具有微衛(wèi)星區(qū)域的dna的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題在于提供一種不產(chǎn)生非特異性反應(yīng)產(chǎn)物的問題、能夠以良好的精度檢測(cè)具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的方法。本發(fā)明涉及“一種通過下述步驟來檢測(cè)具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的方法：(1)使具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA和不具有與該微衛(wèi)星區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列而與該微衛(wèi)星區(qū)域的兩側(cè)的堿基序列雜交的探針接觸，形成具有包含微衛(wèi)星區(qū)域的環(huán)結(jié)構(gòu)的所述DNA和所述探針的雜交體；(2)將所得到的雜交體分離出來；(3)對(duì)該雜交體進(jìn)行檢測(cè)”；以及“DNA和探針的雜交體，其是使具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA和探針接觸而具有包含微衛(wèi)星區(qū)域的環(huán)結(jié)構(gòu)的所述DNA和所述探針的雜交體，所述探針不具有與該微衛(wèi)星區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列而與該微衛(wèi)星區(qū)域的兩側(cè)的堿基序列雜交”。
【專利說明】具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用環(huán)雜交法來檢測(cè)具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的方法以及通過環(huán)雜交 法得到的雜交體。

【背景技術(shù)】
[0002] 1?6堿基作為一個(gè)單位并重復(fù)而形成的重復(fù)序列被稱為微衛(wèi)星區(qū)域，已知其大 量存在于人的基因組序列等許多哺乳類動(dòng)物中，在人基因組中存在3000處以上。該微衛(wèi)星 區(qū)域顯示出其重復(fù)次數(shù)（重復(fù)數(shù)）不同的多態(tài)性，因此已知作為各種基因解析的標(biāo)記是有 用的。另外還已知，在微衛(wèi)星區(qū)域位于基因的蛋白編碼區(qū)域時(shí)，其重復(fù)數(shù)的差異會(huì)成為疾病 的原因，為了調(diào)查基因與疾病的相關(guān)關(guān)系，對(duì)微衛(wèi)星區(qū)域進(jìn)行了各種研究。
[0003] 具有這種微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的多態(tài)性解析方法中，通常通過在PCR擴(kuò)增后利用變 性聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳對(duì)其片段進(jìn)行分離分析來進(jìn)行解析。但是，在進(jìn)行微 衛(wèi)星DNA的多態(tài)性解析的情況下，需要利用30cm的毛細(xì)管進(jìn)行電泳或利用40cm長(zhǎng)的變性 聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，因此存在價(jià)格昂貴、需要專業(yè)技術(shù)等問題。
[0004] 另一方面，作為變異基因的檢測(cè)方法，已知下述環(huán)雜交法（LH法）：其在DNA片段 的PCR反應(yīng)后的反應(yīng)液中添加單鏈低聚DNA與目標(biāo)DNA片段雜交，根據(jù)所得到的雜交體的 結(jié)構(gòu)差異用電泳法進(jìn)行分離，由此判斷變異基因（專利文獻(xiàn)1)。另外，還有利用該LH法進(jìn) 行具有微衛(wèi)星區(qū)域的UGT1A1的變異基因的檢測(cè)（非專利文獻(xiàn)1)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006] 專利文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2007-61080 [0008] 非專利文獻(xiàn)
[0009] 非專利文獻(xiàn) 1 :Clinica Chimica Acta, 412, 1688-1672


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 發(fā)明要解決的課題
[0011] 由于不存在需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)的問題，因此本發(fā)明人對(duì)非專利文獻(xiàn)1中 記載的方法（現(xiàn)有的LH法）進(jìn)行了研究。但是，在使用該現(xiàn)有的LH法時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)大 量產(chǎn)生了目標(biāo)雜交體以外的非特異性反應(yīng)產(chǎn)物，因此會(huì)發(fā)生難以確定目標(biāo)物的問題。即，在 現(xiàn)有的LH法中，以僅僅野生型DNA和變異型DNA的分離為目的，因此只要這些泳動(dòng)帶或泳 動(dòng)峰與非特異性反應(yīng)產(chǎn)物的泳動(dòng)帶或泳動(dòng)峰偏離就不會(huì)有問題。但是，在由于微衛(wèi)星區(qū)域 的重復(fù)數(shù)不同而對(duì)多態(tài)性進(jìn)行分離的情況下，可知非特異性反應(yīng)產(chǎn)物有時(shí)會(huì)妨礙目標(biāo)物的 檢測(cè)。根據(jù)這樣的狀況，本發(fā)明的目的在于，利用形成具有特定環(huán)結(jié)構(gòu)的雜交體的LH法，提 供一種不發(fā)生上述那樣的非特異性反應(yīng)產(chǎn)物的問題、能夠以良好的精度檢測(cè)具有微衛(wèi)星區(qū) 域的DNA的方法。
[0012] 用于解決課題的方案
[0013] 即，本發(fā)明人針對(duì)利用LH法對(duì)具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA進(jìn)行檢測(cè)的方法進(jìn)行了深 入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在探針與目標(biāo)DNA雜交時(shí)，通過以微衛(wèi)星區(qū)域全部進(jìn)入環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)的方式 合成探針，由此幾乎不產(chǎn)生非特異性反應(yīng)產(chǎn)物，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及以下方 案：
[0014] "一種檢測(cè)具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的方法，其通過下述步驟來檢測(cè)：
[0015] (1)使具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA和探針接觸，形成所述DNA和所述探針的雜交體，所 述雜交體具有包含微衛(wèi)星區(qū)域的環(huán)結(jié)構(gòu)，所述探針不具有與該微衛(wèi)星區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列 而與該微衛(wèi)星區(qū)域的兩側(cè)的堿基序列雜交；
[0016] (2)將所得到的雜交體分離出來；
[0017] (3)對(duì)該雜交體進(jìn)行檢測(cè)。"；以及
[0018] "DNA和探針的雜交體，其是使具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA和探針接觸而具有包含微衛(wèi) 星區(qū)域的環(huán)結(jié)構(gòu)的所述DNA和所述探針的雜交體，所述探針不具有與該微衛(wèi)星區(qū)域互補(bǔ)的 堿基序列而與該微衛(wèi)星區(qū)域的兩側(cè)的堿基序列雜交。"
[0019] 發(fā)明的效果
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，能夠簡(jiǎn)便且以良好的精度檢測(cè)具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA。
[0021] 另外，即使是具有重復(fù)數(shù)（反復(fù)數(shù)）不同的微衛(wèi)星區(qū)域的DNA，也能夠根據(jù)重復(fù)數(shù) (反復(fù)數(shù)）的長(zhǎng)度進(jìn)行分離，并且?guī)缀醪划a(chǎn)生在現(xiàn)有的LH法中大量產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)產(chǎn) 物，因此能夠以高精度檢測(cè)目標(biāo)DNA而無檢測(cè)錯(cuò)誤。
[0022] 特別令發(fā)明人感到完全意外的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：如本發(fā)明這樣以微衛(wèi)星區(qū)域全部 進(jìn)入環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)的方式來合成探針時(shí)，幾乎不生成非特異性反應(yīng)產(chǎn)物并且能夠利用重復(fù)數(shù)的 差異而對(duì)重復(fù)數(shù)不同的變異多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
[0023] S卩，以往檢測(cè)有無一堿基置換是主要目的，按照置換堿基存在于環(huán)結(jié)構(gòu)的開始 (立6上# >9 )部分的方式來設(shè)計(jì)探針。因此，在微衛(wèi)星區(qū)域具有變異的情況下，按照微衛(wèi) 星區(qū)域位于環(huán)結(jié)構(gòu)的開始部分、即微衛(wèi)星區(qū)域的一部分與探針結(jié)合、一部分形成環(huán)結(jié)構(gòu)的 方式來設(shè)計(jì)探針。由此，預(yù)料之外的效果是，通過以微衛(wèi)星區(qū)域全部進(jìn)入環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)的方式來 設(shè)計(jì)探針，幾乎不生成非特異性反應(yīng)產(chǎn)物并且能夠利用重復(fù)數(shù)的差異而對(duì)重復(fù)數(shù)不同的變 異多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1表示關(guān)于9種T0MM40基因的poly-T鏈長(zhǎng)多態(tài)性利用電泳對(duì)由本發(fā)明的方法 得到的LH反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離的結(jié)果。
[0025] 圖2表示關(guān)于9種T0MM40基因的poly-T鏈長(zhǎng)多態(tài)性利用電泳對(duì)由現(xiàn)有的LH法 得到的LH反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離的結(jié)果。
[0026] 圖3表示關(guān)于3種T0MM40基因的長(zhǎng)鏈poly-T多態(tài)性利用電泳對(duì)由本發(fā)明的方法 得到的LH反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離的結(jié)果（3-a)、和利用電泳對(duì)由現(xiàn)有的LH法得到的LH反應(yīng)產(chǎn) 物進(jìn)行分離的結(jié)果（3-b和3-c)。
[0027] 圖4表示關(guān)于5種雄激素受體（AR)基因序列中的CAG重復(fù)多態(tài)性利用電泳對(duì)由 本發(fā)明的方法得到的LH反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離的結(jié)果。
[0028] 圖5表示關(guān)于8種雄激素受體（AR)基因序列中的CAG重復(fù)多態(tài)性利用電泳對(duì)由 現(xiàn)有的LH法得到的LH反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 「具有本發(fā)明的微下.星區(qū)域的DNA1
[0030] 本發(fā)明的微衛(wèi)星區(qū)域表示由通常1?6堿基、優(yōu)選1?3堿基作為一個(gè)單位并重 復(fù)而形成的重復(fù)堿基序列所構(gòu)成的區(qū)域。重復(fù)堿基序列中的作為重復(fù)基準(zhǔn)的一個(gè)單位的序 列（下文中簡(jiǎn)記為單位序列）的重復(fù)數(shù)（反復(fù)數(shù)）通常為2?100、優(yōu)選為5?100、更優(yōu) 選為5?50。但是，在重復(fù)堿基序列的單位序列為1堿基的情況下，其重復(fù)數(shù)至少為3以 上。這是因?yàn)?，本發(fā)明的雜交體中的環(huán)結(jié)構(gòu)有時(shí)也會(huì)僅由微衛(wèi)星區(qū)域構(gòu)成，因此若不至少為 3堿基以上則無法形成環(huán)結(jié)構(gòu)。作為該微衛(wèi)星區(qū)域的堿基數(shù)，通常為3?600堿基、優(yōu)選為 5?600堿基、更優(yōu)選為5?300堿基。作為上述微衛(wèi)星區(qū)域的具體序列，在重復(fù)堿基序列 的單位序列為1堿基的情況下，可以舉出P〇lyT、P〇lyA等；在為2堿基的情況下，可以舉出 由CA重復(fù)構(gòu)成的序列等；在為3堿基的情況下，可以舉出由CAG、CTG、CGG的重復(fù)構(gòu)成的序 列等。
[0031] 作為具有本發(fā)明的微衛(wèi)星區(qū)域的DNA(下文中有時(shí)簡(jiǎn)記為本發(fā)明的DNA)，只要是 具有上述微衛(wèi)星區(qū)域、且該微衛(wèi)星區(qū)域前后的通常5?1000堿基、優(yōu)選5?500堿基、更優(yōu) 選5?100堿基的堿基序列為已知的單鏈DNA，則可以為任意的DNA。其中，微衛(wèi)星區(qū)域更 優(yōu)選微衛(wèi)星區(qū)域的單位序列的重復(fù)數(shù)不同的DNA(多態(tài)性DNA)。作為具體的DNA，可以舉出 由動(dòng)物、微生物、細(xì)菌、植物等生物分離的基因組DNA片段；能夠由病毒分離的DNA片段；和 以mRNA為模板而合成的cDNA片段等，其中，作為優(yōu)選的例子可以舉出來自人細(xì)胞的癌基 因。另外，上述DNA的鏈長(zhǎng)（作為檢測(cè)對(duì)象的鏈長(zhǎng)）通常為13?2000堿基、優(yōu)選為13? 1000堿基、更優(yōu)選為13?200堿基。需要說明的是，如后所述本發(fā)明的探針是以特定的微 衛(wèi)星區(qū)域作為檢測(cè)對(duì)象所制作的，因此本發(fā)明的DNA可以具有作為檢測(cè)對(duì)象的微衛(wèi)星區(qū)域 以外的1個(gè)以上的微衛(wèi)星區(qū)域（第二微衛(wèi)星區(qū)域），作為第二微衛(wèi)星區(qū)域，優(yōu)選其單位序列 與作為檢測(cè)對(duì)象的微衛(wèi)星區(qū)域的單位序列不同。
[0032] 對(duì)于上述DNA，優(yōu)選盡可能純化，除去DNA片段以外的多余成分。具體來說，優(yōu)選根 據(jù)例如使用二氧化娃載體的Boom法（Boom et al. J. Clin. Microbiol. 28:495-503 (1990))、 使用碘化鈉溶液的方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76-2, p615-619 (1979))等常規(guī)方法進(jìn) 行純化。另外，也可以使用通過本身公知的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR反應(yīng)）、例如Nucleic Acids Research, 1991，Vol. 19, 3749、BioTechniques, 1994, Vol. 16, 1134-1137 中記載的方法將目 標(biāo)DNA擴(kuò)增而成的物質(zhì)。
[0033] 本發(fā)明的DNA形成雙鏈的情況下，利用通常該領(lǐng)域中進(jìn)行的加熱處理（90°C? 100°C )或堿處理（基于氫氧化鈉等的處理）等將雙鏈DNA單鏈化而得到本發(fā)明的DNA即 可。
[0034] 「本發(fā)明的探針1
[0035] 本發(fā)明的探針與上述本發(fā)明的DNA雜交而形成具有環(huán)結(jié)構(gòu)的雜交體，不具有與作 為檢測(cè)對(duì)象的微衛(wèi)星區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列。即，其是不與作為檢測(cè)對(duì)象的微衛(wèi)星區(qū)域結(jié)合、 而與微衛(wèi)星區(qū)域的兩側(cè)的堿基序列結(jié)合的堿基序列。例如，可以舉出從本發(fā)明的DNA中除 去了微衛(wèi)星區(qū)域后的序列的互補(bǔ)鏈、從具有本發(fā)明的微衛(wèi)星區(qū)域的DNA中除去了微衛(wèi)星區(qū) 域和其前后1?10堿基后的序列的互補(bǔ)鏈等。更具體來說，本發(fā)明的探針可以舉出下述序 列：按照從微衛(wèi)星區(qū)域的3'端起相鄰1?11堿基的堿基的互補(bǔ)堿基和從微衛(wèi)星區(qū)域的5' 端起相鄰1?11堿基的堿基的互補(bǔ)堿基結(jié)合的方式，使從微衛(wèi)星區(qū)域的3'端起向著具有 微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的3'端方向以相鄰1?11堿基的堿基起始的通常5?1000堿基、優(yōu)選 5?200堿基、更優(yōu)選5?100堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈；與從微衛(wèi)星區(qū)域的5'端起向著 具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的5'端方向以相鄰1?11堿基的堿基起始的通常5?1000堿基、 優(yōu)選5?200堿基、更優(yōu)選5?100堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈結(jié)合而成的序列。這樣的探 針在與本發(fā)明的DNA雜交時(shí)，形成具有環(huán)結(jié)構(gòu)的雜交體。該情況下，本發(fā)明的環(huán)結(jié)構(gòu)僅由微 衛(wèi)星區(qū)域構(gòu)成，或者由微衛(wèi)星區(qū)域和其兩側(cè)或一側(cè)的1?10堿基的堿基構(gòu)成。
[0036] 本發(fā)明的探針優(yōu)選下述序列：按照從微衛(wèi)星區(qū)域的3'端起相鄰1堿基的堿基的互 補(bǔ)堿基和從微衛(wèi)星區(qū)域的5'端起相鄰1堿基的堿基的互補(bǔ)堿基結(jié)合的方式，使從微衛(wèi)星區(qū) 域的3'端起向著具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的3'端方向以相鄰1堿基的堿基起始的通常5? 1000堿基、優(yōu)選5?200堿基、更優(yōu)選5?100堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈；與從微衛(wèi)星區(qū)域 的5'端起向著具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的5'端方向以相鄰1堿基的堿基起始的通常5? 1000堿基、優(yōu)選5?200堿基、更優(yōu)選5?100堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈結(jié)合而成的序列。 該情況下，本發(fā)明的環(huán)結(jié)構(gòu)僅由微衛(wèi)星區(qū)域構(gòu)成。
[0037] 需要說明的是，對(duì)于本發(fā)明的探針，在本發(fā)明的檢測(cè)方法中如后述那樣雜交體具 有突出末端的情況下，優(yōu)選進(jìn)行平滑末端化處理，因此不需要與由本發(fā)明的DNA的堿基序 列除去了微衛(wèi)星區(qū)域或微衛(wèi)星區(qū)域和與其相鄰的1?20堿基的堿基而成的全部堿基序列 結(jié)合。
[0038] 本發(fā)明的探針的鏈長(zhǎng)通常為10?2000堿基、優(yōu)選為10?1000堿基、更優(yōu)選為 10?200堿基。
[0039] 通過使用上述探針與上述本發(fā)明的DNA雜交，能夠形成在本發(fā)明的DNA上具有由 微衛(wèi)星區(qū)域、或者微衛(wèi)星區(qū)域和與其3'端或/和5'端相鄰的一側(cè)或兩側(cè)的1?10堿基的 堿基序列構(gòu)成的環(huán)結(jié)構(gòu)的雜交體。
[0040] 另外，本發(fā)明的DNA具有第二微衛(wèi)星區(qū)域的情況下，本發(fā)明的探針在雜交體形成 時(shí)可以與該第二微衛(wèi)星區(qū)域形成雙鏈，也可以使該第二微衛(wèi)星區(qū)域?yàn)榄h(huán)結(jié)構(gòu)。但是，該第 二微衛(wèi)星區(qū)域的任一單位序列與作為檢測(cè)對(duì)象的微衛(wèi)星區(qū)域的單位序列相同時(shí)，本發(fā)明的 探針優(yōu)選使該第二微衛(wèi)星區(qū)域?yàn)榄h(huán)結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)槟軌虮苊庖韵卢F(xiàn)象發(fā)生的可能性：發(fā)生 與和設(shè)計(jì)探針的重復(fù)序列不同的重復(fù)序列結(jié)合等的結(jié)合錯(cuò)誤，產(chǎn)生復(fù)數(shù)個(gè)非特異性反應(yīng)產(chǎn) 物。由該第二微衛(wèi)星區(qū)域形成的環(huán)結(jié)構(gòu)也優(yōu)選包含全部第二微衛(wèi)星區(qū)域，但若探針中不存 在與作為檢測(cè)對(duì)象的微衛(wèi)星區(qū)域相同的單位序列的互補(bǔ)鏈（互補(bǔ)堿基），則也可以僅包含 微衛(wèi)星區(qū)域的一部分。在使用這樣的探針時(shí)，所得到的雜交體形成復(fù)數(shù)個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0041] 「本發(fā)明的雜奪體1
[0042] 本發(fā)明的雜交體是使本發(fā)明的DNA與本發(fā)明的探針結(jié)合（雜交）而得到的，如上 述那樣在本發(fā)明的DNA上形成環(huán)結(jié)構(gòu)，并且該環(huán)結(jié)構(gòu)包含全部微衛(wèi)星區(qū)域。即，該雜交體由 2處雙鏈堿基部分和被它們夾持的（存在于它們之間的）單鏈堿基部分的環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)成。需 要說明的是，該雜交體可以具有突出末端，但由于有可能會(huì)對(duì)分離造成影響，因此優(yōu)選不具 有突出末端。在被2處雙鏈堿基部分夾持的部位，具有環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基鏈的相反側(cè)的堿基鏈 可以具有1?2堿基的單鏈堿基。另外，該雜交體也可以在具有環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基序列的相反 側(cè)進(jìn)一步形成其他環(huán)結(jié)構(gòu)，在雜交體的兩側(cè)具有環(huán)結(jié)構(gòu)。此外，本發(fā)明的DNA具有第二微 衛(wèi)星區(qū)域、其中的至少一個(gè)單位序列與作為檢測(cè)對(duì)象的微衛(wèi)星區(qū)域的單位序列相同的情況 下，優(yōu)選在本發(fā)明的DNA上進(jìn)一步形成由第二微衛(wèi)星區(qū)域的全部或一部分形成的環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0043] 上述環(huán)結(jié)構(gòu)由在基因組DNA上制作的不與探針雜交的（不形成堿基對(duì)的）單鏈堿 基鏈構(gòu)成，在雜交體中形成環(huán)狀的二次結(jié)構(gòu)（立體結(jié)構(gòu)）。該環(huán)結(jié)構(gòu)通常由3?600堿基、 優(yōu)選5?600堿基、更優(yōu)選5?300堿基構(gòu)成。
[0044] 上述2處雙鏈堿基部分各自獨(dú)立地由通常5?1000堿基對(duì)、優(yōu)選5?500堿基對(duì)、 更優(yōu)選5?100堿基對(duì)構(gòu)成。需要說明的是，該雙鏈堿基可以根據(jù)探針的種類和后述的LH 法的方式而具有突出末端。
[0045] 如上所述，本發(fā)明的雜交體在環(huán)結(jié)構(gòu)中包含全部微衛(wèi)星區(qū)域，因此在檢測(cè)微衛(wèi)星 區(qū)域不同的DNA多態(tài)性時(shí)，若使用相同的探針來形成雜交體，則所形成的環(huán)結(jié)構(gòu)的形狀、大 小、電荷等不同。因此，根據(jù)分子量的差異、分子結(jié)構(gòu)的差異或/和電荷的差異等將包含微 衛(wèi)星區(qū)域不同的DNA的雜交體分離，從而能夠以良好的精度對(duì)它們進(jìn)行分離識(shí)別?，F(xiàn)有的 LH法中的雜交體也形成了環(huán)結(jié)構(gòu)，但不是全部微衛(wèi)星區(qū)域包含在環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)，因此會(huì)產(chǎn)生目 標(biāo)雜交體以外的雜交體（非特異性反應(yīng)產(chǎn)物），這些非特異性反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)阻礙目標(biāo)雜交體 的檢測(cè)。雖然產(chǎn)生該非特異性反應(yīng)產(chǎn)物的理由不確定，但可以認(rèn)為：以探針與微衛(wèi)星區(qū)域的 一部分結(jié)合的方式包含與微衛(wèi)星區(qū)域的一部分互補(bǔ)的序列，因此在形成雜交體時(shí)，該探針 的互補(bǔ)序列與在微衛(wèi)星區(qū)域存在復(fù)數(shù)個(gè)的重復(fù)序列結(jié)合，其結(jié)果，形成具有不同環(huán)結(jié)構(gòu)的 各種雜交體（非特異性反應(yīng)產(chǎn)物）。即，可以推測(cè)：探針中的重復(fù)序列的互補(bǔ)序列和與所設(shè) 定的重復(fù)序列不同的重復(fù)序列結(jié)合，由此產(chǎn)生各種非特異性反應(yīng)產(chǎn)物。
[0046] 下面示出使用本發(fā)明的探針形成雜交體時(shí)本發(fā)明的雜交體的示意圖。即，該情況 下，結(jié)合與本發(fā)明的DNA的衛(wèi)星區(qū)域的兩側(cè)的堿基序列（A'和B'）互補(bǔ)的堿基序列（A和 B)而設(shè)計(jì)了探針。若利用該探針與本發(fā)明的DNA雜交，則微衛(wèi)星區(qū)域形成環(huán)結(jié)構(gòu)，形成具有 包含全部微衛(wèi)星區(qū)域的環(huán)結(jié)構(gòu)的雜交體。
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的方法，其通過下述步驟來檢測(cè)： (1) 使具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA和探針接觸，形成所述DNA和所述探針的雜交體，所述雜 交體具有包含微衛(wèi)星區(qū)域的環(huán)結(jié)構(gòu)，所述探針不具有與該微衛(wèi)星區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列而與 該微衛(wèi)星區(qū)域的兩側(cè)的堿基序列雜交； (2) 將所得到的雜交體分離出來； (3) 對(duì)該雜交體進(jìn)行檢測(cè)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，探針為以下序列：按照從微衛(wèi)星區(qū)域的3'端起相 鄰1?11喊基的喊基的互補(bǔ)喊基和從微衛(wèi)星區(qū)域的5'端起相鄰1?11喊基的喊基的互 補(bǔ)堿基結(jié)合的方式，使從微衛(wèi)星區(qū)域的3'端起向著具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的3'端方向以 相鄰1?11堿基的堿基起始的5?1000堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈、與從微衛(wèi)星區(qū)域的5' 端起向著具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的5'端方向以相鄰1?11堿基的堿基起始的5?1000 堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈結(jié)合而成的序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，探針為以下序列：按照從微衛(wèi)星區(qū)域的3'端起相 鄰1喊基的喊基的互補(bǔ)喊基和從微衛(wèi)星區(qū)域的5'端起相鄰1喊基的喊基的互補(bǔ)喊基結(jié)合 的方式，使從微衛(wèi)星區(qū)域的3'端起向著具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的3'端方向以相鄰1堿基 的喊基起始的5?1000喊基的喊基序列的互補(bǔ)鏈、與從微衛(wèi)星區(qū)域的5'端起向著具有微 衛(wèi)星區(qū)域的DNA的5'端方向以相鄰1喊基的喊基起始的5?1000喊基的喊基序列的互補(bǔ) 鏈結(jié)合而成的序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，微衛(wèi)星區(qū)域中，作為重復(fù)的基準(zhǔn)的一個(gè)單位的重復(fù) 數(shù)為2?100。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，微衛(wèi)星區(qū)域中，作為重復(fù)的基準(zhǔn)的一個(gè)單位的重復(fù) 數(shù)為5?100。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，分離雜交體的方法是基于分子量、分子結(jié)構(gòu)和電荷 中的至少1種進(jìn)行分離的方法。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，分離雜交體的方法為電泳法。 8. DNA和探針的雜交體，其是使具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA和探針接觸而具有包含微衛(wèi)星 區(qū)域的環(huán)結(jié)構(gòu)的所述DNA和所述探針的雜交體，所述探針不具有與該微衛(wèi)星區(qū)域互補(bǔ)的堿 基序列而與該微衛(wèi)星區(qū)域的兩側(cè)的堿基序列雜交。
9. 如權(quán)利要求8所述的雜交體，其中，探針為以下序列：按照從微衛(wèi)星區(qū)域的3'端起相 鄰1?11喊基的喊基的互補(bǔ)喊基和從微衛(wèi)星區(qū)域的5'端起相鄰1?11喊基的喊基的互 補(bǔ)堿基結(jié)合的方式，使從微衛(wèi)星區(qū)域的3'端起向著具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的3'端方向以 相鄰1?11堿基的堿基起始的5?1000堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈、與從微衛(wèi)星區(qū)域的5' 端起向著具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的5'端方向以相鄰1?11堿基的堿基起始的5?1000 堿基的堿基序列的互補(bǔ)鏈結(jié)合而成的序列。
10. 如權(quán)利要求8所述的雜交體，其中，探針為以下序列：按照從微衛(wèi)星區(qū)域的3'端起 相鄰1喊基的喊基的互補(bǔ)喊基和從微衛(wèi)星區(qū)域的5'端起相鄰1喊基的喊基的互補(bǔ)喊基結(jié) 合的方式，使從微衛(wèi)星區(qū)域的3'端起向著具有微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的3'端方向以相鄰1堿 基的喊基起始的5?1000喊基的喊基序列的互補(bǔ)鏈、與從微衛(wèi)星區(qū)域的5'端起向著具有 微衛(wèi)星區(qū)域的DNA的5'端方向以相鄰1喊基的喊基起始的5?1000喊基的喊基序列的互 補(bǔ)鏈結(jié)合而成的序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK104204203SQ201380015175
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月22日
【發(fā)明者】松隈章一, 石川友一, 黑澤龍雄 申請(qǐng)人:和光純藥工業(yè)株式會(huì)社, 地方獨(dú)立行政法人神奈川縣立醫(yī)院機(jī)構(gòu)