蟲ο
[0043]另外，數(shù)據(jù)還顯示無菌落生長的最低蜂蜜濃度為50%，將無菌落生長的最低蜂蜜濃度定義為該蜂蜜的最低殺菌濃度(體積百分含量)(minimum bactericidalconcentration，MBC)，則表明HH對(duì)大腸桿菌DH5 α的MBC為50%，該數(shù)據(jù)可作為鑒定該天然蜂蜜摻假程度的指標(biāo):已知本實(shí)施例的待測(cè)蜂蜜為天然蜂蜜，沒有混入人造蜂蜜成分，得到的MBC值為50%，分別取等量的該天然蜂蜜，向其中分別加入不同量的人造蜂蜜(ΑΗ，人造蜂蜜是用果糖40.5g、葡萄糖33.5g、麥芽糖7.5g和蔗糖1.5g溶于17g去離子水中再經(jīng)滅菌得到)，按照上述步驟(1)-(6)的方法找出各比例的混合蜂蜜的最低殺菌濃度(體積百分含量)(MBC)，結(jié)果如表1所示，可以看出天然蜂蜜和人造蜂蜜混合得到的混合蜂蜜的MBC均高于該天然蜂蜜本身的MBC值，因此可以利用這個(gè)原理來判斷此種天然蜂蜜中摻入人造蜂蜜的程度，并以此數(shù)據(jù)作為評(píng)價(jià)蜂蜜真假的指標(biāo)之一，MBC值越高，表明人造蜂蜜的摻入比例越高，MBC值越低，表明人造蜂蜜的摻入比例越低；在表1的情形下，當(dāng)人造蜂蜜的摻入比例高于天然蜂蜜時(shí)，檢測(cè)不出該混合蜂蜜的MBC值(即MBC值超過100% )。
[0044]表1混合蜂蜜的殺菌效果
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法，其特征在于，將由待測(cè)蜂蜜配成的蜂蜜濃度不同的檢測(cè)樣品分別與相同量的大腸桿菌DH5 a菌液混合后加入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌落，觀察菌落是否能夠在所述檢測(cè)樣品達(dá)到某一蜂蜜濃度后全部被殺滅；若檢測(cè)樣品達(dá)到該蜂蜜濃度后，菌落全部被殺滅，則該待測(cè)蜂蜜不是人造蜂蜜；當(dāng)檢測(cè)樣品的蜂蜜濃度達(dá)到100 %菌落仍然存活，則該待測(cè)蜂蜜是人造蜂蜜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述檢測(cè)樣品是將所述待測(cè)蜂蜜用無菌液稀釋成不同蜂蜜濃度得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述無菌液為無菌的LB液體培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述方法，所述固體培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)為在37 °C恒溫培養(yǎng)16-29h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述方法，其特征在于:所述方法，包括以下步驟: (1)配制LB液體培養(yǎng)基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，用水配制，混合均勻后高壓滅菌，即得； 配制LB固體培養(yǎng)基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂粉15g/L，用水配制，混合均勻后高壓滅菌，60°C時(shí)倒板即得； (2)將大腸桿菌DH5a加入到按步驟(1)方法配制好的LB液體培養(yǎng)基中，37°C200rpm搖菌10_12h，即得大腸桿菌D H5 a菌液，其中所述大腸桿菌DH5 a與所述LB液體培養(yǎng)基的體積比為1:100 ; (3)用步驟(1)中配制好的LB液體培養(yǎng)基稀釋待測(cè)蜂蜜得到蜂蜜濃度(體積百分含量)分布在100%-0%之間(不含端值)的多個(gè)檢測(cè)樣品，另取待測(cè)蜂蜜和LB液體培養(yǎng)基分別作為蜂蜜濃度(體積百分含量)為100%和0%的檢測(cè)樣品，即得多個(gè)不同蜂蜜濃度的檢測(cè)樣品； (4)將步驟(2)得到的大腸桿菌DH5a菌液分別加入到按步驟(3)方法配制好的檢測(cè)樣品中，37°C 200rpm搖菌16_20h混合均勻后，即得培養(yǎng)液樣品，其中所述大腸桿菌DH5 a菌液與所述檢測(cè)樣品的體積比為1:100 ; (5)將步驟(4)得到的培養(yǎng)液樣品接種在步驟(1)方法配制的LB固體培養(yǎng)基上37°C恒溫培養(yǎng)16-29h ;優(yōu)選37°C恒溫培養(yǎng)16-20h ； (6)觀察步驟(5)方法培養(yǎng)的菌落生長情況，菌落全部被殺滅的檢測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的最小蜂蜜濃度記為最低殺菌濃度，若該蜂蜜濃度數(shù)值小于100%，則該待測(cè)蜂蜜不是人造蜂蜜；若檢測(cè)樣品的蜂蜜濃度達(dá)到100%菌落仍然存活，則該待測(cè)蜂蜜是人造蜂蜜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述方法，其特征在于:所述檢測(cè)樣品的蜂蜜濃度(體積百分含量)依次為 100%,90%,80%,70%,60%,50%,40%,30%,20%U0%,0%o
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法:其特征在于:步驟(5)中是將步驟(4)得到的培養(yǎng)液樣品接種在步驟(1)方法配制的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或7所述方法:其特征在于:步驟(5)中的恒溫培養(yǎng)時(shí)間為16-20h。
9.一種鑒別人造蜂蜜的方法，其特征在于，將待測(cè)蜂蜜與大腸桿菌DH5 a菌液混合后加入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌落，然后觀察菌落生長情況；若有存活菌落，則該待測(cè)蜂蜜是人造蜂蜜，否則，該待測(cè)蜂蜜不是人造蜂蜜。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基，在37°C恒溫培 養(yǎng)16_29h。
【文檔編號(hào)】C12Q1/10GK103952460SQ201410175536
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】張成崗, 耿愛香, 王廣舜, 徐向英, 李偉光, 李軍懷, 韓恩崑, 楊志敏, 劉伯芬, 齊秀會(huì), 劉英男 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院, 蘇州科景生物醫(yī)藥科技有限公司