與cdk抑制劑相關(guān)的生物標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供監(jiān)測生物標(biāo)志物的差異基因表達以確定患者對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKi)的敏感性的方法、確定細胞對CDKi的敏感性的方法、利用CDKi治療患者的方法和篩選候選CDKi的方法。
【專利說明】與CDK抑制劑相關(guān)的生物標(biāo)志物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物基因組學(xué)領(lǐng)域，以及用于確定對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 的細胞敏感性的生物標(biāo)志物的用途，治療方法和篩選化合物的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在1992年通過篩選會調(diào)節(jié)細胞周期，尤其是Gl-S期進展中，的基因首次克隆 了人細胞周期蛋白 D3 (CCND3) (Xiong 等，Genomics 1992, 13:575-584, Motokura 等，了· Biol. Chem. 1992,267:20412-20415)。其是三個D型細胞周期蛋白（細胞周期蛋白D1、D2 和D3)之一。發(fā)現(xiàn)，CCND3作為D型細胞周期蛋白會與細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4和 Q)K6裝配，以形成促進細胞周期進展通過Gl的全酶（Bates等，Oncogene 1994,9:71-79)。 一旦經(jīng)過Gl晚期，CCND3對細胞周期進展就不再是必需的（Sherr, Trends in Bio. Sci 1995, 20(5) 187-190) 〇
[0004] 結(jié)構(gòu)上，CCND3含有細胞周期蛋白結(jié)構(gòu)域和兩個PEST結(jié)構(gòu)域。PEST結(jié)構(gòu)域用于 泛素介導(dǎo)的降解并且發(fā)現(xiàn)于細胞需要快速調(diào)節(jié)或更新的蛋白質(zhì)中。PEST結(jié)構(gòu)域富含脯氨 酸（P)、谷氨酸（E)、絲氨酸（S)和蘇氨酸（T)殘基，并且長度在12-60個氨基酸范圍內(nèi)。人 CCND3在氨基酸256-268 (含端點）和271-291 (含端點）處含有PEST結(jié)構(gòu)域。在研宄PEST 結(jié)構(gòu)域的作用中，研宄者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CCND3中的單個等位基因 SNP導(dǎo)致氨基酸259處從絲氨 酸至丙氨酸的氨基酸改變（S259A)。S259A改變破壞PEST結(jié)構(gòu)域，因此，當(dāng)與未突變的等位 基因相比時，變體CCND3具有增加的穩(wěn)定性（Savas等，OMICS 2007, 11 (2) :200-208)。
[0005] CCND3為淋巴細胞的發(fā)育所需。當(dāng)產(chǎn)生CCND3敲除小鼠（CCND3-/-)以測試CCND3 功能（Sicinska等，Cancer Cell 2003,4(6):451-461)時，這些敲除小鼠不經(jīng)歷幼T細胞 的正常增殖，這是非常的組織特異性缺陷。為了說明CCND3在T細胞惡性腫瘤中起的作用， CCND3敲除小鼠與過量表達p56LCK(其展示大量的T細胞腫瘤）的小鼠雜交。表達野生 型CCND3/p56LCK的小鼠快速形成T細胞惡性腫瘤。相反，T細胞惡性腫瘤在CCND3敲除/ P56LCK小鼠中延遲6-8周。使用該數(shù)據(jù)研宄人惡性腫瘤，同一個團隊使用siRNA方法以在 人T細胞急性成淋巴細胞性白血病（T-ALL)細胞系中敲低CCND3。在所測試的所有12個細 胞系中敲低CCND3顯著抑制了細胞增殖，驗證了小鼠數(shù)據(jù)并證明了 CCND3在人T細胞惡性 腫瘤中的重要性。
[0006] DNA測序技術(shù)的便利、速度和成本上的改善允許研宄者檢查癌細胞完整基因組 的改變。采用該方法，兩個團隊進行了彌散性大B細胞淋巴瘤（DLBCL)的完整基因組 分析，以發(fā)現(xiàn)可能負責(zé)該癌癥的特定基因和途徑（Pasqualucci等，Nature Genetics 2011，43(9) :830-837:Morin 等，Nature2011, 476:298-303)。該方法在 3/54 所測試的 DLBCLs中發(fā)現(xiàn)了 CCND3突變。
[0007] 在該公開內(nèi)容中，CCND3突變用作生物標(biāo)志物或指示物，預(yù)測和靶定特異性療法的 患者。尋找指示哪個患者應(yīng)該接受治療有用的生物標(biāo)志物是有用的，尤其是在癌癥方面。與 試錯方法相反，這允許更及時并且更強效的治療。此外，指示在施用后細胞繼續(xù)對療法敏感 的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)也是有用的。這些生物標(biāo)志物可以用于監(jiān)測接受治療的那些患者的反 應(yīng)。如果生物標(biāo)志物指示患者已經(jīng)對治療開始不敏感，那么所施用的劑量可以增加、減少、 完全終止或是施用額外的治療。如此，需要開發(fā)與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK)抑制劑 相關(guān)的生物標(biāo)志物。該方法保證正確的患者接受適當(dāng)?shù)闹委煵⑶以谥委熯^程中，可以監(jiān)測 所述患者持續(xù)的CDK抑制劑敏感性。
[0008] 在⑶K抑制劑的開發(fā)中，特異的生物標(biāo)志物將幫助理解施用時的作用機制。所述 作用機制可涉及細胞周期中調(diào)節(jié)機制的復(fù)雜級聯(lián)和差異基因表達。在藥物開發(fā)的臨床前階 段完成該分析，以確定癌細胞對CDK抑制劑候選物的特定敏感性和候選物的活性。藥效學(xué) 研宄中特別感興趣的是鑒定特異標(biāo)志物的敏感性和活性，如本文公開的那些。
[0009] 發(fā)明概沐
[0010] 本公開內(nèi)容提供，細胞周期蛋白D3(此后為"CCND3"）PEST結(jié)構(gòu)域中的突變在確 定細胞對細胞周期蛋白依賴性激酶4和/或細胞周期蛋白依賴性激酶6的抑制劑（此后為 "⑶Ki"）的敏感性中充當(dāng)特定的生物標(biāo)志物。本公開內(nèi)容包括產(chǎn)生⑶Ki的"基因標(biāo)簽"的 CCND3突變分析，其在預(yù)測何種癌細胞對CDKi敏感中具有增加的準確性和特異性。所述方 法分析從患者獲取的癌樣品中PEST結(jié)構(gòu)域中的CCND3突變，將其與非癌或正常對照相比較 并預(yù)測癌樣品對CDKi的敏感性。CCND3突變的分析可以指示有利的反應(yīng)或不利的反應(yīng)。本 發(fā)明是"個性化醫(yī)療"的實例，其中基于對該個體特異的功能基因組標(biāo)簽治療患者。
[0011] 還可以在利用⑶Ki治療后使用CCND3突變的預(yù)測值來確定患者是否仍然對治療 敏感。一旦已經(jīng)施用⑶Ki治療，CCND3突變可以用作生物標(biāo)志物，以監(jiān)測患者對⑶Ki治療 的持續(xù)敏感性。這在確定患者接受正確的治療過程中有用。本公開內(nèi)容包括預(yù)測并監(jiān)測患 者對CDKi治療的敏感性的方法。所述方法包括向患者施用CDKi，分析從治療患者獲得的 生物樣品上的CCND3突變并將其與非癌或正常樣品中的CCND3進行比較的步驟?；趯?PEST結(jié)構(gòu)域中CCND3突變的檢測評估患者的反應(yīng)。此外，與正?；蛞吧蛯φ占毎啾?，來 自含有CCND3突變的細胞的CCND3蛋白質(zhì)表達水平的檢測和/或改變預(yù)示患者對治療的敏 感性。CCND3突變體蛋白質(zhì)表達水平改變的模式可以指示有利的患者反應(yīng)或不利的患者反 應(yīng)。
[0012] 附圖描沐
[0013] 圖1是CCND3蛋白質(zhì)和某些突變的圖解。CCND3的PEST結(jié)構(gòu)域是人CCND3的氨基 酸 256-268 和 271-291。
[0014] 圖2A是含有野生型CCND3的細胞（其證明對⑶Ki (1)不敏感）的細胞活力圖解。
[0015] 圖2B是含有突變體CCND3的細胞（其證明對⑶Ki⑴敏感）的細胞活力圖解。
[0016] 圖2C是用⑶Ki (1)處理的野生型和突變CCND3細胞系的EC5tl值的盒形圖。
[0017] 圖3A是含有野生型CCND3的細胞（其證明對⑶Ki (2)不敏感）的細胞活力圖解。
[0018] 圖3B是含有突變體CCND3的細胞（其證明對⑶Ki⑵敏感）的細胞活力圖解。
[0019] 圖3C是用⑶Ki (2)處理的野生型和突變CCND3細胞系的EC5tl值的盒形圖。
[0020] 圖4A是含有野生型CCND3的細胞（其證明對⑶Ki (3)不敏感）的細胞活力圖解。
[0021] 圖4B是含有突變體CCND3的細胞（其證明對CDKi (3)不敏感）的細胞活力圖解。
[0022] 圖4C是用⑶Ki (3)處理的野生型和突變CCND3細胞系的EC5tl值的盒形圖。
[0023] 圖5A/B是Western印跡，其證明CCND3突變導(dǎo)致增加的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。
[0024] 圖6A是Western印跡，其顯示含有CCND3突變的細胞導(dǎo)致更高水平的CCND3突變 體蛋白質(zhì)。
[0025] 圖6B是野生型細胞系和含有CCND3突變的細胞系中mRNA表達的圖示。
[0026] 發(fā)明描沐
[0027] 確定癌細胞對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKi)的敏感性的方法，所述方 法包括：a)測定癌細胞中細胞周期蛋白D3(CCND3)突變；和b)比較CCND3突變與非癌或正 常對照細胞，其中癌細胞中CCND3突變的存在指示其對CDKi敏感。
[0028] 方法，其中癌細胞選自：彌散性大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴細胞性白血病、急性 成淋巴細胞性B細胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0029] 方法，其中CCND3突變位于PEST結(jié)構(gòu)域中。
[0030] 方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一個氨基酸改 變。
[0031] 方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一個氨基酸改 變。
[0032] 方法，其中CCND3突變是表2中的任何突變。
[0033] 方法，其中CCND3突變選自：氨基酸290處的異亮氨酸至賴氨酸的改變（I290K)、 氨基酸290處的異亮氨酸至蘇氨酸的改變（I290T)、氨基酸284處的脯氨酸至亮氨酸的改 變（P284L)、氨基酸284處的脯氨酸至絲氨酸的改變（P284S)，和氨基酸287處纈氨酸至天 冬氨酸的改變（V287D)。
[0034] 方法，其中CDKi選自表1。
[0035] 預(yù)測癌癥患者對利用CDKi治療的敏感性的方法，所述方法包括：a)測定從患者獲 得的癌樣品中的CCND3突變；和b)比較CCND3突變與非癌或正常對照樣品，其中癌樣品中 CCND3突變的存在指示患者對利用CDKi的治療敏感。
[0036] 方法，其中癌樣品選自：彌散性大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴細胞性白血病、急性 成淋巴細胞性B細胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0037] 方法，其中CCND3突變位于PEST結(jié)構(gòu)域中。
[0038] 方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一個氨基酸改 變。
[0039] 方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一個氨基酸改 變。
[0040] 方法，其中CCND3突變是表2中的任何突變。
[0041] 方法，其中CCND3突變選自：氨基酸290處的異亮氨酸至賴氨酸的改變（I290K)、 氨基酸290處的異亮氨酸至蘇氨酸的改變（I290T)、氨基酸284處的脯氨酸至亮氨酸的改 變（P284L)、氨基酸284處的脯氨酸至絲氨酸的改變（P284S)，和氨基酸287處纈氨酸至天 冬氨酸的改變（V287D)。
[0042] 方法，其中CDKi選自表1。
[0043] 方法，其進一步包括：c)測量從患者獲得的癌樣品中CCND3的差異蛋白質(zhì)表達；和 d)比較癌樣品中CCND3的蛋白質(zhì)表達與非癌或正常對照樣品的CCND3蛋白質(zhì)表達，其中癌 樣品中CCND3蛋白質(zhì)的增加水平指示所述患者對利用CDKi的治療敏感。
[0044] 利用CDKi治療癌癥患者的方法，所述方法包括：a)測定從患者獲得的癌樣品中的 CCND3突變；b)比較癌樣品中的CCND3突變狀態(tài)與非癌或正常對照樣品中的CCND3突變狀 態(tài)，其中CCND3突變的存在指示所述患者對利用CDKi的治療敏感；c)向該患者施用CDKi ; 和d)測定腫瘤生長的抑制。
[0045] 方法，其中癌樣品選自：彌散性大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴細胞性白血病、急性 成淋巴細胞性B細胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0046] 方法，其中CCND3突變位于PEST結(jié)構(gòu)域中。
[0047] 方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一個氨基酸改 變。
[0048] 方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一個氨基酸改 變。
[0049] 方法，其中CCND3突變是表2中的任何突變。
[0050] 方法，其中CCND3突變選自：氨基酸290處的異亮氨酸至賴氨酸的改變（I290K)、 氨基酸290處的異亮氨酸至蘇氨酸的改變（I290T)、氨基酸284處的脯氨酸至亮氨酸的改 變（P284L)、氨基酸284處的脯氨酸至絲氨酸的改變（P284S)，和氨基酸287處纈氨酸至天 冬氨酸的改變（V287D)。
[0051] 方法，其中以治療有效量施用⑶Ki。
[0052] 方法，其中CDKi選自表1。
[0053] 篩選⑶Ki候選物的方法，所述方法包括：a)使含有CCND3突變的細胞與⑶Ki候 選物接觸；b)測定細胞活力的降低；和c)比較來自與CDKi候選物接觸的CCND3突變體細 胞的細胞活力的降低和與對照CDKi接觸的CCND3突變體細胞的細胞活力的降低。
[0054] 方法，其中對照CDKi選自表1。
[0055] 方法，其中含有CCND3突變的細胞選自：彌散性大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴細胞 性白血病、急性成淋巴細胞性B細胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0056] 方法，其中CCND3突變位于PEST結(jié)構(gòu)域中。
[0057] 方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一個氨基酸改 變。
[0058] 方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一個氨基酸改 變。
[0059] 方法，其中CCND3突變是表2中的任何突變。
[0060] 方法，其中CCND3突變選自：氨基酸290處的異亮氨酸至賴氨酸的改變（I290K)、 氨基酸290處的異亮氨酸至蘇氨酸的改變（I290T)、氨基酸284處的脯氨酸至亮氨酸的改 變（P284L)、氨基酸284處的脯氨酸至絲氨酸的改變（P284S)，和氨基酸287處纈氨酸至天 冬氨酸的改變（V287D)。
[0061] 組合物，其包含用于在所選癌癥患者群體中治療癌癥的⑶Ki，其中與正常對照細 胞樣品相比，在從所述患者獲得的癌細胞樣品中顯示CCND3突變的基礎(chǔ)上選擇癌癥患者群 體。
[0062] 組合物，其中癌樣品選自彌散性大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴細胞性白血病、急 性成淋巴細胞性B細胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0063] 用于預(yù)測癌癥患者對利用CDKi治療的敏感性的試劑盒，其包含：i)用于檢測 CCND3突變的工具；和ii)怎樣使用所述試劑盒的說明書。
[0064] 定義
[0065] 除非上下文明確說明，如說明書和權(quán)利要求中所用，單數(shù)形式"a"、"an"和"the" 包括復(fù)數(shù)參考。例如，術(shù)語"細胞"包括多個細胞，包括其混合物。
[0066] 所有的數(shù)字名稱，例如pH、溫度、時間、濃度和分子量，包括范圍均是近似值，其以 〇. 1的增量（+)或（_)變化。應(yīng)理解，盡管不總是明確說明，所有數(shù)字名稱前面具有術(shù)語 "約"。還應(yīng)理解，盡管不總是明確說明，本文描述的試劑僅是示例性的并且其等同物為本領(lǐng) 域所知。
[0067] 術(shù)語"標(biāo)志物"或"生物標(biāo)志物"在本文中可互換使用。生物標(biāo)志物是核酸或多肽， 并且多肽突變或差異表達的存在或缺失用于確定對任何CDKi的敏感性。例如，CCND3是癌 細胞中的生物標(biāo)志物，當(dāng)其與正常（非癌）細胞或?qū)φ占毎械腃CND3相比被突變時。
[0068] 當(dāng)與未處理的對照相比，利用⑶Ki治療后細胞活力降低時，細胞對⑶Ki抑制"敏 感"或展示"敏感性"。
[0069] "CCND3"指細胞周期蛋白D3基因。除非另有明確說明，如本文所用的CCND3指人 CCND3,登錄號 BC011616(CCND3 核酸（SEQ ID NO. 1))和 AAH11616(CCND3 蛋白質(zhì)（SEQ ID NO. 2)) 〇
[0070] "野生型"、"正常"或"非突變體"指這樣的CCND3序列，其包含檢索號BCO11616/ AAHl 1616(分別為核酸（SEQ ID NO. 1)和蛋白質(zhì)（SEQ ID NO. 2))。
[0071] "突變體"或"突變"是偏離野生型CCND3的DNA或蛋白質(zhì)序列的任何改變。這包 括，但不限于：CCND3基因及其相應(yīng)蛋白質(zhì)的單堿基核酸改變或單氨基酸改變、插入、缺失 和截短。
[0072] "對照細胞"、"正常細胞"或"野生型"指非癌組織或細胞。
[0073] "對照組織"、"正常組織"或"野生型"指非癌組織或細胞。
[0074] 術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"可以互換使用并且指任何長度的核苷酸的聚合形式，脫 氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可以具有任何三維結(jié)構(gòu)并且可以執(zhí)行任 何功能。以下是多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段（例如，探針、引物、EST或SAGE 標(biāo)簽）、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、 分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針，和引 物。多核苷酸可以包含經(jīng)修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，可 以在多聚體組裝之前或之后進行核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾。核苷酸的序列可以被非核苷酸組分中 斷。多核苷酸可以在聚合后，如通過與標(biāo)記的組分綴合來進一步修飾。所述術(shù)語還指雙鏈 和單鏈分子。除非另外指明或要求，本發(fā)明的任何多核苷酸的實施方案包括雙鏈形式和已 知的或預(yù)測構(gòu)成雙鏈形式的兩條互補的單鏈形式的每一條鏈。
[0075] "基因"指含至少一個可讀框（ORF)的多核苷酸，其在轉(zhuǎn)錄和翻譯后能編碼特定的 多肽或蛋白質(zhì)。能將多核苷酸序列用于鑒定與其相關(guān)的基因的較大片段或全長編碼序列。 分離較大片段序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0076] "基因表達"或備選地"基因產(chǎn)物"指基因轉(zhuǎn)錄和翻譯時產(chǎn)生的核酸或氨基酸（例 如，肽或多肽）。
[0077] 術(shù)語"多肽"可與術(shù)語"蛋白質(zhì)"互換使用，并在廣義上指兩個或多個亞基氨基酸 (subunit amino acid)的化合物、氨基酸類似物或擬肽。亞基能通過肽鍵連接。在另一個 實施方案中，亞基可以通過其他鍵，例如酯、醚等連接。
[0078] 如本文中所用，術(shù)語"氨基酸"指天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，以及 D和L旋光異構(gòu)體、氨基酸類似物和擬肽。如果肽鏈很短，那么通常將三個或三個以上氨基 酸的肽稱為寡肽。如果肽鏈很長，那么通常將肽稱為多肽或蛋白質(zhì)。
[0079] 術(shù)語"分離的"意為是自天然狀態(tài)下與多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段 通常相關(guān)的組分、細胞組分及其他分離的。例如，分離的多核苷酸與在自然或天然環(huán)境，例 如在染色體上通常與其相關(guān)的3'和5'連續(xù)核苷酸分離。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是， 非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段并不需要"分離"，以將其與其天然 存在的對應(yīng)物區(qū)分開來。此外，"濃縮的"、"分離的"或"經(jīng)稀釋的"多核苷酸、肽、多肽、蛋白 質(zhì)、抗體或其片段可與其天然存在的對應(yīng)物區(qū)分開來，因為與天然存在的對應(yīng)物相比，每一 體積的濃縮物或者分子數(shù)在"濃縮的"形式中更多或者在"分離的"形式中更少。在一級序 列或者例如糖基化模式上不同于天然存在的對應(yīng)物的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或 其片段并不需要以分離形式存在，因為可以通過一級序列或者備選地，通過另一特征如糖 基化模式與其天然存在的對應(yīng)物區(qū)分開來。因此，將非天然存在的多核苷酸提供為不同于 分離的天然存在的多核苷酸的單獨實施方案。將在細菌細胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提供為區(qū)別于 從真核細胞分離的天然存在的蛋白質(zhì)的單獨實施方案，其中在天然狀態(tài)下所述真核細胞產(chǎn) 生所述蛋白質(zhì)。
[0080] 當(dāng)在多核苷酸操作的上下文中使用時，"探針"指寡核苷酸，其提供為通過與靶標(biāo) 雜交，檢測可能存在于目的樣品中的靶標(biāo)的試劑。通常，探針包含標(biāo)記或者雜交反應(yīng)之前或 之后標(biāo)記可以結(jié)合的方法。合適的標(biāo)記包括但不限于，放射性同位素、熒光色素、化學(xué)發(fā)光 化合物、染料和蛋白質(zhì)包括酶。
[0081] "引物"是通常具有游離的3' -OH基的短的多核苷酸，其通過與靶標(biāo)雜交，與目的 樣品中可能存在的靶標(biāo)或"模板"結(jié)合，從而促進與靶標(biāo)互補的多核苷酸的聚合。"聚合酶 鏈反應(yīng)"（"PCR"）是這樣的反應(yīng)：使用由"上游"和"下游"引物組成的"一對引物"或"一 套引物"，聚合的催化劑如DNA聚合酶以及一般熱穩(wěn)定聚合酶，復(fù)制組成靶多核苷酸的拷貝。 PCR方法是本領(lǐng)域熟知的，并且例如在PCR :A Practical Approach，M. MacPherson等人， IRL Press at Oxford University Press (1991)中教導(dǎo)。產(chǎn)生多核苷酸的復(fù)制拷貝的全部 過程，例如PCR或基因克隆在本文中總稱為"復(fù)制"。還可以將引物用作雜交反應(yīng)，例如DNA 或 RNA 印跡分析中的探針（Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 二版（1989))。
[0082] 如本文中所用，"表達"指DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的過程和/或轉(zhuǎn)錄的mRNA隨后翻譯成 肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。如果多核苷酸來源于基因組DNA，表達可以包括真核細胞中mRNA 的剪接。
[0083] 當(dāng)將"差異表達"應(yīng)用于基因時，指從該基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的mRNA或者由該基 因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的差異產(chǎn)生。與正?；?qū)φ占毎谋磉_水平相比，差異表達基因可以 是過量表達或者低表達（underexpress)。然而，如本文所用，過表達是基因表達的增加并且 一般是在正?；?qū)φ諏?yīng)物細胞或組織中檢測到的至少1. 25倍或，備選地至少1. 5倍或， 備選地至少2倍，或備選地至少3倍或備選地，至少4倍表達。如本文所用，低表達是基因 表達的降低并且一般低于在正?；?qū)φ諏?yīng)物細胞或組織中檢測到的至少I. 25倍或備選 地，至少1. 5倍或備選地，至少2倍或備選地，至少3倍或備選地，至少4倍表達。術(shù)語"差 異表達的"還指其中在癌細胞或癌組織中檢測到表達，但在對照細胞或正常組織（例如非癌 細胞或組織）中不能檢測到表達。
[0084] 由于基因的過量表達或基因拷貝數(shù)目的增加可以出現(xiàn)基因的高表達水平。由于負 調(diào)節(jié)物的失調(diào)或缺失，基因還可以被翻譯至增加的蛋白質(zhì)水平。最后，由于蛋白質(zhì)增加的穩(wěn) 定作用或減少的降解可以出現(xiàn)基因的高表達，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的積累。
[0085] "基因表達譜"或"基因標(biāo)簽"指至少一個生物標(biāo)志物的表達模式，其在多個樣品中 重現(xiàn)并且反映那些樣品共有的性質(zhì)，如突變、對特定治療的反應(yīng)、或細胞中特定生物學(xué)過程 或途徑的激活?；虮磉_譜區(qū)分共有共同性質(zhì)的樣品和沒有共同性質(zhì)的那些樣品，這比通 過將樣品隨機分配成兩組實現(xiàn)的準確性更高?；虮磉_譜可以用于預(yù)測未知狀態(tài)的樣品是 否共有共同的性質(zhì)。將預(yù)測生物標(biāo)志物和典型譜之間的一些變異，但是生物標(biāo)志物與典型 譜的整體相似性是這樣的，在不共有生物標(biāo)志物反映的共同性質(zhì)的樣品中偶然觀察到相似 性在統(tǒng)計學(xué)上是不太可能。
[0086] 術(shù)語"cDNA"指互補DNA，即用酶如逆轉(zhuǎn)錄酶將細胞或生物中存在的mRNA分子制 備成cDNA。"cDNA"文庫是細胞或生物中存在的全部mRNA分子的集合，用逆轉(zhuǎn)錄酶將所述 mRNA全部轉(zhuǎn)變成cDNA分子，然后插入到"載體"（在添加外源DNA后可以繼續(xù)復(fù)制的其他 DNA分子）中。用于文庫的示例性載體包括噬菌體、感染細菌的病毒，如λ噬菌體。然后可 以針對特定的目的cDNA (和由此得到的mRNA)探測文庫。
[0087] 如本文中所用，可互換使用的"固相支持物"或"固相支持體"并不限于特定類型的 支持體。相反，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以獲得并且已知大量的支持體。固相支持體包括硅 膠、樹脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、塑料珠、氧化鋁凝膠、微陣列和芯片。如本文中所用，"固 相支持體"還包括合成的抗原呈遞基質(zhì)、細胞和脂質(zhì)體?；谄谕淖罱K用途和不同方案的 適用性，可以選擇合適的固相支持體。例如，對于肽合成，固相支持體可以涉及樹脂，例如聚 苯乙?。ɡ?，獲自 Bachem Inc. ,Peninsula Laboratories 的 ΡΑΜ-r 樹脂）、polyHIPE(R) ?樹脂（獲自Aminotech，加拿大）、聚酰胺樹脂（獲自Peninsula Laboratories)、用聚乙 二醇嫁接（graft)的聚苯乙稀樹脂（TentaGelR?，Rapp Polymere，Tubingen，德國）或者聚 二甲基丙稀酰胺樹脂（獲自 Milligen/Biosearch，California)。
[0088] 還可以將多核苷酸與固相支持體連接，用于高通量篩選測定。例如，PCT WO 97/10365公開了高密度寡核苷酸芯片的構(gòu)建。也參見，美國專利No. 5, 405, 783 ;5, 412, 087 和5, 445, 934。使用該方法，在衍生的玻璃表面上合成探針，以形成芯片陣列。將光保護的 核苷亞磷酰胺偶聯(lián)至玻璃表面，經(jīng)光刻用掩模通過光解選擇性去保護，并與第二個所保護 的核苷亞磷酰胺反應(yīng)。重復(fù)偶聯(lián)/去保護過程，直到完成期望的探針。
[0089] 作為實例，通過使用基于芯片如Affymetrix? HG-U133-Plus-2GeneChips (Aff ymetrix, Santa Clara, CA)來測量信使RNA的水平，可以評估轉(zhuǎn)錄活性。因此，在可重復(fù)的 系統(tǒng)中，有可能高通量、實時定量大量目的基因的RNA。
[0090] 術(shù)語"嚴格雜交條件"指這樣的條件，在所述條件下核酸探針可以與其靶序列特異 性雜交，而不與其他序列雜交。確定雜交的嚴格性的條件包括：溫度、離子強度和變性劑如 甲酰胺的濃度。改變這些因素之一會影響另一因素，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可以改變條 件以維持期望的嚴格水平。高度嚴格雜交的實例是：65°C -68°C，0.015M氯化鈉、0.0015M 檸檬酸鈉或者42°C，0. 015M氯化鈉、0. 0015M檸檬酸鈉和50%甲酰胺（參見Sambrook，上 文）。"中等嚴格"雜交的實例是條件：50°C -65°C，0. 015M氯化鈉、0. 0015M檸檬酸鈉或者 37°C -50°C，0. 015M氯化鈉、0. 0015M檸檬酸鈉和20%甲酰胺。當(dāng)期望適量的核酸錯配時， 使用中等嚴格條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，洗滌是雜交條件的一部分。例如，洗滌條件可以 包括02.X-0. IX SSC/0. 1%SDS和42°C_68°C的溫度，其中增加溫度增加了洗滌條件的嚴格 性。
[0091] 當(dāng)在兩條單鏈多核苷酸之間以反向平行構(gòu)型發(fā)生雜交時，稱該反應(yīng)為"退火"，并 且將這些多核苷酸描述為"互補"。如果在第一多核苷酸的鏈之一和第二多核苷酸之間發(fā)生 雜交，那么雙鏈多核苷酸與另一多核苷酸可以是"互補的"或者"同源的"。根據(jù)通常公認的 堿基配對規(guī)則，按照相對鏈中期望彼此形成氫鍵的堿基的比例，可以量化"互補性"或"同源 性"（一種多核苷酸與另一多核苷酸互補的程度）。
[0092] 多核苷酸或多核苷酸區(qū)（多肽或多肽區(qū)）與另一序列具有"序列同一性"的確定 百分比（例如，80%、85%、90%、95%、98%或99%)指的是，當(dāng)比對時，在比較的兩個序列 中，堿基（或氨基酸）的百分比是相同的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的軟件程序，例如Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等人，eds.，（1987) Supplement 30, section 7. 7. 18, Table7. 7. I中描述的那些程序進行這種比對并確定同源性和序列同一性百分比。 優(yōu)選地，將默認參數(shù)用于比對。優(yōu)選的比對程序是BLAST，并使用默認參數(shù)。特別地，優(yōu)選的 程序是BLASTN和BLASTP，且使用以下的默認參數(shù)：遺傳密碼=標(biāo)準；過濾=無；鏈=兩條； 截斷=60 ;期望值=10 ;Matrix = BL0SUM62 ;描述=50個序列；排序=高得分；數(shù)據(jù)庫= 非冗余的。
[0093] 術(shù)語"細胞增殖性病癥"應(yīng)當(dāng)包括表征為異常細胞生長和/或分裂或者功能喪失 的正常生理功能的調(diào)節(jié)異常。"細胞增殖性病癥"的實例包括但不限于，增生、瘤形成、組織 轉(zhuǎn)化或多種自身免疫病癥，例如以T細胞凋亡的調(diào)節(jié)異常為特征的那些疾病。
[0094] 如本文中所用，術(shù)語"贅生性細胞"、"腫瘤性疾病"、"瘤形成"、"腫瘤"、"腫瘤細胞"、 "癌癥"、"癌細胞"（可互換使用）指表現(xiàn)出相對自主生長的細胞，以致它們表現(xiàn)出以細胞增 殖控制（即，下調(diào)細胞分裂）的顯著喪失為特征的異常生長表型。贅生性細胞可以是惡性 的或者良性的。"轉(zhuǎn)移的細胞或組織"指的是細胞可以侵入并破壞鄰近的機體結(jié)構(gòu)。癌癥可 以包括但不限于彌散性大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性B 細胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0095] 術(shù)語"PBMC"指外周血單核細胞，并包括"PBL外周血淋巴細胞。
[0096] "抑制"腫瘤生長或腫瘤生長的"抑制"表示當(dāng)與未與⑶Ki化合物接觸的腫瘤生長 相比，與CDKi接觸時腫瘤細胞生長的減慢。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法評估腫瘤細胞 生長，其包括但不限于測量腫瘤大小、使用3H-胸苷摻入測定法確定腫瘤細胞是否正在增 殖、通過FDG-PET (氟代脫氧葡萄糖正電子成像術(shù)）成像測量葡萄糖吸收、或者計數(shù)腫瘤細 胞。"抑制"腫瘤細胞生長指的是以下狀態(tài)的任一種或者全部：減緩、延遲和終止腫瘤生長， 以及腫瘤縮小。
[0097] "組合物"是活性劑和另一載體的組合，所述載體例如惰性的（例如，可檢測的試劑 或標(biāo)記）或者有活性的化合物或組合物，如佐劑、稀釋劑、結(jié)合劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、鹽、親脂 溶劑、防腐劑、輔助劑等。載體還可以包含單獨的或者組合的按重量或體積為1-99. 99%的 藥物賦形劑和添加劑，例如：可以單獨或者組合存在的蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂和糖（例如， 糖，包括單糖和寡糖；衍生的糖如糖醇、糖醛酸、酯化的糖等；以及多糖或糖聚合物）。糖賦 形劑包括例如，單糖如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗 糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖如蜜三糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇如 甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、拉克替醇、木糖醇山梨糖醇（葡萄糖醇）和肌醇。
[0098] 示例性蛋白質(zhì)賦形劑包括血清白蛋白例如人血清白蛋白（HSA)、重組人白蛋白 (rHA)、明膠、酪蛋白等。也可以在緩沖容量中發(fā)揮功能的代表性氨基酸/抗體組分包括丙 氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。
[0099] 術(shù)語"載體"還包括緩沖劑或pH調(diào)整劑；一般地，緩沖劑是由有機酸或堿制備的 鹽。代表性緩沖劑包括有機酸鹽如檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙 酸或苯二甲酸的鹽；Tris、氨丁三醇鹽酸鹽（tromethamine hydrochloride)或磷酸鹽緩沖 液。其他載體包括聚合的賦形劑/高分子添加劑如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖（聚合的糖）、 葡聚糖結(jié)合劑（例如，環(huán)糊精，如2-輕丙基-正交（quadrature)-環(huán)糊精）、聚乙二醇、調(diào)味 劑、抗微生物劑、甜味劑、抗氧化劑、抗靜電劑、表面活性劑（例如，聚山梨醇酯如TWEEN 20? 和TWEEN 80?)、脂（例如，磷脂、脂肪酸）、類固醇（例如，膽固醇）和螯合劑（例如，EDTA)。 [0100] 如本文中所用，術(shù)語"可藥用載體"包括任一種標(biāo)準的可藥用載體，例如磷酸緩沖 鹽水溶液、水和乳劑，如油/水或水/油乳劑，以及多種類型的潤濕劑。組合物還可以包 括穩(wěn)定劑和防腐劑，以及可應(yīng)用于體內(nèi)的任何上述載體。載體、穩(wěn)定劑和佐劑的實例參見 Remington? s Pharmaceutical Science.，15th Ed. (Mack Publ. Co.，Easton (1975)和 the Physician' s Desk Reference, 52nd ed·，Medical Economics, Montvale, N. J. (1998)中。
[0101] "有效量"是足以實現(xiàn)有益或期望結(jié)果的量?？梢栽谝淮位蚨啻问┯没驊?yīng)用或給藥 時施用有效量。
[0102] "受試者"、"個體"或"患者"在本文中可互換使用，其指脊椎動物，優(yōu)選地哺乳動 物，更優(yōu)選地人類。哺乳動物包括但不限于，小鼠、猿猴、人、家畜、運動動物和寵物。
[0103] 如本文所用的⑶K的"抑制劑"(⑶Ki)減少了 CCND3與⑶K4和/或⑶K6的結(jié)合。 該抑制可以包括，例如，在它們結(jié)合到一起之前減少CCND3與CDK4/6的結(jié)合，或在它們結(jié)合 到一起之后減少CCND3與CDK4/6的結(jié)合，因此釋放兩個分子。減少可以在低，但可檢測量， 至分子完全解離的范圍內(nèi)。
[0104] 目前已經(jīng)鑒定了許多CCND3突變作為⑶Ki的生物標(biāo)志物。PEST結(jié)構(gòu)域中的CCND3 突變可以用于確定患者對任何CDKi的敏感性。CCND3突變包括但不限于，PEST結(jié)構(gòu)域中的 插入、缺失、移碼和一個或多個點突變。例如但不限于，PEST結(jié)構(gòu)域中的CCND3突變包括： 氨基酸290處的異亮氨酸至賴氨酸的改變（I290K)、氨基酸290處的異亮氨酸至蘇氨酸的改 變（I290T)、氨基酸284處的脯氨酸至亮氨酸的改變（P284L)、氨基酸284處的脯氨酸至絲 氨酸的改變（P284S)，和氨基酸287處纈氨酸至天冬氨酸的改變（V287D)。例如，PEST結(jié)構(gòu) 域中氨基酸290處從異亮氨酸至蘇氨酸的CCND3突變（I290T)指示癌癥患者對任何CDKi 的施用敏感并且將有利地對任何CDKi的施用反應(yīng)。
[0105] ⑶K抑制劑（⑶Ki)是這樣的化合物，其是CCND3 -⑶K4/6結(jié)合的抑制劑并且用于 與本發(fā)明的方法結(jié)合。CDKi用于藥物組合物中用于人或獸醫(yī)用途，其中例如在腫瘤和/或 癌細胞生長的治療中指示對CCND3 - CDK4/6結(jié)合的抑制。CDKi化合物用于治療例如彌散性 大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性B細胞白血病和伯基特淋 巴瘤。
[0106] 表I-CDKi化合物
[0107] CDKi ⑴
【權(quán)利要求】
1. 確定癌細胞對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKi)的敏感性的方法，所述方法 包括：a)測定癌細胞中細胞周期蛋白D3(CCND3)突變；和b)比較CCND3突變與非癌或正常 對照細胞，其中癌細胞中CCND3突變的存在指示其對CDKi敏感。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中癌細胞選自：彌散性大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴細胞性 白血病、急性成淋巴細胞性B細胞白血病和伯基特淋巴瘤。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中CCND3突變位于PEST結(jié)構(gòu)域中。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一 個氨基酸改變。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一 個氨基酸改變。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中CCND3突變是表2中的任何突變。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中CCND3突變選自：氨基酸290處的異亮氨酸至賴氨酸的改 變（I290K)、氨基酸290處的異亮氨酸至蘇氨酸的改變（I290T)、氨基酸284處的脯氨酸至 亮氨酸的改變（P284L)、氨基酸284處的脯氨酸至絲氨酸的改變（P284S)，和氨基酸287處 纈氨酸至天冬氨酸的改變（V287D)。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中⑶Ki選自表1。
9. 預(yù)測癌癥患者對利用CDKi治療的敏感性的方法，所述方法包括：a)測定從患者獲 得的癌樣品中的CCND3突變；和b)比較CCND3突變與非癌或正常對照樣品，其中癌樣品中 CCND3突變的存在指示患者對利用CDKi的治療敏感。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中癌樣品選自：彌散性大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴細胞性 白血病、急性成淋巴細胞性B細胞白血病和伯基特淋巴瘤。
11. 權(quán)利要求9的方法，其中CCND3突變位于PEST結(jié)構(gòu)域中。
12. 權(quán)利要求9的方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一 個氨基酸改變。
13. 權(quán)利要求9的方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一 個氨基酸改變。
14. 權(quán)利要求9的方法，其中CCND3突變是表2中的任何突變。
15. 權(quán)利要求9的方法，其中CCND3突變選自：氨基酸290處的異亮氨酸至賴氨酸的改 變（I290K)、氨基酸290處的異亮氨酸至蘇氨酸的改變（I290T)、氨基酸284處的脯氨酸至 亮氨酸的改變（P284L)、氨基酸284處的脯氨酸至絲氨酸的改變（P284S)，和氨基酸287處 纈氨酸至天冬氨酸的改變（V287D)。
16. 權(quán)利要求9的方法，其中⑶Ki選自表1。
17. 權(quán)利要求9的方法，其進一步包括：c)測量從患者獲得的癌樣品中CCND3的差異蛋 白質(zhì)表達；和d)比較癌樣品中CCND3的蛋白質(zhì)表達與非癌或正常對照樣品的CCND3蛋白質(zhì) 表達，其中癌樣品中CCND3蛋白質(zhì)的增加水平指示所述患者對利用CDKi的治療敏感。
18. 利用CDKi治療癌癥患者的方法，所述方法包括：a)測定從患者獲得的癌樣品中的 CCND3突變；b)比較癌樣品中的CCND3突變狀態(tài)與非癌或正常對照樣品中的CCND3突變狀 態(tài)，其中CCND3突變的存在指示所述患者對利用CDKi的治療敏感；c)向該患者施用CDKi ; 和d)測定腫瘤生長的抑制。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中癌樣品選自：彌散性大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴細胞 性白血病、急性成淋巴細胞性B細胞白血病和伯基特淋巴瘤。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中CCND3突變位于PEST結(jié)構(gòu)域中。
21. 權(quán)利要求18的方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少 一個氨基酸改變。
22. 權(quán)利要求18的方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少 一個氨基酸改變。
23. 權(quán)利要求18的方法，其中CCND3突變是表2中的任何突變。
24. 權(quán)利要求18的方法，其中CCND3突變選自：氨基酸290處的異亮氨酸至賴氨酸的改 變（I290K)、氨基酸290處的異亮氨酸至蘇氨酸的改變（I290T)、氨基酸284處的脯氨酸至 亮氨酸的改變（P284L)、氨基酸284處的脯氨酸至絲氨酸的改變（P284S)，和氨基酸287處 纈氨酸至天冬氨酸的改變（V287D)。
25. 權(quán)利要求18的方法，其中以治療有效量施用⑶Ki。
26. 權(quán)利要求18的方法，其中⑶Ki選自表1。
27. 篩選CDKi候選物的方法，所述方法包括：a)使含有CCND3突變的細胞與CDKi候選 物接觸；b)測定細胞活力的降低；和c)比較來自與CDKi候選物接觸的CCND3突變體細胞 的細胞活力的降低和與對照CDKi接觸的CCND3突變體細胞的細胞活力的降低。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中對照⑶Ki選自表1。
29. 權(quán)利要求27的方法，其中含有CCND3突變的細胞選自：彌散性大B細胞淋巴瘤、淋 巴瘤、淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性B細胞白血病和伯基特淋巴瘤。
30. 權(quán)利要求27的方法，其中CCND3突變位于PEST結(jié)構(gòu)域中。
31. 權(quán)利要求27的方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少 一個氨基酸改變。
32. 權(quán)利要求27的方法，其中CCND3突變是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少 一個氨基酸改變。
33. 權(quán)利要求27的方法，其中CCND3突變是表2中的任何突變。
34. 權(quán)利要求27的方法，其中CCND3突變選自：氨基酸290處的異亮氨酸至賴氨酸的改 變（I290K)、氨基酸290處的異亮氨酸至蘇氨酸的改變（I290T)、氨基酸284處的脯氨酸至 亮氨酸的改變（P284L)、氨基酸284處的脯氨酸至絲氨酸的改變（P284S)，和氨基酸287處 纈氨酸至天冬氨酸的改變（V287D)。
35. 組合物，其包含用于在所選癌癥患者群體中治療癌癥的CDKi，其中與正常對照細 胞樣品相比，在從所述患者獲得的癌細胞樣品中顯示CCND3突變的基礎(chǔ)上選擇癌癥患者群 體。
36. 權(quán)利要求35的組合物，其中癌樣品選自彌散性大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴細胞 性白血病、急性成淋巴細胞性B細胞白血病和伯基特淋巴瘤。
37. 用于預(yù)測癌癥患者對利用CDKi治療的敏感性的試劑盒，其包含：i)用于檢測 CCND3突變的工具；和ii)怎樣使用所述試劑盒的說明書。
【文檔編號】C12Q1/68GK104487594SQ201380036674
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月9日
【發(fā)明者】G·卡波尼格羅, S·德拉奇, L·加拉維, Z·亞加尼, S·金, G·克留科夫 申請人:諾華股份有限公司, 達納-法伯癌癥研究公司, 博德研究所