歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個(gè)歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1，序列全長(zhǎng)767bp，包含完整開放閱讀框序列全長(zhǎng)429bp，編碼142個(gè)氨基酸，通過(guò)花序浸染法導(dǎo)入模式植物擬南芥中進(jìn)行功能研究結(jié)果表明，該歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBF1能明顯提高擬南芥對(duì)于滲透脅迫，干旱脅迫和失水處理的耐受力。在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系中的電解質(zhì)滲漏率（EL），丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的積累明顯低于野生對(duì)照，而脯氨酸（Proline）含量明顯高于野生對(duì)照。氣孔研究表明，轉(zhuǎn)基因株系對(duì)ABA處理比野生對(duì)照更敏感?？购祷蚨糠治鼋Y(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系中依賴于ABA途徑的抗旱基因AtRD22和AtRD29B的表達(dá)量明顯高于野生對(duì)照。表明在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的過(guò)量表達(dá)通過(guò)依賴于ABA的途徑提高了植株的抗旱能力。
【專利說(shuō)明】歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFI
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物抗逆基因鑒定及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一個(gè)歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl。
【背景技術(shù)】
[0002]多蛋白橋梁因子MBFl(Multiprotein bridging factorl)是一類存在于古生菌和真核生物中高度保守的轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白，首次被提純于蠶的后部絲腺抽提物中。之后的研究表明，MBFl與內(nèi)皮細(xì)胞分化、激素調(diào)節(jié)、脂類代謝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和組氨酸新陳代謝等不同過(guò)程的調(diào)控相關(guān)。轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白在真核生物的基因表達(dá)中扮演決定性的角色，不同有機(jī)體的MBFl蛋白是通過(guò)TATA盒與C-Jun，GCN4，ATFl或其它核受體相互作用的。它的基本表達(dá)導(dǎo)致了許多編碼逆境反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累，如WRKY轉(zhuǎn)錄因子、類CBF轉(zhuǎn)錄因子、MAPK3/11和鈣結(jié)合蛋白等。在酵母、人和果蠅中的MBFl增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活主要是通過(guò)一個(gè)基本的區(qū)域(如bZIP類轉(zhuǎn)錄激活因子)和TATA盒連接蛋白之間的橋連作用。[0003]目前的研究表明，植物中的MBFl具有多重生物學(xué)功能，主要表現(xiàn)在參與各種抗逆過(guò)程，其次是植物的發(fā)育過(guò)程。擬南芥有三個(gè)亞型AtMBFla，AtMBFlb和AtMBFlc。AtMBFlc參與應(yīng)答高溫、H202、干旱、高鹽、病原菌侵染以及植物激素等逆境條件，并在葉細(xì)胞周期和擴(kuò)展過(guò)程中起著重要作用。之后，不同植物中的MBFl的生物學(xué)功能陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。土豆、番茄、煙草和小麥等植物中的MBFl與各種激素處理、生物和非生物脅迫相關(guān)。事實(shí)上，就目前的研究看來(lái)，幾乎所有的植物MBFls都參與了生物和非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程。
[0004]干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的一個(gè)重要的環(huán)境因素。在我國(guó)尤其是干旱和半干旱地區(qū)，缺水問(wèn)題一直是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最主要因素之一。因此，發(fā)掘植物抗旱相關(guān)基因?qū)购底魑镄缕贩N的培育有重要意義。
[0005]植物在逆境脅迫過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的自由基會(huì)引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用而造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲漏率(EL)能反映細(xì)胞膜的完整性，從而判定細(xì)胞膜的損傷程度，進(jìn)一步說(shuō)明植株的抗逆性的強(qiáng)弱。在植物體正常的代謝過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)處于逆境時(shí)，植物體內(nèi)活性氧的平衡受到破壞，植物細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS而無(wú)法被及時(shí)清除，造成了嚴(yán)重氧化傷害，進(jìn)而影響到了植物正常的生理代謝。因此可以通過(guò)測(cè)量ROS的含量來(lái)判定植物細(xì)胞清除ROS的能力。根據(jù)生物自由基傷害學(xué)說(shuō)，干旱脅迫下造成植物傷害就是細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除的不平衡所致，從而發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，形成丙二醛(MDA)，使植物受到傷害。丙二醛(MDA)是植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)傷害的重要標(biāo)志之一，可以通過(guò)測(cè)定其含量來(lái)反映植株的抗逆性強(qiáng)弱。
[0006]脯氨酸是氨基酸中最為有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，正常情況下，植物體內(nèi)的脯氨酸含量較低，干旱脅迫時(shí)含量便會(huì)大大增高，對(duì)維持細(xì)胞與環(huán)境的滲透平衡、穩(wěn)定大分子的結(jié)構(gòu)具有重要作用。在干旱脅迫下植物體內(nèi)源脯氨酸可能具有清除活性氧的作用。盡管對(duì)于許多植物來(lái)說(shuō)，脯氨酸積累在逆境中的生理作用的機(jī)理還不完全清楚，但有報(bào)道認(rèn)為在干旱作用下脯氨酸含量的升高有利于植物對(duì)干旱脅迫的抵抗，耐旱品種通常比不耐旱品種具有較強(qiáng)的積累脯氨酸的能力。因此，通過(guò)測(cè)定脯氨酸的含量可以判定植株抗旱能力的強(qiáng)弱。
[0007]大量研究結(jié)果表明，當(dāng)植物受到干旱脅迫時(shí)，細(xì)胞迅速積累ABA。ABA被普遍認(rèn)為是一種干旱傳遞信號(hào)。在干旱信號(hào)ABA轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，從ABA的被感知到保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)生變化引起的氣孔關(guān)閉，以及ABA誘導(dǎo)的基因表達(dá)都經(jīng)歷了復(fù)雜的變化。氣孔關(guān)閉被認(rèn)為是植物應(yīng)答干旱脅迫最快速最直接的響應(yīng)之一，氣孔閉合的程度直接與植物在干旱脅迫下的失水能力相關(guān)。因此，可以通過(guò)研究干旱脅迫下氣孔關(guān)閉情況來(lái)判定植株的抗旱能力。一般干旱應(yīng)答基因能夠快速而短暫地被ABA誘導(dǎo)，例如AtRD22和AtRD29B，但并不是所有基因的表達(dá)都依賴于AtRD29A和AtERDl。這暗示了存在著依賴于ABA和不依賴于ABA的抗旱調(diào)節(jié)途徑。因此，可以通過(guò)檢測(cè)干旱脅迫下植物體內(nèi)的這些標(biāo)記基因的表達(dá)量來(lái)判定植物的抗旱調(diào)節(jié)途徑。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于，提供一個(gè)歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl，并證明了該基因在抗旱方面的功能，且初步探究了該基因的抗旱機(jī)制。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案:
[0010]一個(gè)歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl，其特征在于，其基因序列如下:
[0011]I ACGCGGGGACCCTAACCCTAAAGAGCAACAGCTCCAAGGAAGAACAACAAAGCGATATCT
[0012]61 ATGGCAGGAGTCGGACCGTTGACGCAGGACTGGGAACCGGTGGTGATCCGGAAGAAGCCT
[0013]121 CTGAACGCTGCCGCCAGGAAGGACGAGAAAGCTGTCAACGCTGCTCGTCGCAGCGGCGCC
[0014]181 GAGATCGAAACCCTTAGAAAATCTCATGCTGGGACAAACAAAGCTGCTTCTAGCAGCACC
[0015]241 TCTTTAAACACAAGGAAGCTTGATGAAGAAACGGAGAATCTTGCTCATGATCGAGTACCA
[0016]301 ACTGAGCTGAAGAAAAGTATCATGCAAGCTCGAATGGACAAGAAACTTACCCAGTCTCAA
[0017]361 CTTGCTCAGATGATCAATGAGAAACCTCAAATAATTCAAGAGTATGAATCTGGTAAAGCT
[0018]421 ATTCCAAATCAACAGATAATTGTCAAGTTGGAGAGGGCTCTTGGAGTGAAACTTCGAGGA
[0019]481 AAGAAATAATGAAACCATGGTGGACACAACAGAGGACAAAAATTGTTTGGAAGTCATCAT
[0020]54I GTTTGGAAGTCTTGTTATATAGTCTGTGTTGTGAAGGGTTGAAGAGGAGTTTGTCGTATG[0021 ] 601 GAACAACTTAGGTGTGTCTTGTTGCCCTGAAAAAATGAAACCTGTGTGCATTTCTAGTCA
[0022]66I TTTACTGTCTCATGAGTCCGTCTGCTTTATGAATTAACCCTATACTATTCAATAATGATG
[0023]721 TGGGGGTTGCTTCACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
[0024]本發(fā)明首次構(gòu)建了 pCAMBIA2300-35S-VvMBFl過(guò)量表達(dá)載體，并通過(guò)花序浸染法將其導(dǎo)入模式植物擬南芥。研究了該歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照在滲透脅迫，干旱脅迫和失水處理?xiàng)l件下的生長(zhǎng)情況。
[0025]通過(guò) 申請(qǐng)人:的研究表明，本發(fā)明的歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl能明顯提高擬南芥對(duì)于滲透脅迫，干旱脅迫和失水處理的耐受力。此外，在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系中的電解質(zhì)滲漏率(EL)，丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)的積累明顯低于野生對(duì)照，而脯氨酸(PiOline)含量明顯高于野生對(duì)照。氣孔研究表明，轉(zhuǎn)基因株系對(duì)ABA處理比野生對(duì)照更敏感?？购祷蚨糠治鼋Y(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系中依賴于ABA途徑的抗旱基因AtRD22和AtRD29B的表達(dá)量明顯高于野生對(duì)照。以上結(jié)果表明歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的過(guò)量表達(dá)通過(guò)依賴于ABA的抗旱途徑提高了植株的抗旱能力。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是甘露醇引起的滲透脅迫對(duì)野生對(duì)照(WT)和轉(zhuǎn)基因株系VvMBFl-7，VvMBF1-20和VvMBFl-21萌發(fā)的影響。其中，A圖是擬南芥種子在對(duì)照MS培養(yǎng)基和處理MS+300mM甘露醇(Mannitol)培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況。B圖是對(duì)應(yīng)A圖的擬南芥種子萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì)情況。
[0027]圖2是野生對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系VvMBFl-7，VvMBF1-20和VvMBFl_21盆栽苗對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)。其中，A圖是擬南芥植株在干旱前，干旱7天后以及復(fù)水24小時(shí)后的生長(zhǎng)情況。B圖是對(duì)應(yīng)A圖的擬南芥植株復(fù)水后的存活率的統(tǒng)計(jì)。
[0028]圖3是野生對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系VvMBFl-7，VvMBF1-20和VvMBFl_21盆栽苗在失水處理后各生理指標(biāo)的變化。其中，A圖是擬南芥植株離體葉片在50min內(nèi)的失水情況。50min內(nèi)，每隔IOmin稱取一次鮮重，失水率由兩次時(shí)間的鮮重差與最初鮮重的比值計(jì)算。B圖是甘露醇引起的滲透脅迫對(duì)擬南芥體內(nèi)ABA含量的測(cè)定。C圖是失水處理50min時(shí)，擬南芥離體葉片的電導(dǎo)率(EL)的測(cè)定。D圖是失水處理50min時(shí)，擬南芥離體葉片的脯氨酸(Proline)含量的測(cè)定。E圖是失水處理50min時(shí)，擬南芥離體葉片的丙二醛(MDA)含量的測(cè)定。F圖是失水處理50min時(shí)，擬南芥離體葉片的活性氧(ROS)積累的染色圖。
[0029]圖4是野生對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系VvMBFl-7，VvMBF1-20和VvMBFl_21在ABA處理后氣孔關(guān)閉的情況。其中，A圖是不同濃度下擬南芥植株氣孔的關(guān)閉情況。B圖是對(duì)應(yīng)A圖的氣孔開度(寬/長(zhǎng))的統(tǒng)計(jì)。
[0030]圖5是干旱相關(guān)基因在野生對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系VvMBFl-7，VvMBFl-20和VvMBFl-21中的表達(dá)。在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7天的幼苗轉(zhuǎn)移至MS+300mM甘露醇(Mannitol)培養(yǎng)基，采取培養(yǎng)7天后的幼苗，提RNA并反轉(zhuǎn)錄后利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定脅迫基因表達(dá)量。
[0031]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
【具體實(shí)施方式】
[0032]基于已有的植物中MBFl功能的研究， 申請(qǐng)人:首次對(duì)葡萄MBFl基因進(jìn)行克隆并對(duì)其進(jìn)行功能分析。在研究中， 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)在對(duì)巨峰葡萄進(jìn)行干旱脅迫以及外源ABA處理時(shí)，VvMBFl基因上調(diào)表達(dá)。由于ABA是植物響應(yīng)干旱途徑中一種重要的信號(hào)物質(zhì)，初步推測(cè)VvMBFl基因可能與ABA調(diào)節(jié)的抗旱信號(hào)途徑有關(guān)。
[0033] 申請(qǐng)人:利用RACE克隆技術(shù)，根據(jù)VvMBFl差異cDNA片段(登錄號(hào)FG.269343)的部分序列設(shè)計(jì)5’和3’基因特異性引物,米用反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction, RT-PC R),以巨峰葡萄葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈為模板，首次擴(kuò)增得到了歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl，該基因序列全長(zhǎng)767bp，包含完整開放閱讀框序列429bp，編碼142個(gè)氨基酸。與其它植物中MBFls的氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析表明，VvMBFl屬于植物組中的第I組。
[0034]為了進(jìn)一步研究歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl在植物中的抗旱機(jī)制， 申請(qǐng)人:構(gòu)建了 pCAMBIA2300-35S-VvMBFl過(guò)量表達(dá)載體，將其在野生擬南芥中過(guò)量表達(dá)。發(fā)現(xiàn)該歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系在滲透脅迫培養(yǎng)基上的種子萌發(fā)率顯著高于野生對(duì)照。干旱處理擬南芥盆栽苗復(fù)水后發(fā)現(xiàn)，歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系存活率顯著高于野生對(duì)照。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系離體葉片失水率明顯低于野生對(duì)照，且轉(zhuǎn)基因株系離體葉片失水處理后的電解質(zhì)滲漏率(EU、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)的積累都明顯低于野生對(duì)照，而脯氨酸含量則明顯高于與野生對(duì)照。以上結(jié)果表明，歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的過(guò)量表達(dá)可能通過(guò)參與ROS的清除和滲透物質(zhì)的合成過(guò)程來(lái)增強(qiáng)植株的抗旱能力。但是，作為響應(yīng)干旱途徑主要的信號(hào)物質(zhì)的ABA，干旱處理后雖然其含量均增加，但轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照間并沒有明顯差異，表明歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl可能不參與干旱脅迫下植株體內(nèi)ABA的合成過(guò)程。
[0035]以下是歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的全長(zhǎng)序列以及驗(yàn)證其抗旱功能的具體步驟。
[0036]A、利用RACE克隆技術(shù)，根據(jù)VvMBFl差異cDNA片段(登錄號(hào)FG.269343)的部分序列設(shè)計(jì)5’和3’基因特異性引物，米用反轉(zhuǎn)錄PCR (ReverseTranscription-PolymeraseChain Reaction, RT-PCR)，以巨峰葡萄葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增得到了巨峰葡萄抗旱基因VvMBFl序列，該基因序列如下:
[0037]I ACGCGGGGACCCTAACCCTAAAGAGCAACAGCTCCAAGGAAGAACAACAAAGCGATATCT
[0038]6I ATGGCAGGAGTCGGACCGTTGACGCAGGACTGGGAACCGGTGGTGATCCGGAAGAAGCCT
[0039]I2I CTGAACGCTGCCGCCAGGAAGGACGAGAAAGCTGTCAACGCTGCTCGTCGCAGCGGCGCC
[0040]181 GAGATCGAAACCCTTAGAAAATCTCATGCTGGGACAAACAAAGCTGCTTCTAGCAGCACC[0041 ] 241 TCTTTAAACACAAGGAAGCTTGATGAAGAAACGGAGAATCTTGCTCATGATCGAGTACCA
[0042]30I ACTGAGCTGAA·GAAAAGTATCATGCAAGCTCGAATGGACAAGAAACTTACCCAGTCTCAA
[0043]36I CTTGCTCAGATGATCAATGAGAAACCTCAAATAATTCAAGAGTATGAATCTGGTAAAGCT
[0044]42I ATTCCAAATCAACAGATAATTGTCAAGTTGGAGAGGGCTCTTGGAGTGAAACTTCGAGGA
[0045]481 AAGAAATAA TGAAACCATGGTGGACACAACAGAGGACAAAAATTGTTTGGAAGTCATCAT
[0046]54I GTTTGGAAGTCTTGTTATATAGTCTGTGTTGTGAAGGGTTGAAGAGGAGTTTGTCGTATG
[0047]60I GAACAACTTAGGTGTGTCTTGTTGCCCTGAAAAAATGAAACCTGTGTGCATTTCTAGTCA
[0048]66I TTTACTGTCTCATGAGTCCGTCTGCTTTATGAATTAACCCTATACTATTCAATAATGATG
[0049]721 TGGGGGTTGCTTCACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
[0050]B、將上述歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl序列的完整開放閱讀框插入CaMV35S啟動(dòng)子下游，構(gòu)建了植株過(guò)量表達(dá)載體并將其通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將其導(dǎo)入野生型擬南芥哥倫比亞Col。篩選獲得了表現(xiàn)型良好的三個(gè)VvMBFl轉(zhuǎn)基因株系(VvMBF1-7、VvMBF1-20、VvMBF1-21)。
[0051]C、鑒定了歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的轉(zhuǎn)基因株系能明顯提高擬南芥對(duì)滲透脅迫、干旱脅迫和失水處理的耐受力。此外，在失水處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系葉片的電解質(zhì)滲漏率(EL)、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)的積累都明顯低于野生對(duì)照，而脯氨酸含量則明顯高于與野生對(duì)照。干旱處理后的轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照植株體內(nèi)的ABA含量均增加，但轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照間并沒有明顯差異。
[0052]D、觀察了 VvMBFl轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照在不同濃度的ABA處理的條件下，葉片氣孔關(guān)閉的情況。發(fā)現(xiàn)相同濃度ABA處理下，轉(zhuǎn)基因株系的閉合程度明顯大于野生對(duì)照。
[0053]E、為進(jìn)一步在基因水平探究轉(zhuǎn)基因株系抗旱的機(jī)制， 申請(qǐng)人:利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了干旱應(yīng)答途徑中幾個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系中依賴于ABA途徑的抗旱基因AtRD22和AtRD29B的表達(dá)量明顯高于野生對(duì)照。
[0054]以上結(jié)果表明，歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)提高了植株的抗旱能力，可能是通過(guò)依賴于ABA的途徑。
[0055]以下是 申請(qǐng)人:給出的具體實(shí)施例。
[0056]實(shí)施例1:過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照在滲透脅迫下的萌發(fā)情況
[0057]三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(VvMBFl-7、VvMBF1-20, VvMBFl-21)和野生對(duì)照(WT)在MS培養(yǎng)基和含有300mM甘露醇的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2周后，統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照的萌芽率均能達(dá)到100%，而在含有300mM甘露醇的培養(yǎng)基上，三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率均可以達(dá)到90%左右，而野生對(duì)照(WT)的萌發(fā)率只有37.45% (圖
1)，明顯低于轉(zhuǎn)基因株系。
[0058]實(shí)施例2:歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代幼苗對(duì)干旱脅迫的抗性
[0059]為了進(jìn)一步鑒定歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的轉(zhuǎn)基因株系(VvMBFl-7、VvMBF1-20, VvMBF1-21)的抗旱能力，將生長(zhǎng)10天的盆栽轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照的幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理。干旱第7天發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照出現(xiàn)明顯的形態(tài)上的區(qū)別，具體表現(xiàn)在野生對(duì)照表現(xiàn)出了明顯的萎蔫枯死，而三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系雖然也表現(xiàn)出了失水癥狀，但比野生對(duì)照要輕。復(fù)水24小時(shí)后，大部分轉(zhuǎn)基因株系復(fù)活(三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的存活率分別達(dá)到77.25%,47.72%和84.14%)，而野生對(duì)照幾乎全部死亡(存活率僅有8.47%)(圖2)。
[0060]實(shí)施例3:歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱脅迫下各生理指標(biāo)的變化
[0061]為了探究VvMBFl 轉(zhuǎn)基因株系(VvMBF 1-7、VvMBF1-20, VvMBF1-21)的抗旱機(jī)制， 申請(qǐng)人:測(cè)定了干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照的各種生理指標(biāo)的變化。首先，測(cè)定了擬南芥植株離體葉片在50min內(nèi)的失水情況。50min內(nèi)，轉(zhuǎn)基因株系在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的失水率均低于野生對(duì)照。在50min時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系(VvMBFl-7、VvMBFl-20、VvMBFl-21)的失水率分別為46.78%,48.45%和45.83%，而野生對(duì)照失水率達(dá)到了 53.43%(圖3A)，明顯高于轉(zhuǎn)基因株系。此外，對(duì)失水50min的離體葉片進(jìn)行了電解質(zhì)滲漏率(EU、脯氨酸(Proline)、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)的含量測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系(VvMBFl-7、VvMBF1-20, VvMBF1-21)的電解質(zhì)滲漏率(EL)分別為36.85%,32.15%和29.07%，野生對(duì)照達(dá)到了 47.98% (圖3C)，顯著高于轉(zhuǎn)基因株系。丙二醛含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系(VvMBFl-7、VvMBF1-20,VvMBF1-21)的 MDA 含量分別為 13.38、13.18 和 14.79n mol/g，而野生對(duì)照達(dá)到了 20.44ηmol/g(圖3E)，顯著高于轉(zhuǎn)基因株系?；钚匝醯目梢曅苑治鼋Y(jié)果顯示，氯化硝基四氮唑藍(lán)液(NBT)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(分別指示02-和H202的含量)染色后的三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系都呈現(xiàn)較淺的顏色，而野生對(duì)照染色較重(圖3F)，表明轉(zhuǎn)基因株系活性氧的積累較少。脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系(VVMBFl-7、VvMBFl-20、VvMBFl-21)的含量分別為4.54ug/g>4.79ug/g和5.21ug/g,而野生對(duì)照和含量?jī)H為2.53ug/g (圖3D),顯著低于轉(zhuǎn)基因株系。這些結(jié)果說(shuō)明 。巨峰葡萄抗旱基因VvMBFl的過(guò)量表達(dá)通過(guò)減少細(xì)胞膜的損害、清楚活性氧的積累以及提高滲透物質(zhì)這些過(guò)程增強(qiáng)了植株的抗旱能力。而甘露醇引起的滲透脅迫對(duì)擬南芥體內(nèi)ABA含量的測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因和野生對(duì)照的含量雖然均比對(duì)照處理的高，但轉(zhuǎn)基因和野生對(duì)照之間無(wú)顯著差異(圖3B)，表明巨峰葡萄抗旱基因VvMBFl的過(guò)量表達(dá)不參與干旱條件下植株體內(nèi)ABA的合成過(guò)程。
[0062]實(shí)施例4:歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的轉(zhuǎn)基因株系擬南芥在ABA處理下氣孔開度的變化
[0063]信號(hào)物質(zhì)ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉被認(rèn)為是植物應(yīng)答干旱脅迫最快速最直接的響應(yīng)之一。本研究也發(fā)現(xiàn)由甘露醇引起的滲透脅迫(模擬干旱脅迫)均提高了轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照植株體內(nèi)ABA的含量，因此 申請(qǐng)人:進(jìn)一步用外源ABA處理轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照，研究歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl在ABA誘導(dǎo)的氣孔反應(yīng)中的作用。分別用IyM和5 μ M的外源ABA處理轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照的葉片下表皮，然后在顯微鏡下觀察氣孔的關(guān)閉情況。結(jié)果顯示，在相同濃度的外源ABA處理后的三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的氣孔開度(寬/長(zhǎng))均比野生對(duì)照小(圖4)。表明歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的過(guò)量表達(dá)可能通過(guò)參與氣孔關(guān)閉來(lái)增強(qiáng)了植株的抗旱能力。
[0064]實(shí)施例5:干旱相關(guān)基因在野生對(duì)照和歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的轉(zhuǎn)基因株系擬南芥中的表達(dá)
[0065]植物經(jīng)歷干旱脅迫時(shí)，ABA被普遍認(rèn)為是一種干旱傳遞信號(hào)。一般干旱應(yīng)答基因能夠快速而短暫地被ABA誘導(dǎo)，例如AtRD22和AtRD29B，但并不是所有基因的表達(dá)都依賴于ABA,例如AtRD29A和AtERDl。這暗示了存在著依賴于ABA和不依賴于ABA的抗旱調(diào)節(jié)途徑。為進(jìn)一步探究歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl在分子水平的作用機(jī)制，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了四個(gè)功能明確的干旱響應(yīng)基因AtRD22、AtRD29B、AtRD29A和AtERDl在轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照中的表達(dá)量。其中AtRD22和AtRD29B是依賴于ABA的干旱途徑中的標(biāo)記基因，而AtRD29A和AtERDl則是不依賴于ABA的干旱途徑中的標(biāo)記基因。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因 株系中AtRD22和AtRD29B的表達(dá)量明顯高于野生對(duì)照，而AtRD29A和AtERDl的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因株系和野生對(duì)照中則沒有明顯的變化(圖5)。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果表明，歐美雜交種葡萄巨峰抗旱基因VvMBFl的過(guò)量表達(dá)提高了 AtRD22和AtRD29B的表達(dá)量，可能通過(guò)參與依賴于ABA的干旱途徑來(lái)增強(qiáng)了植株的抗旱能力。
【權(quán)利要求】
1.歐美雜交種葡萄巨峰抗旱VvMBFl基因，其特征在于，該基因序列是:
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK103849627SQ201410035773
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】王西平, 閆琴 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)