一種與小型豬2型糖尿病有關的snp標記、其檢測方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與小型豬2型糖尿病有關的SNP標記、其檢測方法和用途，本發(fā)明的SNP標記是位于Leptin基因的1號外顯子325bp處的G/A多態(tài)，有該SNP標記的Leptin基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，其檢測方法為：提取小型豬的基因組DNA為模板，使用核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3所示的引物來進行PCR擴增，將PCR擴增產物測序，分析測序結果，判讀在1號外顯子325bp處的G/A多態(tài)。本發(fā)明提供的SNP標記與小型豬對2型糖尿病的易感性相關，因此，可以通過鑒定該SNP標記來篩選對2型糖尿病易感或抵抗的小型豬品系。
【專利說明】一種與小型豬2型糖尿病有關的SNP標記、其檢測方法和用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學【技術領域】，涉及一種與小型豬2型糖尿病有關的SNP標記、其檢測方法和用途。
【背景技術】
[0002]糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種慢性內分泌代謝性疾病,嚴重的威害人類的健康，其主要標志是高血糖。近年來，全球糖尿病患病率呈迅速上升的趨勢，2011年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數據表明，全球的糖尿病患者已經達到3.66億人，預計至2030年全球發(fā)病率將達4.39億人。我國18歲及以上居民糖尿病患病率為9.7%，60歲以上老年人患病率高達19.6%，全國約有 成年糖尿病患者9700萬人，糖尿病已經成為影響我國人口健康尤其是老年人身體健康的主要疾病，極大增加了社會養(yǎng)老的成本，這個問題在今后我國老年人口比率增加的趨勢下顯得日益尖銳。根據發(fā)病機制的不同，糖尿病可分為I型、2型、特異型和妊娠糖尿病4類。其中，2型糖尿病(Type 2 Diabetes mellitus, T2DM)患者占糖尿病人總數的90%以上，不斷探索2型糖尿病治療新方法及開發(fā)新藥物具有非常重要的臨床意義和社會價值。
[0003]普遍認為2型糖尿病是由遺傳、行為、環(huán)境等多種危險因素共同參與和相互作用所引起的多因子疾病，2型糖尿病的發(fā)病機制仍然不夠清楚，治療效果不理想。在2型糖尿病發(fā)病機制、藥物開發(fā)和干預治療的研究中，2型糖尿病動物模型的構建和使用有著非常重要的意義。動物模型在糖尿病研究中已經得到廣泛的應用，早期胰腺在糖代謝平衡中的中心作用在胰腺切除犬實驗得到了證實，并發(fā)現(xiàn)和純化了胰島素。鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)和四氧嘧唳(alloxan)是對胰島具有選擇性的毒素,能引發(fā)多種動物的高血糖癥，最常用于I型糖尿病模型的建立。通過遺傳選育，可培育出I型糖尿病、2型糖尿病的相關表型的品系，如胰島素抵抗和肥胖的理想動物模型。近年來，大量的糖尿病相關基因研究的動物模型已通過分子生物學等技術建立，其中包括廣義基因剔除、基因替換和組織特異性基因剔除小鼠。小型豬在解剖學、生理學、營養(yǎng)代謝和疾病特征等方面都與人有較大的相似性。小型豬具有生命周期長、性成熟早、繁殖快、易于飼養(yǎng)等特點，在生物醫(yī)學研究領域中具有重要的應用價值。相比于大小鼠，小型豬與人類更加接近，型豬的臟器系數更近于人類；另一方面豬的胰島素與人類的胰島素只差一個氨基酸，對糖的吸收、轉運和利用等方面與人類更為相似；相比于非人靈長類動物，小型豬沒有苛刻的倫理道德和動物保護方面的要求，加上飼養(yǎng)和試驗成本較低，小型豬成為制作2型糖尿病模型的理想動物。但建立大動物2型糖尿病模型的方法具有很大的難度，獲得自發(fā)性糖尿病小型豬的幾率非常稀少，因此，目前急需篩選培育出小型豬2型糖尿病易感或抵抗品系。
[0004]2型糖尿病是同時由遺傳因素和環(huán)境因素互相作用而引發(fā)的代謝異常性疾病，大量的研究表明，許多基因的單核苷酸多態(tài)性多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism,SNP)與2型糖尿病的發(fā)生存在著不可忽視的關系。L印tin基因屬于分泌型蛋白類激素，主要是脂肪組織合成，以單體形式存在于血液中，最早被用克隆定位的方法從小鼠中成功克隆出來。Leptin的主要功能是增加能量的消耗，降低食物的攝入以及減輕體重，所以又被成為瘦素。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Leptin不僅和集體的能量代謝有關，還參與生殖系統(tǒng)的發(fā)育、機體的生長、還與人類的肥胖和糖尿病有關聯(lián)。和其他一些蛋白一樣，L印tin的生理功能也需要通過與相應受體的結合來體現(xiàn)。人L印tin受體基因位于I號染色體，長度大于70kbp，包含有20個外顯子，是L印tin高親和力因子，又稱作糖尿病基因。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種與小型豬2型糖尿病易感性相關的SNP標記。
[0006]本發(fā)明的另一個目的在于提供用于檢測上述SNP標記的引物和檢測方法。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供上述SNP標記的用途。
[0008]本發(fā)明所述的與小型豬2型糖尿病易感性相關的SNP標記，是在小型豬L印tin基因的I號外顯子325bp處的(G/A)多態(tài)，具有該SNP標記的L印tin基因的I號外顯子核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]檢測上述SNP標記所用的引物的核苷酸序列如SEQIDN0:2和SEQ ID NO:3所示。
[0010]在小型豬中檢測所述與小型豬2型糖尿病易感性相關的SNP標記的方法，包括以下步驟:
[0011](I)提取小型豬的基因組DNA ;
[0012](2)用提取的小型豬基因組DNA為模板，使用核苷酸序列如SEQ ID NO: 2和SEQ IDNO: 3所示的引物來進行PCR擴增；
[0013](3)將PCR擴增產物測序，分析測序結果，判讀在I號外顯子325bp處的(G/A)多態(tài)。
[0014]優(yōu)選地，步驟(3)中，將PCR產物先經瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段后再進行測序。
[0015]優(yōu)選地，步驟(2)所述的PCR擴增反應體系為:DNA模板3yL、SEQ ID NO: 2和SEQID NO: 3所示的引物各2 μ L.PCRMix試劑25 μ L、雙蒸水18 μ L ;其中，所述DNA模板濃度為SOng/yL，所述引物的濃度為25 μ mol/L，所述PCR Mix試劑為北京康為世紀生物科技有限公司的CW0716型號試劑。
[0016]優(yōu)選地，PCR擴增的反應程序為:預變性94°C 5min ;變性98°C 10s，退火61°C 30s，延伸72°C 30~60s，35個循環(huán)；延伸72°C 7~lOmin。
[0017]本發(fā)明所述的與小型豬2型糖尿病易感性相關的SNP標記，可用于篩選對2型糖尿病易感或抵抗的小型豬品系。
[0018]本發(fā)明提供的SNP標記與小型豬對2型糖尿病的易感性相關，因此，可以通過鑒定該SNP標記來篩選對2型糖尿病易感或抵抗的小型豬品系,所得的對2型糖尿病易感或抵抗的小型豬品系可用于研究、篩選治療2型糖尿病的藥物，具有廣泛的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為使用本發(fā)明的引物擴增目的基因的電泳圖?！揪唧w實施方式】
[0020]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和本質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0021]下述實施例中使用的動物、儀器、試劑、試劑盒均可由市售得到；
[0022]預備例建立小型豬糖尿病模型
[0023]1.實驗動物來源:廣西大學巴馬小型豬繁育場封閉群。從86頭豬中選取120~150d日齡，體重相近(25~30公斤左右)實驗豬46頭(公22頭，母24頭)，管理上公母分開飼養(yǎng)，每欄4~6頭；
[0024]2.飼喂方法:[0025]實驗日糧配方:60%全價飼料(飼料公司提供的試驗專用配合全價料，12.95MJ/kg消化能，17%粗蛋白質)，30%蔗糖，10%豬油。
[0026]為避免因日糧改變而造成的采食量下降，實驗開始階段，實驗豬的飼喂要求由常規(guī)飼料緩慢過渡到實驗日糧。一般每頓之間，蔗糖增量為飼喂量的1.5%，豬油增量為飼喂量的0.5%，最后直至達到實驗日糧的要求。
[0027]要求飼喂量為體重的3%，每天早晚兩次定時、定點飼喂，自由飲水。建模期7個月(210d)。
[0028]3.在高脂高糖飼喂條件下，每隔I個月測量空腹血糖值，當小型豬空腹血糖值大于6.3mmol/L為血糖異常。連續(xù)兩次空腹血糖值大于6.3mmol/L則確診為糖尿病。如果只有一次空腹血糖值大于6.3mmol/L，則進行靜脈注射葡萄糖耐量試驗，如果靜脈注射葡萄糖耐量60min血糖值大于6.3mmol/L,也確診為糖尿病。
[0029]4.建模結果:
[0030]實驗前的空腹血糖指標有少數幾頭出現(xiàn)血糖異常(>6.3mmol/L)，但并不穩(wěn)定，沒有重復性。連續(xù)兩次都出現(xiàn)空腹血糖異常的個體從120d就開始出現(xiàn)。至實驗結束，在全部的46頭個體中，共有10頭出現(xiàn)連續(xù)兩次空腹血糖異常，，連續(xù)兩個月中，有一個月血糖值超過6.3mmol/L的個體中，經過靜脈注射葡萄糖耐量試驗,60min的血糖值幾乎都比Omin的高，且19頭個體中有13頭個體高于6.3mmol/L,即由靜脈注射葡萄糖耐量確定的2型糖尿病個體有13頭。至實驗結束時共有20頭豬確診為2型糖尿病，本實驗的建模成功率為43.5%。
[0031]實施例
[0032]1.提取小型組基因組DNA
[0033]用前腔靜脈采血的方法，采集預備例中46頭實驗豬的血液，每例取3ml，放入枸櫞酸鈉抗凝劑采血管中，放置于_20°C冰箱保存待用；
[0034]按照北京天根生物技術有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒操作方法，提取46頭豬的基因組DNA。
[0035]2.目的片段PCR擴增與測序
[0036]用已提取的DNA為模板，根據所設計的引物，進行PCR擴增:取DNA模板3 μ L、SEQID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的引物各2 μ L、PCRMix試劑25 μ L、雙蒸水18 μ L，設置PCR擴增體系:預變性94°C 5min ;變性98°C 10s，退火61 °C 30s，延伸72°C 60s，35個循環(huán);然后延伸 72°C IOmin0
[0037]PCR產物在2%瓊脂糖膠中電泳檢測，擴增的目的片段大小為568bp，電泳圖見圖1，將回收的目的片段測序，測序結果用DNAstar軟件與GenBank中豬的相關基因片段序列序列比對、分析，判讀在Leptin基因I號外顯子325bp處的(G/A)多態(tài)。
[0038]3.結果與分析
[0039]3.1測序結果與Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗
[0040]測序結果表明，在L印tin基因I號外顯子325bp處的(G/A)多態(tài)，對應參考序列豬Leptin基因序列(GenBank登錄號NC_010460.3)中位置為881位點。對46頭參與2型糖尿病建模試驗的豬應的測序結果進行L印tin881G/A基因型辨別，結果發(fā)現(xiàn)881AA6頭，881AG25頭，881GG15頭.H-W遺傳平衡檢驗顯示2型糖尿病組與正常組881G/A基因頻率分布處于Hardy-Weinberg平衡。
[0041]表1 L印tin基因881G/A位點H-W遺傳平衡檢驗
[0042]
【權利要求】
1.一種與小型豬2型糖尿病易感性相關的SNP標記，其特征在于，所述SNP標記是在小型豬L印tin基因的I號外顯子325bp處的G/A多態(tài)，具有該SNP標記的L印tin基因的I號外顯子核苷酸序列如SEQ ID NO:1所不。
2.檢測權利要求1所述的SNP標記的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取小型豬的基因組DNA; (2)用已提取的小型豬基因組DNA為模板，使用核苷酸序列如SEQID N0:2和SEQIDNO: 3所示的引物來進行PCR擴增； (3)將PCR擴增產物測序，分析測序結果，判讀在I號外顯子325bp處的G/A多態(tài)。
3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，將PCR產物先經瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段后再進行測序。
4.按照權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的PCR擴增反應體系為:DNA模板3yL、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的引物各2 μ L、PCR Mix試劑25 μ L、雙蒸水18 μ L ;其中，所述DNA模板濃度為30ng/ μ L，所述引物的濃度為25 μ mol/L,所述PCRMix試劑為北京康為世紀生物科技有限公司的CW0716型號試劑。
5.按照權利要求4所 述的方法，其特征在于，PCR擴增的反應程序為:預變性940C 5min ;變性 98°C 10s，退火 61°C 30s，延伸 72°C 30 ~60s，35 個循環(huán)；延伸 72°C 7 ~1Omin0
6.檢測權利要求1所述的SNP標記所用的引物，其特征在于:所述引物的核苷酸序列如 SEQ ID N0:2 和 SEQ ID N0:3 所示。
7.權利要求1所述的SNP標記在篩選對2型糖尿病易感或抵抗的小型豬品系中的用途。
【文檔編號】C12N15/11GK103937787SQ201410137904
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月8日 優(yōu)先權日:2014年4月8日
【發(fā)明者】郭亞芬, 蘭干球, 蔣欽楊, 楊輝 申請人:廣西大學