雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株命名為：Ck/Jiangsu/NJ-23/2008；該毒株的保藏編號(hào)為CGMCCNO.8852；該毒株從野毒分離、雞胚傳代、Vero細(xì)胞傳代適應(yīng)，最終獲得能夠在無血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上高效增殖的毒株；該毒株在無血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，TCID50可保持在108.5/mL以上；將病毒培養(yǎng)液滅活，制備成油乳劑，免疫雞體后經(jīng)檢測具有很好的免疫原性。本發(fā)明提供的IBDV毒株與其生產(chǎn)工藝簡單、安全、高效、適合工業(yè)放大培養(yǎng)。
【專利說明】雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及雞傳染性法氏囊病毒VeiX)細(xì)胞適應(yīng)株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD),是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的雞的一種高度接觸性傳染病,最早發(fā)生于美國Delaware州的Gamboro地區(qū)，主要感染3飛周齡的青年雞，病毒在法氏囊的淋巴細(xì)胞中迅速繁殖，損傷法氏囊的B淋巴細(xì)胞，引起嚴(yán)重的免疫抑制。1980年以后該病傳入我國并大面積暴發(fā)和持續(xù)流行，嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，當(dāng)前對于該病普遍采用接種疫苗進(jìn)行預(yù)防。
[0003]目前，國內(nèi)生產(chǎn)的IBDV疫苗通常是采用雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)增殖病毒。雞胚成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)過程中需要添加一定量的新鮮血清，常用胎牛血清或小牛血清，但是血清成份在提純和收獲細(xì)胞產(chǎn)物的過程中帶來很大困難，且每批血清的質(zhì)量不同，從而影響疫苗的穩(wěn)定性，同時(shí)在疫苗使用過程中還可能誘發(fā)過敏反應(yīng)。[0004]隨著動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，為包括VeiO細(xì)胞在內(nèi)的動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用提供了必要的技術(shù)支撐，無血清懸浮培養(yǎng)已成為包括疫苗在內(nèi)的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)的總趨勢。
[0005]當(dāng)前，國內(nèi)生產(chǎn)的IBDV疫苗的病毒效價(jià)偏低，且免疫保護(hù)效率偏低；在生產(chǎn)方式上仍使用轉(zhuǎn)瓶接種IBDV的生產(chǎn)方式，培養(yǎng)體積0.5L左右，無法進(jìn)行大規(guī)模制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供雞傳染性法氏囊病毒VeiO細(xì)胞適應(yīng)株，能夠在VeiO細(xì)胞上穩(wěn)定增殖，培養(yǎng)過程中不需要添加血清,安全性高,病毒效價(jià)高,免疫原性強(qiáng)。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述雞傳染性法氏囊病毒VeiO細(xì)胞適應(yīng)株的病毒液的制備方法。采用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)，適合大規(guī)模培養(yǎng)，該方法簡單，安全，得到的病毒液效價(jià)聞、質(zhì)量穩(wěn)定。
[0008]本發(fā)明的再一目的是提供所述雞傳染性法氏囊病毒VeiO細(xì)胞適應(yīng)株在制備雞傳染性法氏囊病疫苗中的應(yīng)用，采用該雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株制備的疫苗接種后，抗體效價(jià)聞，持續(xù)期長，能夠有效保護(hù)接種動(dòng)物。
[0009]本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0010]一種雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，為雞傳染性法氏囊病毒Ck/Jiangsu/NJ-23/2008 株，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.8852。
[0011]本發(fā)明還提供所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株在制備雞傳染性法氏囊病疫苗中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明還提供所述雞傳染性法氏囊病毒VeiO細(xì)胞適應(yīng)株的病毒液。
[0013]本發(fā)明所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的病毒液的制備方法，包括:在無血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上增殖所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，得到病毒液。
[0014]在本發(fā)明中，所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株增殖過程中，Vero細(xì)胞貼附在微載體上，在動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器內(nèi)懸浮培養(yǎng)。
[0015]在本發(fā)明中，所述Vero細(xì)胞采用IVT培養(yǎng)基培養(yǎng)得到。
[0016]在本發(fā)明中，所述增殖過程中，細(xì)胞維持液為乳清蛋白水解物與IVT培養(yǎng)基的混合物。
[0017]本發(fā)明還提供一種疫苗組合物，其特征在于活性成分為滅活的所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株。
[0018]本發(fā)明還提供所述疫苗組合物的制備方法，將所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的病毒液滅活，然后與佐劑混合、乳化得到疫苗組合物。
[0019]有益效果:
本發(fā)明提供的雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，能夠在Vero細(xì)胞上穩(wěn)定增殖，培養(yǎng)過程中不需要使用血清，安全性高，病毒效價(jià)高，免疫原性強(qiáng)。
[0020]本發(fā)明提供雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的病毒液的制備方法，采用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)，適合大規(guī)模培養(yǎng)，該方法簡單、安全、高效，得到的病毒液效價(jià)高、質(zhì)量穩(wěn)定，適合工業(yè)放大培養(yǎng)。
[0021]采用所述雞傳染性法氏囊病毒VeiO細(xì)胞適應(yīng)株制備的疫苗接種后，抗體效價(jià)高，持續(xù)期長，能夠有效保護(hù)接種動(dòng)物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1顯示傳代次數(shù)對IBDV病毒NJ-23株效價(jià)的影響。
[0023]圖2是接毒前Vero細(xì)胞的電鏡圖。
圖3顯示了粘附在微載體上的Vero細(xì)胞培養(yǎng)增殖IBDV過程。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1 IBDV病毒的獲得與特性測定
采用從我國江蘇地區(qū)發(fā)病雞群中分離的疑似雞傳染性法氏囊病料，接種無特定病原體(Specific Pathogen Free, SPF)雞胚分離病毒，將該毒株在SPF雞胚上增殖后，在雞胚成纖維細(xì)胞上進(jìn)行蝕斑純化，通過不同蝕斑的純化、篩選，最終獲得病毒NJ株。
[0025]將病毒NJ株進(jìn)行下列特性鑒定:
(I)病毒NJ株擴(kuò)增:將病毒NJ株用無菌PBS緩沖液稀釋IO3倍后，以絨毛尿囊膜途徑接種l(Tll日齡SPF雞胚，接種量為0.2mL/胚，37°C培養(yǎng)，在36~48h內(nèi)收獲雞胚的尿囊液。
[0026](2)病毒的EID5tl:將步驟(1)獲得的雞胚尿囊液用無菌PBS緩沖液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取稀釋1(Τ109倍的尿囊液，接種10~11 H齡SPF雞胚，接種量為0.2ml/胚，置37°C培養(yǎng)，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，剖檢觀察24h后至168h內(nèi)死亡的雞胚和168h仍健活的雞胚的胚體情況，按出現(xiàn)有頭部、頸部出血且胚體縮小，判為感染。檢測結(jié)果為:步驟(1)獲得的雞胚尿囊液中病毒含量為IO7 5 EID5(l/mL。
[0027](3)病毒特異性鑒定:設(shè)立病毒對照組和中和組，每組設(shè)有5個(gè)l(Tll日齡SPF雞胚。將步驟(1)收獲的尿囊液用無菌PBS稀釋至104_° EID5ciAiL，與等體積的抗雞傳染性法氏囊病特異性血清(購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)混合，室溫中和Ih后，以絨毛尿囊膜途徑接種中和組雞胚，每個(gè)雞胚接種0.2mL ;病毒對照組雞胚，接種相同量病毒NJ株。接種后168h，中和組雞胚全部健活，病毒對照雞胚中死亡4個(gè)。將所有雞胚尿囊液進(jìn)行雞紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)，均為陰性，說明該病毒NJ株為IBDV純化病毒。
[0028](4)病毒純凈性鑒定:按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒檢測，結(jié)果均為陰性。
[0029](5)測定病毒NJ株的結(jié)構(gòu)蛋白基因(VP2基因)序列，其序列如SEQ ID N0:1所示。病毒NJ株VP2基因序列與當(dāng)前IBDV OKYM日本超強(qiáng)毒株、B87中毒毒力疫苗株、PBG98弱毒株的同源性均在90%以上，說明病毒NJ株為雞傳染性法氏囊病毒，命名為雞傳染性法氏囊病毒NJ株，縮寫為IBDV病毒NJ株。
[0030]實(shí)施例2雞傳染性法氏囊病毒VeiO細(xì)胞適應(yīng)株的篩選
本實(shí)施將雞傳染性法氏囊病毒NJ株在無血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上進(jìn)行增殖，通過有限稀釋法，篩選獲得一株病毒滴度高、具有穩(wěn)定遺傳特性的IBDV病毒NJ-23。
[0031]具體方法:
(I)Vero細(xì)胞采用IVT培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基，購于Gibico公司)培養(yǎng)至95%的匯合度，將Vero細(xì)胞采用0.1 %胰酶消化后1000rpm離心，用新鮮的IVT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照8 X IO5Cell/孔鋪制96孔板。
[0032](2)篩選:用添加有終濃度為0.25^2.5% (質(zhì)量百分濃度)乳清蛋白水解物(Sigma)的IVT培養(yǎng)基稀釋NJ株病毒液，用5個(gè)稀釋度(10_4~10_8)的病毒液感染步驟(1)鋪滿96孔板的單層Vero細(xì)胞，置37°C培養(yǎng)120h，收獲病毒液。反復(fù)凍融3次，在雞胚成纖維細(xì)胞上檢測每孔病毒效價(jià)TCID5tl (病毒效價(jià)測定詳細(xì)步驟參照《中國獸藥典》)。將病毒效價(jià)較高的培養(yǎng)物傳代至鋪滿24孔板的單層Vero細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)，培養(yǎng)120h后收獲病毒液。以相同方法重復(fù)克隆純化3次，篩選獲得病毒滴度高的雞傳染性法氏囊病毒Ck/Jiangsu/NJ-23/2008株，縮寫為雞傳染性法氏囊病毒NJ-23株。
[0033](3)病毒特異性鑒定:設(shè)立病毒對照組和中和組，每組設(shè)有5個(gè)l(Tll日齡SPF雞胚。將雞傳染性法氏囊病毒NJ-23株培養(yǎng)液用無菌PBS稀釋至104_° TID50/mL,與等體積的抗雞傳染性法氏囊病特異性血清(購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)混合，室溫中和Ih后，以絨毛尿囊膜途徑接種中和組雞胚，每個(gè)雞胚接種0.2mL ;病毒對照組雞胚，接種相同量病毒NJ-23株。結(jié)果顯示:接種后168h，中和組雞胚全部健活，病毒對照雞胚中死亡4個(gè)。將所有雞胚尿囊液進(jìn)行雞紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)，均為陰性，說明該病毒NJ-23株為IBDV純化病毒。
[0034](4)病毒穩(wěn)定性檢測:將IBDV病毒NJ-23株在Vero細(xì)胞(采用IVT培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得)上進(jìn)行傳代，并檢測每個(gè)代次的病毒效價(jià)，結(jié)果見圖1，發(fā)現(xiàn)在傳代至30代后仍保持較高的病毒效價(jià)。
[0035]IBDV病毒NJ-23株的保藏信息如下:
生物材料(毒株):Ck/Jiangsu/NJ-23/2008 ；
分類命名:雞傳染性法氏囊病毒；
拉丁文學(xué)名！Infectious Bursal Disease Virus, (IBDV);
保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)；
地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期:2014年3月6日；
保藏編號(hào):CGMCC N0.8852。
[0036]實(shí)施例3在無血清微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上培養(yǎng)IBDV病毒NJ-23株病毒液 在無血清微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上培養(yǎng)IBDV病毒NJ-23株病毒液的方法,如下:
(I)無血清培養(yǎng)Vero細(xì)胞:在IVT培養(yǎng)基中培養(yǎng)Vero細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到95%的匯合度，
采用0.1%的胰酶消化后1000rpm離心，用新鮮的IVT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞按照一定比例分傳至新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到95%的匯合度，獲得VeiO細(xì)胞。
[0037](2)初始Vero細(xì)胞在無血清微載體懸浮培養(yǎng):在IVT培養(yǎng)基中添加終濃度為
0.25% (質(zhì)量百分濃度)的乳清蛋白水解物后得到病毒維持液，其pH值為7.1。將步驟(1)獲得的Vero細(xì)胞用0.1%的胰酶消化、離心后，重懸于新鮮的IVT培養(yǎng)基中，1500rpm離心10min后，取沉淀，獲得Vero細(xì)胞。將Vero細(xì)胞按照3~4X IO5ceIΙ/mL的初始密度加入微載體Cytodex I (購于GE Healthcare公司)中，同時(shí)加入病毒維持液,進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:控制培養(yǎng)液PH值為7.1，懸浮培養(yǎng)攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37°C。
[0038](3)IBDV病毒的增殖:待Vero細(xì)胞在微載體上的粘球率達(dá)到40~50% (圖2)，按照感染復(fù)數(shù)為0.0-0.2接種IBDV病毒NJ-23株，增殖病毒NJ-23株。增殖過程中，控制培養(yǎng)液PH值7.2、懸浮培養(yǎng)攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37 °C。接毒后24h取樣觀察，發(fā)現(xiàn)Vero細(xì)胞仍處于生長階段，VeiO細(xì)胞密度可以達(dá)到5~8 X IO5ceIΙ/mL ;接毒后48h，部分Vero細(xì)胞從微載體上脫落；接毒后72h，有50%左右細(xì)胞脫落；接毒后120h，大部分Vero細(xì)胞從微載體上脫落(圖3)，收獲病毒培養(yǎng)物。
[0039](4)病毒液效價(jià)的測定:將病毒培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，釋放病毒，得到病毒液。在制備好的雞胚成纖維細(xì)胞上測定病毒液的效價(jià)。
[0040]按照相同方法，在無血清微載體懸浮培養(yǎng)的VeiO細(xì)胞上培養(yǎng)雞傳染性法氏囊病毒常規(guī)疫苗株B87 (購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；采用常規(guī)方法在雞胚成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)雞傳染性法氏囊病毒NJ株。
[0041]結(jié)果顯示:
IBDV病毒NJ-23株在無血清微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞增殖培養(yǎng)，在24h病毒液的效價(jià) TCID50 為 104 5/mL，在 120h 病毒液的效價(jià) TCID50 為 IO8 VmL0
[0042]雞傳染性法氏囊病毒常規(guī)疫苗株B87在無血清微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上增殖，在120h病毒液的效價(jià)TCID5tl為的106_°/mL ；
雞傳染性法氏囊病毒NJ株在雞胚成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)，病毒液的最高效價(jià)TCID5tl為IO70/mL。
[0043]結(jié)果表明，通過無血清微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞增殖的IBDV病毒NJ-23株的TCID50遠(yuǎn)高于常規(guī)疫苗株B87，同時(shí)也比常規(guī)雞胚成纖維細(xì)胞增殖IBDV NJ株的病毒效價(jià)聞。
[0044]經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)IBDV病毒NJ-23株在無血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，TCID50為可保持在IO8 VmL以上。
[0045]實(shí)施例4 IBDV病毒NJ-23株疫苗的免疫效果
為了驗(yàn)證IBDV病毒NJ-23株的免疫原性，制成疫苗后免疫，檢測抗體效價(jià)、持續(xù)期、攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)；同時(shí)免疫同類制品的商品苗:雞傳染性法氏囊病滅活疫苗(G株，哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司)，比較病毒免疫原性。
[0046](I)、病毒液和疫苗制備:按照實(shí)施例3方法制備IBDV病毒NJ-23株病毒液，接毒后培養(yǎng)120h收獲病毒液。病毒液經(jīng)檢測TCID5tl效價(jià)大于等于108_°EID5(l/mL后，經(jīng)甲醛滅活獲得滅活病毒液。將滅活病毒液與吐溫-80按照體積比為96:4混合，獲得水相。將白油與司本-80按照體積比為94:6混合獲得油相。將油相與水相按照體積比為1:3混合，得到IBDV病毒NJ-23株疫苗。
[0047](2)、SPF雞:SPF雞胚購自購自山東家禽所濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司，經(jīng)自行孵化至出殼，飼養(yǎng)于隔離器內(nèi)。
[0048](3)、試驗(yàn)動(dòng)物分組和免疫
取21日齡SPF雞70只，隨機(jī)選30只作為NJ-23株免疫組，每只皮下免疫IBDV病毒NJ-23株疫苗0.2mL ;另選30只作為常規(guī)疫苗免疫組，每只皮下免疫同類制品的商品苗(G株，哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司)0.2mL ;剩余的10只，不免疫作空白對照組。免疫疫苗后
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14W (周)，采血分離血清，測定雞傳染性法氏囊病毒中和抗體。[0049](4)、抗體效價(jià)檢測
采用固定病毒稀釋血清法進(jìn)行血清中和試驗(yàn)(中和實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟參照《中國獸藥典》)，檢測血清中雞傳染性法氏囊病毒抗體效價(jià)。當(dāng)血清稀釋2500倍后仍能中和100 TCID5tl的病毒，不產(chǎn)生病變，認(rèn)為合格，判為陽性血清。
[0050](5)、攻毒和保護(hù)效率檢測
免疫后4W，從免疫組(NJ-23株免疫組和常規(guī)疫苗免疫組)隨機(jī)挑選10只雞、空白對照組5只雞進(jìn)行攻毒?？瞻讓φ战M另外5只雞作為陰性對照組，不免疫不攻毒。具體攻毒方法如下:將攻毒毒株標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6-85 (購于中國藥檢所)稀釋到105BID/ml (雞體法氏囊感染量)，經(jīng)口接種，200uL/只。接種后3天剖檢，觀察病變。
[0051](6)、結(jié)果描述
6.1免疫后抗體水平檢測:①NJ-23株免疫組的雞，在免疫后2W，抗體陽性率為20%，
3、4W抗體陽性率升高到83.3%,96.7%，說明由無血清微載體懸浮增殖的IBDV病毒NJ-23株免疫原性很好。免疫后4W抗體效價(jià)達(dá)到最高，維持到12W后，抗體陽性率開始下降。②常規(guī)疫苗免疫組，在免疫后2W，未能檢測到抗體，免疫后4W抗體陽性率最高，升高至83.3 %，維持到IOW后，抗體陽性率開始下降。(表2)
6.2免疫后4W，攻毒結(jié)果如表1所示:①NJ-23株免疫組的雞，用BC6-85攻毒后3天剖檢顯示法氏囊無明顯病變，胸肌、腿肌正常常規(guī)疫苗免疫組的雞，用BC6-85攻毒后3天剖檢顯示，10只雞中出現(xiàn)I只法氏囊胸肌出血、I只出現(xiàn)法氏囊萎縮現(xiàn)象；③空白對照組剖檢結(jié)果顯示，5只雞均出現(xiàn)不同的病變，法氏囊有不同程度的損傷，同時(shí)還出現(xiàn)了胸肌和腿肌出血現(xiàn)象，這是典型的法氏囊感染病癥；④陰性對照組無明顯病毒。上述結(jié)果說明，相比較與常規(guī)疫苗組，NJ-23株疫苗可以更加有效保護(hù)免疫雞只抵抗BC6-85病毒的攻擊。
[0052]表1攻毒試驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，其特征在于所述Vero細(xì)胞適應(yīng)株為雞傳染性法氏囊病毒Ck/Jiangsu/NJ-23/2008株，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8852。
2.權(quán)利要求1所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株在制備雞傳染性法氏囊病疫苗中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述雞傳染性法氏囊病毒VeiO細(xì)胞適應(yīng)株的病毒液。
4.權(quán)利要求3所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的病毒液的制備方法，其特征在于:在無血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上增殖所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，得到病毒液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的病毒液的制備方法，其特征在于:所述增殖過程中，Vero細(xì)胞貼附在微載體上，在動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器內(nèi)懸浮培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的病毒液的制備方法，其特征在于:所述Vero細(xì)胞采用IVT培養(yǎng)基培養(yǎng)得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的病毒液的制備方法，其特征在于:所述增殖過程 中，細(xì)胞維持液為乳清蛋白水解物與IVT培養(yǎng)基的混合物。
8.一種疫苗組合物，其特征在于活性成分為滅活的權(quán)利要求1所述雞傳染性法氏囊病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株。
9.權(quán)利要求8所述疫苗組合物的制備方法，其特征在于將權(quán)利要求3所述雞傳染性法氏囊病毒VeiO細(xì)胞適應(yīng)株的病毒液滅活，然后與佐劑混合、乳化得到疫苗組合物。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK103923885SQ201410152417
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】吳培培, 馮磊, 禇軒, 唐應(yīng)華, 侯繼波 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院