人皰疹病毒ebv和vzv檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒，由定量PCR反應液、EBV標準品、VZV標準品、EBV陽性對照品、VZV陽性對照品、陰性對照品、說明書和盒體組成，其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、EBV上游擴增引物、EBV下游擴增引物、VZV上游擴增引物、VZV下游擴增引物、EBV熒光探針和VZV熒光探針。本發(fā)明試劑盒采用實時熒光定量PCR技術和雙色熒光探針，能一步法檢測人皰疹病毒EBV和VZV，實現(xiàn)了EBV和VZV感染的同步診斷，對陽性病毒能實時準確定量，可滿足臨床早期、準確診斷EBV和VZV感染的迫切需要，為EBV和VZV感染的及時針對性治療提供依據(jù)。
【專利說明】人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術領域】，涉及熒光定量PCR檢測試劑盒，具體涉及一種雙探針實時熒光定量PCR同時檢測患者血液、尿液、腦脊液等樣本中愛潑斯坦一馬爾病毒(Epstein-Barr virus, EBV)和水痘一帶狀皰疫病毒(varicella-zoster virus, VZV)的診斷試劑盒。
【背景技術】
[0002]EBV和VZV是引起兒童病毒性腦炎的常見人皰疹病毒。EBV侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，可導致腦水腫、出血、免疫復合物沉積、腦組織脫髓鞘樣改變等，臨床可表現(xiàn)為急性起病或慢性活動性損害。急性EBV腦炎多為病毒直接侵入神經(jīng)系統(tǒng)，如腦膜、腦組織和脊髓、外周神經(jīng)多個部位的神經(jīng)軸索；慢性EBV腦炎則與自身免疫反應有關，為免疫復合物的沉積、感染后炎性反應造成的腦組織脫髓鞘樣改變。VZV初次感染引起水痘，主要發(fā)生于兒童；水痘痊愈后病毒潛伏于神經(jīng)節(jié)細胞，再激活引起帶狀皰疹。VZV腦炎常發(fā)生于出疹后I周內，其發(fā)病機制可能為病毒直接侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也可能為免疫反應損傷所致。此外，還有同時感染EBV和VZV繼發(fā)病毒性腦炎的病例報道，兩種病毒間可能存在相互促進激活的情況。
[0003]EBV和VZV感染的早期診斷和及時抗病毒治療對可明顯改善預后，降低病死率。因EBV和VZV感染的臨床表現(xiàn)多樣，且與其他皰疹病毒相比臨床癥狀和體征多無特異性，因此早期診斷和及時治療需依賴實驗室檢測。傳統(tǒng)的EBV和VZV檢測方法主要包括病毒分離培養(yǎng)和血清學檢測，前者曾為皰疹病毒的診斷“金標準”，但存在需時長(3-30天)、敏感性低(尤其在抗病毒藥物治療后)、分型困難等缺陷；后者又分為抗原直接檢測法和抗體間接檢測法，抗原直接檢測法由于某些病毒不產(chǎn)生可檢測的抗原而導致敏感性低，抗體間接檢測法由于皰疹病毒感染后需I周左右才產(chǎn)生有效濃度的抗體而無法進行早期診斷，且不同皰疹病毒間存在交叉反應，抗體特異性不高。
[0004]隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)技術，特別是近幾年興起的實時熒光定量PCR技術為病原微生物的檢測提供了新方向。實時熒光定量PCR技術的基本原理是利用Taq酶的5’_3’外切酶核酸活性，在普通PCR基礎上設計熒光雙標記探針，兩端分別標記熒光報告基團(R)和淬滅基團(Q);探針保持完整時R基團的熒光信號被Q基團抑制，一旦探針被切斷，Q基團的抑制作用消失，R基團的熒光信號就可被檢測到。該技術通過對熒光信號的檢測實現(xiàn)對PCR過程中產(chǎn)物量的實時監(jiān)測，并可精確計算初始模板量，除具有定量準確、檢測快速等優(yōu)點外，最大的優(yōu)勢是采用完全閉管檢測，省去了對PCR產(chǎn)物的后處理，避免了交叉污染。
[0005]目前的實時熒光定量PCR技術隨著材料和儀器的進一步發(fā)展，通過在熒光探針的5’端標記不同的熒光染料(FAM、HEX、R0X等)及多通道熒光定量PCR儀，可以實現(xiàn)基因分型、基因突變檢測、SNP分析等研究。本發(fā)明基于上述技術背景，設計針對EBV和VZV的特異性探針，開發(fā)能一步法同時檢測和定量EBV和VZV的熒光定量PCR試劑盒，旨在滿足臨床EBV和VZV感染早期、快速診斷的需求，為臨床及時進行針對性治療提供依據(jù)。
【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明提供一種人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒，是一種實時熒光定量PCR檢測試劑盒，由定量PCR反應液、EBV標準品、VZV標準品、EBV陽性對照品、VZV陽性對照品、陰性對照品、說明書和盒體組成，其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs、耐熱DNA聚合酶、EBV上游擴增引物、EBV下游擴增引物、VZV上游擴增引物、VZV下游擴增引物、EBV熒光探針和VZV熒光探針。
[0007]PCR擴增弓丨物序列為:
EBV 上游擴增引物序列(SEQ ID No:1):5’ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3’ ；
EBV 下游擴增引物序列(SEQ ID No:2):5，-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’ ；
VZV 上游擴增引物序列(SEQ ID No:3):5’ -TAGGCGGATGGTGGACGACT-3’ ；
VZV 下游擴增引物序列(SEQ ID No:4):5，-GCCCGCAAACTTGTAGAACTG-3，。
[0008]EBV 熒光探針序列(SEQ ID No:5):5’ FAM-GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’ ；
VZV 熒光探針序列(SEQ ID No:6):5’ HEX-TTGTTATGACGGCCGAGCT-BHQ-1-3’ ；
EBV 標準品序列(SEQ ID No:7):GAGCTCCACC CCCTTCATCA GGGTCTTGCC GTCCGTCAGCACCCCCACAT ATCTCTTCTT TGTAATCAGC ATCAGGCAGG AGAAGGTCTT CTCGGCCTCC AGGGAGATGGGGGCCACAAA CAGGCTCCGG GTGGTGTGGG CGGCCAGGGC CTCGGCAAAG CGCAGGGTCT CGCTCTCTGAAAACCCCCGG CACTCGATAA ACAGCGAGTC CGTGTCCCCG TAGATGA ；
VZV 標準品序列(SEQ ID No:8·):TAGGCGGATG GTGGACGACT AAGCTCGGCC GTCATAACAAACTTATTAAT ATCCAATTTG GGTGATGTAA TCTGGCGATG TGCATCTGCA ATTATGCGTCCAAACCCGGCCATCCCAGAC GGCATGGCCC GTCTATTCCA TTCAGCAATG GAAACACACG ACGCCTCCGCCGCAGCACGC GAGACGGTGT CGTCATATAA CAACAGTTCT ACAAGTTTGC GGGC。
[0009]EBV陽性對照和VZV陽性對照分別為EBV和VZV滅活病毒株樣品，陰性對照為無菌注射用水樣品。
[0010]本發(fā)明試劑盒應保存于-20°C，盡量減少反復凍融。
[0011]本發(fā)明試劑盒使用方法:
每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照，標準品用無菌去離子水稀釋為IXlO4 -1X IO7拷貝。
[0012]病毒DNA的提取:嚴格按照商品化的QIAamp DNA抽提試劑盒操作，從臨床標本或病毒分離培養(yǎng)物中提取病毒DNA。
[0013]PCR擴增檢測:在雙色(或以上)熒光定量PCR儀上進行，每個PCR反應體系總體積為25 μL,其中包括20 μL PCR反應液和5 μL模板(提取的病毒DNA、標準品、陽性或陰性對照)。探針檢測模式為:FAM、HEX通道分別用于檢測EBV、VZV0 PCR反應條件:94°C 5分鐘預變性，94°C 20秒一60°C 60秒，共40個循環(huán)。設置完成后，保存文件，運行程序。
[0014]熒光定量結果報告:①檢測樣品的擴增曲線無對數(shù)增長期或雙探針CT(threshold cycle)值均> 40為陰性；②檢測樣品某一探針CT值< 38且擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，則該探針對應的病毒為陽性；同一反應體系中兩個探針CT值<38且擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，則為EBV和VZV混合陽性；③檢測樣品某一探針38 < CT值< 40，需對樣品重新進行DNA提取和PCR檢測。[0015]本發(fā)明采用實時熒光定量PCR技術和雙色熒光探針，開發(fā)研制了用于EBV和VZV定量檢測的試劑盒。該發(fā)明試劑盒能一步法檢測人皰疹病毒EBV和VZV，不僅實現(xiàn)了 EBV和VZV感染的同步診斷，而且對陽性病毒能進行實時準確定量，可滿足臨床早期、準確診斷EBV和VZV感染的迫切需要，為EBV和VZV感染的及時針對性治療提供依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明試劑盒的結構示意圖。
[0017]圖2為EBV和VZV濃度梯度標準品的標準曲線。
【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明結合實施例和附圖作進一步說明。應該理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0019]實施例1
參見圖1，本發(fā)明提供的人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒，由定量PCR反應液1、EBV標準品2、VZV標準品3、EBV陽性對照品4、VZV陽性對照品5、陰性對照品6、說明書7和盒體8組成。
[0020]其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、EBV上游擴增引物、EBV下游擴增引物、VZV上游擴增引物、VZV下游擴增引物、EBV熒光探針和VZV熒光探針。
[0021 ] PCR擴增弓丨物序列為:
EBV 上游擴增引物序列(SEQ ID No:1):5’ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3’ ；
EBV 下游擴增引物序列(SEQ ID No:2):5，-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’ ；
VZV 上游擴增引物序列(SEQ ID No:3):5’ -TAGGCGGATGGTGGACGACT-3’ ；
VZV 下游擴增引物序列(SEQ ID No:4):5，-GCCCGCAAACTTGTAGAACTG-3，。
[0022]EBV 熒光探針序列(SEQ ID No:5):5’ FAM-GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’ ；
VZV 熒光探針序列(SEQ ID No:6):5’ HEX-TTGTTATGACGGCCGAGCT-BHQ-1-3’ ；
EBV 標準品序列(SEQ ID No:7):GAGCTCCACC CCCTTCATCA GGGTCTTGCC GTCCGTCAGCACCCCCACAT ATCTCTTCTT TGTAATCAGC ATCAGGCAGG AGAAGGTCTT CTCGGCCTCC AGGGAGATGGGGGCCACAAA CAGGCTCCGG GTGGTGTGGG CGGCCAGGGC CTCGGCAAAG CGCAGGGTCT CGCTCTCTGAAAACCCCCGG CACTCGATAA ACAGCGAGTC CGTGTCCCCG TAGATGA ；
VZV 標準品序列(SEQ ID No:8):TAGGCGGATG GTGGACGACT AAGCTCGGCC GTCATAACAAACTTATTAAT ATCCAATTTG GGTGATGTAA TCTGGCGATG TGCATCTGCA ATTATGCGTCCAAACCCGGCCATCCCAGAC GGCATGGCCC GTCTATTCCA TTCAGCAATG GAAACACACG ACGCCTCCGCCGCAGCACGC GAGACGGTGT CGTCATATAA CAACAGTTCT ACAAGTTTGC GGGC。
[0023]EBV陽性對照I和VZV陽性對照2分別為EBV和VZV滅活病毒株樣品，陰性對照為無菌注射用 水樣品。
[0024]本發(fā)明試劑盒應保存于-20°C，盡量減少反復凍融。
[0025]實施例2人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒的敏感性和特異性試驗 (一)材料:選取病原微生物包括:實驗組:EBV (B95-8株)由北京病毒研究所提供，VZV (EF株)由安徽醫(yī)科大學微生物教研組提供；對照組:金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、乙型肝炎病毒、新型隱球菌、白色念珠菌和人類基因組由浙江大學附屬兒童醫(yī)院細菌室、病毒室和基因擴增室提供。
[0026](二)引物及探針的設計與合成:
對EBV和VZV的保守區(qū)序列進行生物信息學分析，設計并篩選PCR擴增引物和特異性熒光探針，委托上海生工生物公司合成。
[0027]EBV 上游擴增引物序列(SEQ ID No:1):5’ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3’ ；
EBV 下游擴增引物序列(SEQ ID No:2):5，-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’ ；
VZV 上游擴增引物序列(SEQ ID No:3):5’ -TAGGCGGATGGTGGACGACT-3’ ；
VZV 下游擴增引物序列(SEQ ID No:4):5，-GCCCGCAAACTTGTAGAACTG-3，。
[0028]EBV 熒光探針序列(SEQ ID No:5):5’ FAM-GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’ ；
VZV 熒光探針序列(SEQ ID No:6):5’HEX-TTGTTATGACGGCCGAGCT-BHQ-1-3’。(三)檢
測標準品的制備:
用EBV上游擴增引物和EBV下游擴增引物擴增EBV病毒株，用VZV上游擴增引物和VZV下游擴增引物擴增VZV病毒株，各擴增片段純化后插入pGEM-T-Easy克隆載體構建重組質粒，用分光光度計對各質粒進行定量，并用無菌去離子水以10倍比稀釋各質粒進行熒光定量PCR敏感性試驗。
[0029](四)試劑盒的敏感性和特異性試驗:
采用人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒對上述常見病原微生物進行檢測,實驗組兩種病毒檢測結果均為陽性且分型符合，對照組金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、乙型肝炎病毒、新型隱球菌、白色念珠菌和人類基因組等檢測結果均為陰性，特異性為100%。構建的重組質粒標準品倍比稀釋后檢測敏感性可達10拷貝；用IO4UO5UO6UO7四個定量的濃度梯度標準品作標準曲線，其CT值與質?？截悢?shù)之間具有良好的線性關系(圖2)。
[0030]本發(fā)明是結合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內容后，本領域技術人員可對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限度的范圍。
【權利要求】
1.一種人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒，其特征在于，由定量PCR反應液(I),EBV標準品(2 )、VZV標準品(3 )、EBV陽性對照品(4 )、VZV陽性對照品(5 )、陰性對照品(6 )、說明書(7 )和盒體(8 )組成，其中:PCR反應液(I)含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、EBV上游擴增引物、EBV下游擴增引物、VZV上游擴增引物、VZV下游擴增引物、EBV熒光探針和VZV熒光探針； EBV 上游擴增引物序列:5’ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3’ ； EBV 下游擴增引物序列:5，-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’ ； VZV 上游擴增引物序列:5’ -TAGGCGGATGGTGGACGACT-3’ ； VZV 下游擴增引物序列:5’ -GCCCGCAAACTTGTAGAACTG-3’ ； EBV 熒光探針序列:5’ FAM-GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’ ； VZV 熒光探針序列:5’ HEX-TTGTTATGACGGCCGAGCT-BHQ-1-3’ ； EBV 標準品序列:GAGCTCCACC CCCTTCATCA GGGTCTTGCC GTCCGTCAGC ACCCCCACATATCTCTTCTT TGTAATCAGC ATCAGGCAGG AGAAGGTCTT CTCGGCCTCC AGGGAGATGG GGGCCACAAACAGGCTCCGG GTGGTGTGGG CGGCCAGGGC CTCGGCAAAG CGCAGGGTCT CGCTCTCTGA AAACCCCCGGCACTCGATAA ACAGCGAGTC CGTGTCCCCG TAGATGA ； VZV 標準品序列:TAGGCGGATG GTGGACGACT AAGCTCGGCC GTCATAACAA ACTTATTAATATCCAATTTG GGTGATGTAA TCTGGCGATG TGCATCTGCA ATTATGCGTC CAAACCCGGCCATCCCAGACGGCATGGCCC GTCTATTC`CA TTCAGCAATG GAAACACACG ACGCCTCCGC CGCAGCACGC GAGACGGTGTCGTCATATAA CAACAGTTCT ACAAGTTTGC GGGC。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒，其特征在于，EBV陽性對照和VZV陽性對照分別為EBV和VZV滅活病毒株樣品，陰性對照為無菌注射用水樣品。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒，其特征在于，本發(fā)明試劑盒保存于-20°C，減少反復凍融。
【文檔編號】C12Q1/70GK103866046SQ201410028810
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權日:2014年1月21日
【發(fā)明者】陶然, 尚世強, 舒強, 杜立中, 李偉 申請人:浙江大學