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建立iPS的方法

文檔序號(hào):467955閱讀:2450來源:國知局
建立iPS的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種建立iPS的方法,該方法包括如下步驟:利用ficoll分離外周血單核細(xì)胞,紅系培養(yǎng)方法培養(yǎng)8天,將episomal的三個(gè)質(zhì)粒用lonza的Human?CD34+Cell?Kit電轉(zhuǎn)到單核細(xì)胞中,之后用vitrinectin處理的板子上培養(yǎng),利用E6培養(yǎng)基培養(yǎng)12-15天后會(huì)看到克隆,20天左右將單克隆調(diào)到用vitrinectin處理的板子上用E8培養(yǎng)基培養(yǎng),傳代到10后鑒定。本發(fā)明建立在無插入的episomal技術(shù)上,無FBS,無feeder甚至是無動(dòng)物源的iPS誘導(dǎo)和培養(yǎng)技術(shù)。
【專利說明】建立iPS的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種建立iPS細(xì)胞的方法,特別涉及一種在無插入的基礎(chǔ)上建立了無FBS,無Feeder無動(dòng)物源的人iPS的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2006年,日本科學(xué)家Yamanaka的研究組將4種轉(zhuǎn)錄因子(0ct4/Sox2/Klf4/c-Myc)導(dǎo)入小鼠皮膚成纖維細(xì)胞,獲得了類似于胚胎干細(xì)胞的多能性干細(xì)胞,稱之為“誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞”(induced pluripotent stem cells, iPS 細(xì)胞)[1]。2007 年,Yamanaka 博士 [2]和美國Thomson博士研究組[3]分別用特定的因子誘導(dǎo)人類成纖維細(xì)胞,也使之成為了 iPS細(xì)胞。iPS細(xì)胞的分離培養(yǎng)成功是干細(xì)胞研究乃至生命科學(xué)領(lǐng)域的里程碑,它首次證明:可以用已知的幾種因子在體外逆轉(zhuǎn)已經(jīng)分化的細(xì)胞,使之成為全新的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞,這項(xiàng)技術(shù)避免了干細(xì)胞研究領(lǐng)域的免疫排斥和倫理道德問題。
[0003]盡管近年來iPS技術(shù)不斷取得發(fā)展,各種改良技術(shù)時(shí)有出現(xiàn)。然而重編程效率低下一直都是科學(xué)家們頭疼的問題,成為了 iPS臨床轉(zhuǎn)化的重要障礙之一。經(jīng)典的利用病毒為載體將轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入分化細(xì)胞的方法,很可能導(dǎo)致外源基因插入細(xì)胞的基因組中,引起插入突變,存在很大的弊端,iPS細(xì)胞的致瘤性影響其在再生醫(yī)學(xué)和臨床細(xì)胞治療中的應(yīng)用[4]。轉(zhuǎn)錄因子c-Myc本身就是一種原癌基因。解析體細(xì)胞重編程過程中的分子調(diào)控機(jī)制,開發(fā)出高效安全的iPS技術(shù)成為了近年來干細(xì)胞領(lǐng)域研究人員的熱點(diǎn)。
[0004]供體細(xì)胞類型影響iPS細(xì)胞的形成效率和安全性。2008年,Yamanaka博士的研究組嘗試?yán)眯∈笪负透蔚募?xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)由胃和肝細(xì)胞產(chǎn)生的iPS細(xì)胞的成瘤性明顯低于皮膚成纖維細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞[5]。采集皮膚細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞需要六七十天時(shí)間,而從血液采集細(xì)胞制備iPS細(xì)胞只需3周左右,而且人外周血細(xì)胞來源豐富,采集方法便利,創(chuàng)傷性小,安全性好。人外周血細(xì)胞是當(dāng)前最理想的供體細(xì)胞之一,具有安全、方便、數(shù)量多等優(yōu)勢(shì)[6]。
[0005]使用病毒載體轉(zhuǎn)染外源基因制備iPS細(xì)胞不僅操作過程復(fù)雜、對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和管理要求嚴(yán)格,而且細(xì)胞有可能引發(fā)腫瘤的形成,這就阻礙了 iPS細(xì)胞技術(shù)的普及和在臨床應(yīng)用的推廣。當(dāng)前應(yīng)用基因非整合方法建立iPS細(xì)胞主要有以下幾個(gè)方面I)腺病毒載體,2)質(zhì)粒或者minicircle DNA,3)蛋白直接導(dǎo)入,但是這三種方法重建效率均非常低,難以滿足基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)需要和臨床應(yīng)用研究。仙臺(tái)病毒m及改良mRNA方法M建立非整合iPS細(xì)胞的效率很高,但是費(fèi)用相當(dāng)高,不適用于大規(guī)模臨床治療的開展。Episomal Vectors是目前最高效最經(jīng)濟(jì)的基因非整合建立iPS細(xì)胞的方法[9]。
[0006]2013年5月張孝兵教授[1°]應(yīng)用改良的表達(dá)0ct4/Sox2/Klf4/c_Myc的EV成功地將人外周血單個(gè)核細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞,重編程效率顯著高于以往實(shí)驗(yàn)報(bào)導(dǎo)。
[0007]雖然我們利用印isomal技術(shù)可以獲得沒有外源基因插入的iPS技術(shù)。解決了因?yàn)橥庠椿虻牟迦?,誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定和成瘤性的危險(xiǎn),大大促進(jìn)了 iPS技術(shù)臨床應(yīng)用的可能性。但在體外培養(yǎng)細(xì)胞Feeder細(xì)胞以及處理板子的metrigel都是鼠源的和牛源的FBS,這些可能會(huì)造成免疫和異源病毒或蛋白造成的疾病的產(chǎn)生,增加疾病治療的風(fēng)險(xiǎn),而且增加了 IPS的使用成本,不適合廣泛的、大規(guī)模的臨床應(yīng)用,研究在無插入外源基因建立IPS的技術(shù)基礎(chǔ)上,無添加FBS'Feeder建立IPS的方法,具有重要的臨床價(jià)值。在發(fā)明中,我們?cè)跓o插入的基礎(chǔ)上建立了無FBS,無Feeder無動(dòng)物源的iPS建立技術(shù)。使iPS技術(shù)更符合臨床應(yīng)用的需求。
[0008][I] Takahashi K,Yamanaka S.1nduction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell.2006; 126:663—76.[0009][2]Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.1nduction of pluripotent stemcells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell.2007;131:861—72.[0010][3] Yu Jj Vodyanik MAj Smuga—Otto K,et al.1nduced pluripotent stem celllines derived from human somatic cells.Science.2007;318:1917—20.[0011][4]Okita Kj Yamakawa T,Matsumura Y,et al.An efficient nonviral method togenerate integration-free human-1nduced pluripotent stem cells from cord bloodand peripheral blood cells.Stem Cells.2013;31:458—66.[0012][5]Aoi T,Yae Kj Nakagawa M,et al.Generation of pluripotent stem cellsfrom adult mouse liver and stomach cells.Science.2008;321:699-702.[0013][6] Loh YHj Agarwal S,Park IHj et al.Generation of induced pluripotentstem cells from human blood.Blood.2009;113:5476—9.[0014][7]Seki T,Yuasa S,F(xiàn)ukuda K.Generation of induced pluripotent stem cellsfrom a small amount of human peripheral blood using a combination of activatedT cells and Sendai virus.Nat Protoc.2012;7:718-28.[0015][8] Lin T,Ambasudhan R,Yuan X,et al.A chemical platform for improvedinduction of human iPSCs.Nat Methods.2009;6:805-8.[0016][9] Yu J,Hu K,Smuga—Otto K,et al.Human induced pluripotent stem cellsfree of vector and transgene sequences.Science.2009;324:797-801.[0017][10] Su RJj Bay I ink DJ,Neises A,et al.Efficient Generation ofIntegration-Free iPS Cells from Human Adult Peripheral Blood Using BCL—XLTogether with Yamanaka Factors.PLoS One.2013;8:e64496.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種沒有基因插入,沒有FBS,沒有Feeder的利用外周血細(xì)胞建立人iPS的方法。
[0019]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0020]一種建立iPS的方法(沒有基因插入,沒有FBS,沒有Feeder的利用外周血細(xì)胞建立iPS的方法),包括如下步驟:
[0021]利用ficoll分離外周血單核細(xì)胞,紅系培養(yǎng)方法(無血清)培養(yǎng)8天,將episomal的三個(gè)質(zhì)粒:pEV SFFV-OS (OS), pEV SFFV-MK (MK), pEV SFFV-B (B)用 1nza 的Amaxa? HumanCD34+Cell Nucleofector? Kit電轉(zhuǎn)到單核細(xì)胞中,之后用vitrinectin (人源蛋白)處理的板子上培養(yǎng),利用E6培養(yǎng)基(invitrogen)培養(yǎng)12-15天后會(huì)看到克隆,20天左右將單克隆調(diào)到用vitrinectin處理的板子上用E8培養(yǎng)基(invitrogen)培養(yǎng),傳代到10后鑒定。
[0022]優(yōu)選的,所述的紅系培養(yǎng)方法所使用的紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在SFM的基礎(chǔ)上進(jìn)一步添加如下組分=SCF終濃度100ng/ml,IL-3終濃度10ng/ml,EPO終濃度2U/ml,IGF-1終濃度40ng/ml,地塞米松終濃度I μ Μ,轉(zhuǎn)鐵蛋白終濃度100 μ g/ml。
[0023]其中Serum free medium (SFM)組成為:
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種建立iPS的方法,其特征在于:包括如下步驟:利用ficoll分離外周血單核細(xì)胞,紅系培養(yǎng)方法(無血清)培養(yǎng)8天,將印isomal的三個(gè)質(zhì)粒:pEV SFFV-OS (OS),pEVSFFV-MK(MK), pEV SFFV-B(B)電轉(zhuǎn)到單核細(xì)胞中,之后用vitrinectin (人源蛋白)處理的板子上培養(yǎng),利用E6培養(yǎng)基培養(yǎng)12-15天后會(huì)看到克隆,20天左右將單克隆調(diào)到用vitrinectin處理的板子上用E8培養(yǎng)基培養(yǎng),傳代到10后鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立iPS的方法,其特征在于:所述的紅系培養(yǎng)方法所使用的紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在SFM的基礎(chǔ)上進(jìn)一步添加如下組分:SCF終濃度100ng/ml,IL-3終濃度10ng/ml,EPO終濃度2U/ml,IGF-1終濃度40ng/ml,地塞米松終濃度I μ Μ,轉(zhuǎn)鐵蛋白終濃度 100 μ g/mlo 其中 Serum free medium (SFM)組成為:
IMDM (Invitrogen, cat.n0.21056023)50%
Ham’ s F-12 (Mediatech, cat.n0.10-080-CV)50%Bovine serum albumin (BSA) (Sigma, A9418)5 mg/mlAscorbic acid (Sigma, cat, n0.A8960)50 ug/ml1-Thioglycerol, 98% (Sigma, cat.n0.M6145)200 U M
L-Glutamine (Invitrogen, cat.n0.21051024)100XITS-X (Invitrogen, cat.n0.51500-056)100X
synthetic lipids (Inv`itrogen, cat.n0.11905031) 100Xo
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述建立iPS的方法,其特征在于:包括如下步驟: 利用ficoll分離外周血單核細(xì)胞,紅系培養(yǎng)方法(無血清)培養(yǎng)8天,利用Amaxa細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀(Amaxa Nucleofector?)進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)染,單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)8天后,計(jì)數(shù),IxlO6細(xì)胞加入100 μ I配置好的電轉(zhuǎn)緩沖液(包含不同組合質(zhì)粒如5ug pEV SFFV-OS (OS)+2.5ugpEV SFFV-MK (MK) +2.5ug pEV SFFV-B (B)),混合均勻后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯,放到電轉(zhuǎn)槽內(nèi),利用U-008轉(zhuǎn)染程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)。將電轉(zhuǎn)后細(xì)胞種到預(yù)先人源蛋白處理的6孔板的一個(gè)孔中,應(yīng)用紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)I天,加等量的hESC培養(yǎng)基E6+bFGF100ng/ml培養(yǎng)I天后半數(shù)換液,只加hESC培養(yǎng)基E6+bFGF100ng/ml,之后隔一天完全換成hESC培養(yǎng)基E6+bFGF100ng/ml培養(yǎng)液,并隔天換液;在調(diào)單克隆之前在低氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng),所述的低氧培養(yǎng)條件為5%02,5%C02,90%N2 ; 并在培養(yǎng)基中加入0.25mM NaB提高重編程效率,第10天停止,第12-15天開始可見克隆開始形成,第20天左右克隆逐漸成熟,通過機(jī)械傳代方法,在顯微鏡下分離克隆,切成3,4塊后吸出,轉(zhuǎn)入hESC培養(yǎng)基E8培養(yǎng)系統(tǒng),一周后可用化學(xué)方法消化再傳代,一直傳10代,形成穩(wěn)定的iPS細(xì)胞系。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103756969SQ201410008450
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】程濤, 李彥欣, 劉淑萍, 許靜, 顧?;? 袁衛(wèi)平, 張孝兵 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所)
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