使ACC-α基因啟動子PⅢ失活的物質及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了使ACC-α基因啟動子PⅢ失活的物質在生產產低脂奶的奶牛中的應用。本發(fā)明首先保護一種蛋白組，由TALE蛋白甲-Ⅰ和TALE蛋白甲-Ⅱ組成；所述TALE蛋白甲-Ⅰ包括序列表的序列14自N末端第180-791位氨基酸殘基組成的結合域和序列表的序列14第867-1062位氨基酸殘基組成的功能域；所述TALE蛋白甲-Ⅱ包括序列表的序列15自N末端第190-733位氨基酸殘基組成的結合域和序列表的序列15自N末端第809-1004位氨基酸殘基組成的功能域。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了可以高效沉默ACC-α基因啟動子的靶點，并基于該靶點設計了蛋白組、基因組、質粒組和RNA組，可以成功沉默了ACC-α基因啟動子，且敲除效率非常高。
【專利說明】使ACC-α基因啟動子P III失活的物質及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及使ACC-α基因啟動子P III失活的物質及其應用。
【背景技術】
[0002]基因打靶技術是一種定向改變生物體遺傳信息的技術，但對于動物體細胞的打靶效率很低(僅為10_6-10_7)。伴隨著分子生物學的不斷發(fā)展，涌現(xiàn)出很多新的技術和方法來提高基因打靶效率，如采用無啟動子篩選的基因打靶策略，動物中干細胞的分離及誘導等，但是這些改進對于生產基因打靶動物并沒有顯著的推動作用，基因打靶動物的生產一直處于緩慢發(fā)展階段。最近幾年，類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALENs)的出現(xiàn)極大地提高了基因打靶的效率，其將成為生產基因敲除動物的一個重要突破口。
[0003]類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALENs)融合了 DNA調控元件特異性結合DNA的特性以及內切核酸酶的催化活性，N末端的TALE蛋白結合域能夠特異結合DNA序列，通過C末端內切核酸酶FokI的催化作用，使得DNA雙鏈分子產生斷裂(DSB)，緊接著DSB就會啟動細胞內自身修復機制。目前主要的修復機制有兩種:一種是非同源重組的末端連接修復機制，另一種是同源重組 修復機制。前一種修復機制是一種易錯修復常常會產生遺傳信息的改變，而利用同源重組修復機制來修復DSB是一種高保真的修復方式，一般以另一條姐妹染色體為模板進行精確修復。在哺乳動物細胞內，前一種修復機制占主導作用，借助TALENs特異性產生DSB，引發(fā)細胞非同源重組的末端連接修復，在DSB位點引入小片段刪除或插入，造成移碼突變，或者引發(fā)失活突變等，達到使目的基因失活的目的。該技術的關鍵在于靶點區(qū)域的選擇。
[0004]隨著人們生活水平的提高，對健康優(yōu)質奶品的要求也越來越高，人們更加關注牛奶中的優(yōu)質蛋白質，同時希望牛奶中所含的脂肪更少。對于目前市場上的脫脂牛奶來說，在脫脂的過程中脂溶性的維生素也會被除去，主要是維生素A和維生素D，影響了人體對鈣質的吸收，而且如果完全脫掉牛奶中的脂肪，會破壞其營養(yǎng)價值，影響牛奶的口感和風味。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供使ACC- α基因啟動子P III失活的物質在生產產低脂奶的奶牛中的應用。
[0006]本發(fā)明首先保護一種蛋白組，由TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲_ II組成；所述TALE蛋白甲-1包括序列表的序列14自N末端第180-791位氨基酸殘基組成的結合域和序列表的序列14第867-1062位氨基酸殘基組成的功能域；所述TALE蛋白甲-1I包括序列表的序列15自N末端第190-733位氨基酸殘基組成的結合域和序列表的序列15自N末端第809-1004位氨基酸殘基組成的功能域。所述TALE蛋白甲-1具體可如序列表的序列14所示。所述TALE蛋白甲-1I具體可如序列表的序列15所示。所述TALE蛋白甲-1和所述TALE蛋白甲-1I具體可等質量配比。
[0007]本發(fā)明還保護一種DNA組，由TALE基因甲-1和TALE基因甲-1I組成；所述TALE基因甲-1編碼所述TALE蛋白甲-1 ;所述TALE基因甲-1I編碼所述TALE蛋白甲-1I。所述TALE基因甲-1包括序列表的序列10自5’末端第548-2383位核苷酸所示的結合域編碼區(qū)和序列表的序列10自5’末端第2609-3199位核苷酸所示的功能域編碼區(qū)。所述TALE基因甲-1I包括序列表的序列11自5’末端第578-2209位核苷酸所示的結合域編碼區(qū)和序列表的序列11自5’末端，第2435-3025位核苷酸所示的功能域編碼區(qū)。所述TALE基因甲-1具體可如序列表的序列10所示。所述TALE基因甲-1I具體可如序列表的序列
11所示。所述TALE基因甲-1和所述TALE基因甲-1I具體可等質量配比。
[0008]本發(fā)明還保護一種RNA組，由TALE-RNA甲-1和TALE-RNA甲-1I組成；所述TALE-RNA甲-1為所述TALE基因甲-1編碼的RNA ;所述TALE-RNA甲-1I為所述TALE基因甲-1I編碼的RNA。所述TALE-RNA甲-1和所述TALE-RNA甲-1I具體可等質量配比。
[0009]本發(fā)明還保護一種質粒組，由質粒甲和質粒乙組成；所述質粒甲為含有所述TALE基因甲-1的質粒；所述質粒乙為含有所述TALE基因甲-1I的質粒。所述質粒甲和所述質粒乙具體可等質量配比。所述質粒甲具體可為將序列表的序列6所示的TALE基因片段甲-1插入pCS2-Fok I載體(PEAS型)的Nhe I酶切位點得到的重組質粒TALENs_2201L。所述質粒乙具體可為將序列表的序列7所示的TALE基因片段甲-1I插入pCS2-Fok I載體(PERR型)的Nhe I酶切位點得到的重組質粒TALENs_2201R。
[0010]本發(fā)明還保護以上任一所述蛋白組、以上任一所述所述DNA組、以上任一所述所述RNA組或以上任一所述所述質粒組的應用，為如下(a)、(b)或(c): Ca)使ACC- α基因啟動子P III失活；(b)制備使ACC- α基因啟動子P III失活的試劑盒；(C)沉默離體的牛胎兒成纖維細胞中的ACC-α基 因啟動子PIII。所述ACC-a基因啟動子P III具體可如序列表的序列I所示。
[0011]本發(fā)明還保護將所述TALE-RNA甲-1和所述TALE-RNA甲-1I導入離體的牛胎兒成纖維細胞得到的ACC-α基因啟動子P III失活的重組細胞。所述ACC-α基因啟動子P III具體可如序列表的序列I所示。
[0012]本發(fā)明還保護以上任一所述蛋白組、以上任一所述所述DNA組、以上任一所述所述RNA組、以上任一所述所述質粒組或以上任一所述重組細胞在制備試劑盒中的應用；所述試劑盒的功能為生產產低脂奶的奶牛。
[0013]乙酰輔酶A羧化酶a (ACC-a )是脂肪酸從頭合成的限速酶。ACC-α基因由三個不同啟動子驅動。在乳腺中，由啟動子PI驅動的ACC- α表達量始終保持總量的約33%,啟動子PII驅動的ACC-a表達量在牛的乳腺中也不受泌乳期的影響，PIII是ACC-α的三個啟動子中唯一在泌乳期于乳腺上皮細胞中被強烈誘導的啟動子(約28倍)。
[0014]在類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALENs)技術的基礎上，本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)了可以高效沉默ACC-α基因啟動子的靶點，并基于該靶點設計了蛋白組、基因組、質粒組和RNA組。本發(fā)明中將RNA組導入牛成纖維細胞，成功沉默了 ACC-a基因啟動子，且敲除效率非常高，為生產基因敲除動物提供了極大的便利。
[0015]常規(guī)基因打靶克隆牛的生產流程，包括構建基因打靶載體、載體轉染、細胞藥物篩選、細胞單克隆的鑒定、體細胞核移植、克隆牛的鑒定。完成上述過程需要的時間為:載體構建3個月，細胞篩選I個月，體細胞核移植、胚胎發(fā)育I個月，胚胎移植妊娠到小牛出生10個月。這樣，一次克隆至少需要14個月的時間。最后得到的克隆牛含有藥物篩選所必須的抗性基因，要得到不含抗性基因的動物個體還要經歷一次體細胞克隆。本發(fā)明中將RNA組導入牛成纖維細胞，再將重組細胞與吸棄染色體的牛卵母細胞融合，然后將重構胚移入受體母牛的子宮，12個月即可得到基因敲除且不含抗性基因的克隆牛。本發(fā)明中通過一次轉染即可得到基因敲除的細胞克隆，這在常規(guī)基因打靶過程中是難以實現(xiàn)的，省去了藥物篩選過程，有利于細胞單克隆的形成，避免了細胞需要對抗藥物毒害的過程，對于后續(xù)的體細胞核移植和胚胎發(fā)育質量起到了關鍵作用，同時不含有抗性基因，大大簡化了生物安全評價過程。本發(fā)明中用于轉染的遺傳物質為mRNA，在細胞內的半衰期約為8小時，不會存在轉DNA時隨機插入細胞基因組的情況，對于動物遺傳穩(wěn)定性有良好的保證。同時不會有抗性基因的隨機整合，符合生物安全方面的要求。
[0016]本發(fā)明中得到的克隆牛，由于ACC-α基因啟動子失活，理論上能特異性減弱泌乳期ACC-α基因在乳腺上皮細胞中的表達量，使長鏈脂肪酸的合成量減少，從而降低牛奶中的脂肪含量，無需再進行脫脂(避免損失維生素)，可以大大滿足人們日益增長的對健康優(yōu)質奶品需求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為pCS2_Fok I載體的結構示意圖。
[0018]圖2為實施例2中的部分測序結果。
[0019]圖3為實施例3中的部分測序結果。
【具體實施方式】 [0020]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0021]取40日齡荷斯坦奶牛胎兒耳組織，按照常規(guī)方法[《細胞實驗指南》(上冊)，【美】D.L.斯佩克特等著；黃培堂等譯。北京:科學出版社，2001.2 ;第一章，第4節(jié)，27-32頁.]制備得到牛胎兒成纖維細胞系。
[0022]pCS2-Fok I載體(TALENs骨架載體)的結構示意圖見圖1。pCS2_Fok I載體:CffBIO ;包括一對結構基本相同的質粒，pCS2-Fok I載體(PEAS型)和pCS2_Fok I載體(PERR 型)。pCS2-Fok I 載體(PEAS 型)又稱 PEAS 型 pCS2_Fok I 載體，pCS2_Fok I 載體(PERR 型)又稱 PERR 型 pCS2-Fok I 載體。pCS2_Fok I 載體(PEAS 型)和 pCS2_Fok I 載體(PERR型)的差異僅在于:pCS2-Fok I載體(PEAS型)具有編碼Fok I核酸內切酶(PEAS型)的DNA序列，pCS2-Fok I載體(PERR型)具有編碼Fok I核酸內切酶(PERR型)的DNA序列。Fok I核酸內切酶(PEAS型)和Fok I核酸內切酶(PERR型)形成2聚體后發(fā)揮內切酶的功倉泛。
[0023]實施例1、TALENs表達載體的構建
[0024]一、篩選靶點區(qū)域
[0025]基于大量分析篩選與驗證，確認將ACC- α基因的啟動子P III (ACC- α基因的啟動子P III如序列表的序列I所示)中的兩個區(qū)域作為靶點:[0026]靶點區(qū)域甲如下:
[0027]5’ -tGTGTACTTCTGTTTTGAAGggttttcgtggaatgtTAATAGATTCGCGGCATa-3’ ；
[0028]靶點區(qū)域甲中，左側的下劃線為TALE蛋白甲-1的識別域，右側的下劃線為TALE蛋白甲-1I的識別域的反向互補序列，中間為Fok I內切核酸酶切割位點。
[0029]靶點區(qū)域乙如下:
[0030]5， -tTTGTGTACTTCTGTTTTGAagggttttcgtggaaTGTTAATAGATTCGCGGCa-3’。
[0031]靶點區(qū)域乙中，左側的下劃線為TALE蛋白乙-1的識別域，右側的下劃線為TALE蛋白乙-1I的識別域的反向互補序列，中間為Fok I內切核酸酶切割位點。
[0032]二、設計TALE蛋白
[0033]基于靶點區(qū)域甲，設計一對TALE蛋白(由TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲-1I組成XTALE蛋白甲-1的結合域如序列表的序列2所示(識別18個核苷酸)，TALE蛋白甲-1I的結合域如序列表的序列3所示(識別16個核苷酸)。
[0034]基于靶點區(qū)域乙，設計一對TALE蛋白(由TALE蛋白乙-1和TALE蛋白乙-1I組成)。TALE蛋白乙-1的結合域如序列表的序列4所示(識別18個核苷酸)，TALE蛋白乙-1I的結合域如序列表的序列5所示(識別17個核苷酸)。
[0035]三、制備DNA分子
[0036]制備用于編碼TALE蛋白甲-1的結合域的DNA分子和用于編碼TALE蛋白甲-1I的結合域的DNA分子。用于編碼TALE蛋白甲-1的結合域的DNA分子為TALE基因片段甲-1 (如序列表的序列6所示)，用于編碼TALE蛋白甲-1I的結合域的DNA分子為TALE基因片段甲-1I (如序列表的序列7所示)。
[0037]制備用于編碼TALE蛋白乙-1的結合域的DNA分子和用于編碼TALE蛋白乙-1I的結合域的DNA分子。用于編碼TALE蛋白乙-1的結合域的DNA分子為TALE基因片段乙-1 (如序列表的序列8所示)，用于編碼TALE蛋白乙-1I的結合域的DNA分子為TALE基因片段乙-1I (如序列表的序列9所示)。
[0038]四、制備重組質粒
[0039]將TALE基因片段甲-1插入pCS2_Fok I載體(PEAS型)的Nhe I酶切位點，得到重組質粒 TALENs-2201L。
[0040]將TALE基因片段甲-1I插入pCS2_Fok I載體(PERR型)的Nhe I酶切位點，得到重組質粒 TALENs-2201R。
[0041]將TALE基因片段乙-1插入pCS2_Fok I載體(PEAS型)的Nhe I酶切位點，得到重組質粒 TALENs-2199L。
[0042]將TALE基因片段乙-1I插入pCS2_Fok I載體(PERR型)的Nhe I酶切位點，得到重組質粒 TALENs-2199R。
[0043]五、制備mRNA
[0044]取重組質粒TALENs-2201L，采用試劑盒(QiagenRNeasyMini Kit,Cot.N0.74104)進行體外轉錄，得到TALE-RNA甲-1 (將TALE-RNA甲-1反轉錄并測序，如序列表的序列10所示；序列表的序列10所示的DNA分子即為TALE基因甲-1，編碼序列表的序列14所示的TALE蛋白甲-1 )。
[0045]取重組質粒TALENs-220IR，采用試劑盒(QiagenRNeasyMini Kit, Cot.N0.74104)進行體外轉錄，得到TALE-RNA甲-1I (將TALE-RNA甲-1I反轉錄并測序，如序列表的序列11所示；序列表的序列11所示的DNA分子即為TALE基因甲-1I，編碼序列表的序列15所示的TALE蛋白甲-1I)。
[0046]取重組質粒TALENs-2199L，采用試劑盒(QiagenRNeasyMini Kit, Cot.N0.74104)進行體外轉錄，得到TALE-RNA乙-1 (將TALE-RNA乙-1反轉錄并測序，如序列表的序列12所示；序列表的序列12所示的DNA分子即為TALE基因乙-1，編碼序列表的序列16所示的TALE蛋白乙-1 )。
[0047]取重組質粒TALENs-2199R，采用試劑盒(QiagenRNeasyMini Kit, Cot.N0.74104)進行體外轉錄，得到TALE-RNA乙-1I (將TALE-RNA乙-1I反轉錄并測序，如序列表的序列13所示；序列表的序列13所示的DNA分子即為TALE基因乙-1I，編碼序列表的序列17所示的TALE蛋白乙-1I)。
[0048]序列表的序列10中，自5’末端第548-2383位核苷酸編碼結合域，第2609-3199位核苷酸編碼Fok I核酸內切酶(PEAS型)。序列表的序列14中，自N末端第180-791位氨基酸殘基組成結合域，第867-1062位氨基酸殘基組成Fok I核酸內切酶(PEAS型)。[0049]序列表的序列11中，自5’末端第578-2209位核苷酸編碼結合域，第2435-3025位核苷酸編碼Fok I核酸內切酶(PERR型)。序列表的序列15中，自N末端第190-733位氨基酸殘基組成結合域，第809-1004位氨基酸殘基組成Fok I核酸內切酶(PERR型)。
[0050]序列表的序列12中，自5’末端第548-2383位核苷酸編碼結合域，第2609-3199位核苷酸編碼Fok I核酸內切酶(PEAS型)。序列表的序列16中，自N末端第180-791位氨基酸殘基組成結合域，第867-1062位氨基酸殘基組成Fok I核酸內切酶(PEAS型)。
[0051]序列表的序列13中，自5’末端第578-2311位核苷酸編碼結合域，第2537-3127位核苷酸編碼Fok I核酸內切酶(PERR型)。序列表的序列17中，自N末端第190-767位氨基酸殘基組成結合域，第843-1038位氨基酸殘基組成Fok I核酸內切酶(PERR型)。
[0052]實施例2、TALENs敲除效率
[0053]如果TALENs發(fā)揮切割作用，細胞會啟動自身修復機制，在切割位點會出現(xiàn)小片段的刪除或者插入，測序結果峰圖為雜合峰圖。
[0054]talenjd2f:5，-AGAGATCAAGATAGGAGGATTC-3，；
[0055]talenjd2r:5’ -TTGCCACAGAGCGATAAG-3，。
[0056]一、第一對TALENs (TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲-1I )的敲除效率
[0057]1、將TALE-RNA甲-1和TALE-RNA甲-1I電擊轉化牛胎兒成纖維細胞系，每IO6個細胞轉染 2 μ g TALE-RNA 甲-1 和 2 μ g TALE-RNA 甲-1I。
[0058]2、步驟I中電擊72小時后，提取細胞的基因組DNA，采用talenjd2f和talenjd2r組成的引物對進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物進行測序，測序結果峰圖為雜合峰圖。
[0059]3、步驟2中電擊72小時后，采用TA克隆測序的方式計算敲除效率(突變類型與有效測序總數的比值即為敲除效率；有效測序總數為野生型克隆與突變型克隆的總和)。第一對TALENs (TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲-1I)的敲除效率為17%。部分測序結果見圖2。
[0060]二、第二對TALENs (TALE蛋白乙-1和TALE蛋白乙-1I )的敲除效率
[0061]1、將TALE-RNA乙-1和TALE-RNA乙-1I電擊轉化牛胎兒成纖維細胞系，每IO6個細胞轉染 2 μ g TALE-RNA 乙-1 和 2 μ g TALE-RNA 乙-1I。
[0062]2、步驟I中電擊72小時后，提取細胞的基因組DNA，采用talenjd2f和talenjd2r組成的引物對進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物進行測序，測序結果峰圖為雜合峰圖。
[0063]3、步驟2中電擊72小時后，采用TA克隆測序的方式計算敲除效率。第二對TALENs(TALE蛋白乙-1和TALE蛋白乙-1I)的敲除效率為4%。
[0064]實施例3、單細胞克隆的獲得以及基因敲除克隆的鑒定
[0065]一、制備供體細胞
[0066]1、將TALE-RNA甲-1和TALE-RNA甲-1I電擊轉染(采用AMAXA電轉染儀，參數設置為T-016)牛胎兒成纖維細胞系，每IO6個細胞轉染2μ g TALE-RNA甲-1和2 μ gTALE-RNA甲-1I。
[0067]2、將完成步驟I的細胞接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，補加含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液，在含5%C02的細胞培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)6-7天(表面形成分散的單細胞克隆)。
[0068]3、取步驟2得到的各個單細胞克隆，分別轉接至48孔細胞培養(yǎng)板的不同培養(yǎng)孔并采用步驟2相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)3-4天(細胞鋪滿整個孔)，消化細胞，取1/10細胞進行步驟4，剩余細胞接種于6孔板(用于后續(xù)陽性克隆的細胞凍存)。
[0069]4、提取細胞的基因組DNA，采用talenjd2f和talenjd2r組成的引物對進行PCR擴
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[0070]5、將步驟4得到的PCR擴增產物進行測序，在靶點區(qū)域甲發(fā)生了刪除\插入\失活性突變的單克隆細胞即為供體細胞。
[0071]隨機取如下兩個供體細胞進行步驟三:
[0072]第一個供體細胞為Ilbp刪除的單克隆細胞(單等位基因敲除的雜合體，即僅一條染色體上發(fā)生了 Ilbp刪除)，刪除區(qū)域為如下靶序列中方框標注的區(qū)域:
[0073]5，-tGTGTACTTCTGTTTTGAAGggtt [t Icgtggaat^ tTAATAGATTCGCGGCATa-3，；
[0074]第二個供體細胞為13bp刪除的單克隆細胞(單等位基因敲除的雜合體，即僅一條染色體上發(fā)生了 13bp刪除)，刪除區(qū)域為如下靶序列中方框標注的區(qū)域:
[0075]5，-tGTGTACTTCTGTTTTGAAGg ；|gtt^gtTAATAGATTCGCGGCATa-3，。
[0076]二、制備受體細胞
[0077]從屠宰場收集成年荷斯坦奶牛的卵巢，取直徑2-8毫米的卵泡，回收形態(tài)均勻、結構致密的卵丘-卵母細胞復合體，將卵丘-卵母細胞復合體放入含成熟液(液體M199培養(yǎng)基+10%胎牛血清+0.01U/ml牛促卵泡激素+0.0I/ml牛促黃體生成激素+1 μ g/ml雌二醇)的四孔細胞培養(yǎng)板(50-60個/孔)，在含5%0)2培養(yǎng)箱中38.5°C培養(yǎng)18_20h，然后將成熟的卵母細胞放入裝有0.1%透明質酸酶的離心管中震蕩2-3min，用玻璃管輕輕吹打以使卵丘細胞與卵母細胞完全脫離，選擇形態(tài)完整、細胞質均勻并排出第一極體的卵母細胞作為受體細胞。
[0078]三、轉基因克隆胚胎制備及胚胎移植
[0079]1、將步驟二得到的帶有第一極體的卵母細胞移入操作液(液體M199培養(yǎng)基+10%FBS+7.5 μ g/ml細胞松弛素B)，在200倍顯微鏡下用一玻璃針于極體上方將透明帶切一小口，然后用內徑為20 μ m的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細胞內的染色體一并吸出，然后將去除第一極體和染色體的卵母細胞放入含20%FBS的液體M199培養(yǎng)基中洗滌二遍。
[0080]2、取步驟一得到的供體細胞，血清饑餓2-4天后用0.25%胰蛋白酶消化2_4min。
[0081]3、從步驟2中選取直徑10-12 μ m的細胞，移入步驟I得到的卵母細胞的透明帶內，然后將其放入 Zimmerman 液(含 0.3M 甘露醇、0.1M MgSO4、0.05M CaCl2、0.5mM HEPES,0.05g/100mL BSA的水溶液，ρΗ7.2，用0.22 μ m濾膜過濾)中平衡3_5min，然后放入融合槽內，轉動卵母細胞使供體細胞與卵母細胞接觸面與電場垂直，同時在直流脈沖的場強為2.5kv/cm、脈沖時間為10 μ S、脈沖次數為2次、脈沖間隔為Is的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)，然后迅速將重構胚移入含10%FBS的液體M199培養(yǎng)基中30min，然后將重構胚放入5 μ mo I/L離子霉素水溶液中4min，然后移至1.9mmol/L6-DMAP水溶液中4h，然后移入含5%FBS的CRlaa培養(yǎng)液中并置于含5%C02的培養(yǎng)箱在38.5°C培養(yǎng)2天，然后將形態(tài)優(yōu)良的第7天的克隆囊胚移入同期受體母牛的子宮角內，在移植后第60天進行直腸檢測，以確定妊娠率。
[0082]3、受體母牛自然生產后，每種供體細胞獲得5頭子代牛。
[0083]3、取子代牛的耳組織，提取基因組DNA，采用talenjd2f和talenjd2r組成的引物對進行PCR擴增，然后進行測序。
[0084]第一個供體細胞得到的5頭牛犢均為Ilbp刪除的單等位基因敲除克隆牛(部分測序結果見圖3)。
[0085]第二個供體細胞得到的5頭牛犢均為Ilbp刪除的單等位基因敲除克隆牛。
【權利要求】
1.蛋白組，由TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲-1I組成；所述TALE蛋白甲-1包括序列表的序列14自N末端第180-791位氨基酸殘基組成的結合域和序列表的序列14第867-1062位氨基酸殘基組成的功能域；所述TALE蛋白甲-1I包括序列表的序列15自N末端第190-733位氨基酸殘基組成的結合域和序列表的序列15自N末端第809-1004位氨基酸殘基組成的功能域。
2.如權利要求1所述的蛋白組，其特征在于:所述TALE蛋白甲-1如序列表的序列14所示；所述TALE蛋白甲-1I如序列表的序列15所示。
3.DNA組，由TALE基因甲-1和TALE基因甲-1I組成；所述TALE基因甲-1編碼權利要求I中所述TALE蛋白甲-1 ;所述TALE基因甲-1I編碼權利要求1中所述TALE蛋白甲-1I。
4.如權利要求3所述的DNA組，其特征在于:所述TALE基因甲-1包括序列表的序列10自5’末端第548-2383位核苷酸所示的結合域編碼區(qū)和序列表的序列10自5’末端第2609-3199位核苷酸所示的功能域編碼區(qū)；所述TALE基因甲-1I包括序列表的序列11自5’末端第578-2209位核苷酸所示的結合域編碼區(qū)和序列表的序列11自5’末端，第2435-3025位核苷酸所示的功能域編碼區(qū)。
5.如權利要求3所述的DNA組，其特征在于:所述TALE基因甲-1如序列表的序列10所示；所述TALE基因甲 -1I如序列表的序列11所示。
6.RNA組，由TALE-RNA甲-1和TALE-RNA甲-1I組成；所述TALE-RNA甲-1為權利要求3至5中任一所述TALE基因甲-1編碼的RNA ;所述TALE-RNA甲-1I為權利要求3至5中任一所述TALE基因甲-1I編碼的RNA。
7.質粒組，由質粒甲和質粒乙組成；所述質粒甲為含有權利要求3至5中任一所述TALE基因甲-1的質粒；所述質粒乙為含有權利要求3至5中任一所述TALE基因甲-1I的質粒。
8.權利要求1或2所述蛋白組、權利要求3或4或5所述DNA組、權利要求6所述RNA組或權利要求7所述質粒組的應用，為如下(a)、(b)或(c): Ca)使ACC- α基因啟動子P III失活；(b)制備使ACC- α基因啟動子P III失活的試劑盒；(C)沉默離體的牛胎兒成纖維細胞中的ACC-α基因啟動子P III。
9.將權利要求6中所述TALE-RNA甲-1和TALE-RNA甲-1I導入離體的牛胎兒成纖維細胞得到的ACC- α基因啟動子P III失活的重組細胞。
10.權利要求1或2所述蛋白組、權利要求3或4或5所述DNA組、權利要求6所述RNA組、權利要求7所述質粒組或權利要求9所述重組細胞在制備試劑盒中的應用；所述試劑盒的功能為生產產低脂奶的奶牛。
【文檔編號】C12N5/10GK103923215SQ201410149606
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權日:2014年4月15日
【發(fā)明者】戴蘊平, 丁方榮, 王本利, 鄭敏, 李松, 王海萍, 李京, 李玲, 王美麗 申請人:中國農業(yè)大學