用于定量受驗(yàn)物質(zhì)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了用于定量由氨基酸代表的受驗(yàn)物質(zhì)的方法。該方法包括：使能夠轉(zhuǎn)化受驗(yàn)物質(zhì)并且亦能夠使用三磷酸腺苷(ATP)作為底物產(chǎn)生焦磷酸的酶作用于受驗(yàn)物質(zhì)，并產(chǎn)生焦磷酸的步驟；讓丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟。然后基于所獲得的丙酮酸的量確定受驗(yàn)物質(zhì)的量。根據(jù)本發(fā)明，可容易并迅速地定量來(lái)自于包含大量的各種雜質(zhì)例如無(wú)機(jī)磷酸和尿素的生物體的樣品中的氨基酸而不受雜質(zhì)影響。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于定量受驗(yàn)物質(zhì)的方法
[0001]與相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
本申請(qǐng)要求于2012年2月9日在日本專(zhuān)利局提交的日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?012-026534和于2012年3月26日在日本專(zhuān)利局提交的日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?012-069625的基礎(chǔ)上的公約優(yōu)選權(quán)。這些申請(qǐng)的全部公開(kāi)內(nèi)容結(jié)合到本申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用于定量焦磷酸的方法，包括允許焦磷酸與丙酮酸焦磷酸二激酶(PPDK)反應(yīng)，和定量作為產(chǎn)物的丙酮酸，其適用于包含三磷酸腺苷(ATP)和無(wú)機(jī)磷酸的反應(yīng)系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及用于定量甲硫氨酸、瓜氨酸或精氨酸的方法，包括允許甲硫氨酸同腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)、瓜氨酸同精氨基琥珀酸合成酶(ASS)或精氨酸同精氨酸脫亞胺酶(ADI)和ASS反應(yīng)，并通過(guò)前述用于定量焦磷酸的方法測(cè)量所產(chǎn)生的焦磷酸。
[0003]本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于測(cè)量樣品中氨基酸含量的方法，所述方法包括在氨酰-tRNA合成酶(AARS)和(氨酰-AMP)-AARS復(fù)合物分解試劑的存在下使氨基酸反應(yīng)，并定量產(chǎn)物。
[0004]本發(fā)明可用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域例如天生代謝異常的篩查、生化領(lǐng)域例如蛋白水解產(chǎn)物分析以及食品和化妝品相關(guān)領(lǐng)域例如食品和化妝品的成分分析等等。

【背景技術(shù)】
[0005]生物樣品包括血液中的氨基酸用作用于檢測(cè)各種疾病的標(biāo)記，從醫(yī)學(xué)角度來(lái)說(shuō)強(qiáng)烈需要開(kāi)發(fā)用于定量它們的方法。另外，用于使用酶定量氨基酸的方法具有顯示高選擇性并允許在溫和條件下快速定量的優(yōu)良特性，因此其被認(rèn)為是適于在實(shí)際醫(yī)學(xué)站點(diǎn)應(yīng)用于許多樣品的方法。特別地，已經(jīng)知道甲硫氨酸在高胱氨酸尿癥患者中以高濃度累積，并且甲硫氨酸用作這些患者的臨床普查的重要生物標(biāo)記。另外，瓜氨酸和精氨酸為尿素循環(huán)的代謝產(chǎn)物，用作尿素循環(huán)代謝異常包括瓜氨酸尿癥或精氨酸酶缺乏癥的生物標(biāo)記。用于定量這些氨基酸的簡(jiǎn)單且快速的方法也被期望應(yīng)用于用于檢測(cè)上述這些疾病的普查。
[0006]作為甲硫氨酸的酶定量方法，已知一種使用甲硫氨酸Y裂解酶的定量方法(非專(zhuān)利文獻(xiàn)I)，并且已知一種使用功能上修飾的苯丙氨酸脫氫酶的定量方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)I)對(duì)高胱氨酸尿癥的普查有效。然而，通過(guò)使用甲硫氨酸Y裂解酶的方法，氨也與甲硫氨酸一起被檢出。氨通常以20-50 μ M的濃度存在于血液中，這是一個(gè)等于或高于血液甲硫氨酸濃度的水平。而且，由于血液氨水平還被運(yùn)動(dòng)、蛋白攝入等等改變，基于以上方法的血液檢驗(yàn)大大受氨影響。而且，除甲硫氨酸外，甲硫氨酸Y裂解酶還顯示與含硫氨基酸例如半胱氨酸和高半胱氨酸的反應(yīng)性。因此，通過(guò)該定量方法，難以選擇性地定量包含這些含硫氨基酸的樣品中的甲硫氨酸。此外，由于功能上修飾的苯丙氨酸脫氫酶還顯示與除甲硫氨酸外的其它支鏈氨基酸的反應(yīng)性，因此用于除去支鏈氨基酸的預(yù)處理是需要的。
[0007]作為用于定量瓜氨酸的方法，已知一種包括使瓜氨酸與丁酮肟反應(yīng)并檢測(cè)產(chǎn)物顯色的方法(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。然而，由于尿素及其類(lèi)似化合物也類(lèi)似瓜氨酸反應(yīng)，該方法不能用于包含大量尿素的生物樣品。而且，其還具有其它問(wèn)題，例如，需要在酸性和高溫條件下孵育的復(fù)雜操作，并且由于其為終止反應(yīng)方法，不能監(jiān)測(cè)瞬時(shí)瓜氨酸產(chǎn)生。另外，尚未知任何用于使用酶定量瓜氨酸的方法。
[0008]作為用于定量精氨酸的酶方法，已知一種使用精氨酸酶和尿素酶的定量方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。由于在該定量方法中尿素和氨也與精氨酸一起被檢測(cè)，該方法不能用于包含它們的生物樣品。
[0009]作為用于定量焦磷酸的酶方法，存在一種用焦磷酸酶從焦磷酸產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸并通過(guò)各種檢測(cè)方法中的任一種定量無(wú)機(jī)磷酸的方法(1-a)。作為基于該原理的商業(yè)產(chǎn)品，PiPer焦磷酸測(cè)定試劑盒由Invitrogen出售，EnzChek焦磷酸測(cè)定試劑盒由Probe出售。然而，由于該測(cè)量方法還測(cè)出與焦磷酸一起的無(wú)機(jī)磷酸，該測(cè)量方法不能用于包含無(wú)機(jī)磷酸作為污染物的樣品。另外，作為用于定量焦磷酸的酶方法，還存在用ATP硫酸化酶或PPDK從焦磷酸產(chǎn)生ATP并通過(guò)各種檢測(cè)方法中的任一種定量ATP的方法(1-b)(專(zhuān)利文獻(xiàn)3和4) ο作為基于該原理的商業(yè)產(chǎn)品，PPiLight無(wú)機(jī)焦磷酸測(cè)定試劑盒由Lanza Rockland出售。對(duì)于該方法中ATP的檢測(cè)，使用了利用熒光素酶的發(fā)光方法或循環(huán)測(cè)定方法。然而，由于該原理，該方法不能用于包含ATP作為污染物的樣品，并且當(dāng)通過(guò)發(fā)光方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，隨時(shí)間流逝發(fā)光迅速衰退，因此此測(cè)量必須在嚴(yán)格的測(cè)量條件下使用昂貴的發(fā)光測(cè)量裝置進(jìn)行?；谘h(huán)測(cè)定法的檢測(cè)可以以高靈敏度進(jìn)行，但測(cè)量變得復(fù)雜，例如，監(jiān)測(cè)吸光度以嚴(yán)格計(jì)算反應(yīng)速率是必需的。此外，關(guān)于基于以上原理的測(cè)量，還已知一種使得能夠甚至在包含ATP的樣品中測(cè)量的改進(jìn)方法(參考專(zhuān)利文獻(xiàn)5)。然而，該方法使用進(jìn)行ATP移除作為預(yù)處理，然后定量焦磷酸的步驟。因此，該方法可用于其中從反應(yīng)系統(tǒng)除去ATP不引起任何問(wèn)題的情況，但其不能用于其中需要ATP存在的反應(yīng)系統(tǒng)。
[0010]此外，還已知用次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶從焦磷酸產(chǎn)生次黃嘌呤并定量次黃嘌呤的方法(1-C)(專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。此方法中使用的反應(yīng)底物不包含無(wú)機(jī)磷酸和ATP，因此該方法使得能夠測(cè)量焦磷酸而不受這些化合物的存在情況影響。然而，通過(guò)此方法，ATP不能響應(yīng)焦磷酸消耗而再生。
[0011]氨酰-tRNA合成酶(AARS)為通過(guò)使用一種特定的氨基酸、ATP和tRNA作為底物產(chǎn)生氨酰-tRNA、AMP和焦磷酸的酶。存在與各個(gè)構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸相應(yīng)的AARS。與各個(gè)構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸相應(yīng)的AARS后文中用氨基酸名連上“RS”表示。例如，與丙氨酸相應(yīng)的AARS表示為“AlaRS”，與半胱氨酸相應(yīng)的AARS表示為“CysRS”。
[0012]已知AARS對(duì)氨基酸顯示非常高的底物特異性。該酶催化的反應(yīng)由以下的兩步反應(yīng)組成。
[0013][方程式I]
(反座式 i)AARS={AMP)-AARS 復(fù)合物+焦《#鐵
(反應(yīng)式 2} {^St-AMP)-AARS I合物+tRNA=.氣聽(tīng)-tRNA+AJP--..AARS
+ (總反應(yīng)) Il基酸τ ΑΤΡ-? I RN A =氨釀-1 RNA- ATP->焦碳酸
從非專(zhuān)利文獻(xiàn)3等知道，如上述反應(yīng)式所示形成了 “(氨酰-AMP)-AARS復(fù)合物”，此復(fù)合物為剛性的，AARS在不存在tRNA的情況下仍然被捕獲在該復(fù)合物中，等等。非專(zhuān)利文獻(xiàn)3還描述，若將羥胺加入前述復(fù)合物中，該復(fù)合物分解產(chǎn)生氨基酸異羥肟酸和AMP。
[0014]非專(zhuān)利文獻(xiàn)4報(bào)道了一種用于定量氨基酸的方法，包括加入極小量的tRNA使樣品中的部分氨基酸按照前述反應(yīng)式I和2反應(yīng)。
[0015]專(zhuān)利文獻(xiàn)7和8報(bào)道了一種用于定量氨基酸的方法，包括僅允許樣品中一部分氨基酸類(lèi)似于前述反應(yīng)式I的反應(yīng)反應(yīng)，而不添加tRNA。
[0016]現(xiàn)有技術(shù)參考專(zhuān)利文獻(xiàn)
專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本專(zhuān)利未實(shí)審的公布(Kokai)號(hào)2008-86312，用于使用功能上修飾的苯丙氨酸脫氫酶分析生物樣品中的L-甲硫氨酸的方法。
[0017]專(zhuān)利文獻(xiàn)2:日本專(zhuān)利未實(shí)審的公布(Kokai)號(hào)8_336399，用于檢測(cè)精氨酸的方法和精氨酸傳感器。
[0018]專(zhuān)利文獻(xiàn)3:日本專(zhuān)利未實(shí)審的公布(Kokai)號(hào)2009-225784，用于測(cè)量焦磷酸的方法。
[0019]專(zhuān)利文獻(xiàn)4:日本專(zhuān)利未實(shí)審的公布(Kokai)號(hào)2007-097471，用于測(cè)定核苷酸序列的方法和試劑。
[0020]專(zhuān)利文獻(xiàn)5:日本專(zhuān)利未實(shí)審的公布(Kokai)號(hào)2006-187251，用于定量焦磷酸的方法。
[0021]專(zhuān)利文獻(xiàn)6:日本專(zhuān)利未實(shí)審的公布(Kokai)號(hào)2003-174900，用于定量焦磷酸和核酸的方法及其裝置。
[0022]專(zhuān)利文獻(xiàn)7:日本專(zhuān)利未實(shí)審的公布(Kokai)號(hào)2011-50357，用于分析氨基酸的方法和生物傳感器。
[0023]專(zhuān)利文獻(xiàn)8:日本專(zhuān)利未實(shí)審的公布(Kokai)號(hào)2006-166709，用于氨基酸分析的生物傳感裝置、用于氨基酸分析的生物傳感器和用于氨基酸分析的氨酰-tRNA合成酶。
[0024]非專(zhuān)利文獻(xiàn)
非專(zhuān)利文獻(xiàn) I:Research of psychosomatic disorders, Ministry of Health andWelfare (心身障礙研究，衛(wèi)生福利部)，1993, "Research on evaluat1n method of massscreening system (普查系統(tǒng)評(píng)估方法的研究)〃，第237-240頁(yè)(1993)
非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2:Boyde, T.R.& Rahmatullah Μ.(1980), Optimizat1n ofcondit1ns for the colorimetric determinat1n of ci trulline, usingdiacetylmonoxime (使用丁酮月虧比色測(cè)定瓜氨酸的條件的優(yōu)化)，Anal.B1chem.，107，424-431
非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3:Baldwin, A.N.& Berg, P.(1966)，Transfer ribonucleicacid-1nduced hydrolysis of valyl adenylate bound to isoleucyl ribonucleic acidsynthetase (轉(zhuǎn)移核糖核酸誘導(dǎo)的與異亮氨酰核糖核酸合成酶結(jié)合的纟顏氨酰腺苷酸的水解)，J.B1l.Chem.，241，839-845
非專(zhuān)利文獻(xiàn) 4:Forbes, C.D., Myung, J., Szewczak, A.A.& Landro, J.A.(2007), A high-throughput competitive scintillat1n proximity aminoacyl-tRNAsynthetase charging assay to measure amino acid concentrat1n (測(cè)量氛基酸濃度的高通量競(jìng)爭(zhēng)性閃爍迫近氨酰-tRNA合成酶負(fù)載測(cè)定法)，Anal.B1chem., 363，246-254發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明要達(dá)到的目標(biāo)
生物樣品(包括血漿)包含大量的各種各樣的污染物，包括無(wú)機(jī)磷酸和尿素，用于分析它們中所包含的受驗(yàn)物質(zhì)的方法需要不受這些污染物影響。
[0025]通過(guò)使用ATP與測(cè)量的受驗(yàn)物質(zhì)一起作為底物產(chǎn)生焦磷酸的酶非常有希望作為用于測(cè)量的酶，這是由于其高底物特異性和其基于ATP水解(此為放能反應(yīng))的高反應(yīng)性。基于ATP水解的高反應(yīng)性具體地描述為反應(yīng)可不可逆地前進(jìn)，反應(yīng)可以以高反應(yīng)速率前進(jìn)，可促進(jìn)甚至由于局部高能的缺點(diǎn)沒(méi)有ATP水解不能前進(jìn)的各種反應(yīng)，等等。而且，由于血液焦磷酸濃度在幾μΜ以下，大大低于以幾十至幾百μΜ級(jí)存在的氨基酸濃度，焦磷酸產(chǎn)生酶的使用具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即，即使樣品被檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)來(lái)源的焦磷酸污染，也幾乎不影響氨基酸的定量值。作為使用這樣的焦磷酸產(chǎn)生酶用于分析生物樣品的前提，定量焦磷酸是必需的，并且用于定量焦磷酸的方法需要滿(mǎn)足下列要求:
其可用于包含大量無(wú)機(jī)磷酸的生物樣品。
[0026]其可在用于與使用ATP作為底物的焦磷酸產(chǎn)生酶偶聯(lián)的ATP的存在下進(jìn)行。
[0027]其可從焦磷酸再生ΑΤΡ，避免酶促反應(yīng)產(chǎn)物的累積和底物的再生。
[0028]然而，還未知任何滿(mǎn)足這些要求的用于定量焦磷酸的方法，因此使用前述焦磷酸產(chǎn)生酶測(cè)量氨基酸還未實(shí)際進(jìn)行。
[0029]已知AARS對(duì)氨基酸顯示極高的底物特異性，而且其為有希望作為用于定量氨基酸的酶的酶。
[0030]非專(zhuān)利文獻(xiàn)4的定量方法為這樣一種方法，其包括混合樣品、ATP、tRNA和作為測(cè)量對(duì)象的放射性標(biāo)記氨基酸，然后允許AARS作用于該混合物，將所產(chǎn)生的氨酰-tRNA吸附在小珠上并測(cè)量其放射性以定量作為測(cè)量對(duì)象的氨基酸。在非專(zhuān)利文獻(xiàn)4的定量方法中，使用放射性同位素是不可避免的，這是因?yàn)樵摲椒ㄓ?jì)算摻入產(chǎn)物中的標(biāo)記氨基酸的存在比率。因此，該定量方法僅可在可以處理放射性同位素的環(huán)境中使用。而且，該定量方法還需要復(fù)雜的過(guò)程例如吸附在小珠上和從小珠分離。此外，在該定量方法中，tRNA以高達(dá)0.5mg/ml的高濃度作為最大濃度加入到反應(yīng)混合物中。然而，如果將該濃度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)于作為測(cè)量對(duì)象的氨基酸的tRNA摩爾濃度，計(jì)算為30 (Pg)/60 (μ1)/30，000 (g/mol)/20 = 0.8μΜ (假定tRNA的分子量為30，000，并且包含等量的與氨基酸相應(yīng)的20種tRNA)。所獲反應(yīng)產(chǎn)物的摩爾濃度低于前述濃度，并且不使用放射性同位素難以定量如此小量的化合物。因此,在這樣的如非專(zhuān)利文獻(xiàn)4添加tRNA的方法中，必須檢出極小量的反應(yīng)產(chǎn)物,可以說(shuō)使用放射性同位素是不可避免的。
[0031]專(zhuān)利文獻(xiàn)7和8的定量方法為包括僅使氨基酸、ATP和AARS反應(yīng)(該反應(yīng)條件后文將被稱(chēng)為“無(wú)tRNA添加的條件”)并檢測(cè)產(chǎn)物的方法。由于在這些定量方法中不使用tRNA,認(rèn)為前述反應(yīng)式2的反應(yīng)不能前進(jìn)。
[0032]在專(zhuān)利文獻(xiàn)7和8中，沒(méi)有討論如反應(yīng)式I中提到的(氨酰-AMP) -AARS復(fù)合物的存在，但其描述AARS催化下列反應(yīng)式I’的反應(yīng)。如果假定反應(yīng)如反應(yīng)式I’中所述前進(jìn)，并且平衡被打破使得反應(yīng)完全向右前進(jìn)，可認(rèn)為焦磷酸以與氨基酸相同的摩爾數(shù)產(chǎn)生，并且可通過(guò)定量焦磷酸定量氨基酸。然而，這兩篇發(fā)明專(zhuān)利均未提及不是反應(yīng)式I的反應(yīng)而是反應(yīng)式I’的反應(yīng)前進(jìn)這一描述的任何基礎(chǔ)。
[0033][方程式2]
(反應(yīng)式I’)氨基酸+ATP =氨酰-AMP+焦磷酸
本發(fā)明的發(fā)明人在如專(zhuān)利文獻(xiàn)7和8所述的無(wú)tRNA添加的條件下進(jìn)行了測(cè)量。然而，至少通過(guò)本發(fā)明的發(fā)明人所使用的檢測(cè)方法，不能檢測(cè)到顯著的焦磷酸產(chǎn)生(參考實(shí)施例
6、11，無(wú)羥胺添加的樣品)。認(rèn)為無(wú)顯著焦磷酸產(chǎn)生的原因?yàn)閷?shí)際發(fā)生的反應(yīng)不是前述反應(yīng)式I’的反應(yīng)，而是前述反應(yīng)式I的反應(yīng)。在反應(yīng)式I的反應(yīng)中，當(dāng)I摩爾氨基酸反應(yīng)，消耗I摩爾AARS用于形成復(fù)合物。因此，除非AARS以至少比樣品中氨基酸高的摩爾濃度加入到系統(tǒng)中，否則理論上不可能產(chǎn)生與樣品中氨基酸相同量的焦磷酸。
[0034]本發(fā)明的發(fā)明人在實(shí)施例6、11中所使用的反應(yīng)混合物中的AARS濃度為約9 μΜ,顯著低于氨基酸濃度。而且，專(zhuān)利文獻(xiàn)7、8和非專(zhuān)利文獻(xiàn)4中未描述AARS以高于作為測(cè)量對(duì)象的氨基酸的摩爾濃度加入到系統(tǒng)中。在專(zhuān)利文獻(xiàn)2中(段落
[0024])，定量0-100 μΜ氨基酸時(shí)的AARS濃度為10 μΜ,因此可以說(shuō)AARS沒(méi)有以高于氨基酸的濃度添加。因此，認(rèn)為以下是合理的:若假定反應(yīng)式I的反應(yīng)在專(zhuān)利文獻(xiàn)7和8的方法中前進(jìn)到最大程度，則樣品中僅極小部分氨基酸可用于該反應(yīng)并且產(chǎn)物也小量獲得。前述專(zhuān)利文獻(xiàn)中沒(méi)有顯示否定上述的任何數(shù)據(jù)。
[0035]如果與樣品中的氨基酸相比僅產(chǎn)生極小量的產(chǎn)物，則如專(zhuān)利文獻(xiàn)7中所使用的基于熒光方法、傳感器電極等這樣的高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)變得不可避免，并且用廣泛使用的檢測(cè)系統(tǒng)例如基于吸光度方法的那些進(jìn)行檢測(cè)變得不可能。而且，甚至當(dāng)使用高靈敏度檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，可導(dǎo)致各種問(wèn)題，例如靈敏度降低、測(cè)量值變化和背景值提高。
[0036]如上所述，使用AARS的已知氨基酸定量方法具有問(wèn)題，例如，其需要使用放射性同位素的復(fù)雜過(guò)程，以及僅樣品中極小部分氨基酸可反應(yīng)，因此它們沒(méi)有被廣泛使用。
[0037]用于達(dá)到本發(fā)明目標(biāo)的手段
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果焦磷酸與PPDK反應(yīng)并且所產(chǎn)生的丙酮酸與丙酮酸脫氫酶或丙酮酸氧化酶反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)焦磷酸的定量而不受無(wú)機(jī)磷酸或ATP存在的影響，并且能夠使ATP再生。
[0038]他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，如果甲硫氨酸與AdoMetS反應(yīng)，用前述焦磷酸定量系統(tǒng)測(cè)量所產(chǎn)生的焦磷酸，則可選擇性地定量甲硫氨酸而不用任何預(yù)處理，并實(shí)現(xiàn)了基于以上的甲硫氨酸定量系統(tǒng)。而且，他們還發(fā)現(xiàn)，如果瓜氨酸與ASS反應(yīng)，用前述焦磷酸定量系統(tǒng)測(cè)量所產(chǎn)生的焦磷酸，則可在溫和條件下選擇性地定量瓜氨酸，并實(shí)現(xiàn)了基于以上的瓜氨酸定量系統(tǒng)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，如果精氨酸與ADI反應(yīng)，用前述焦磷酸定量系統(tǒng)測(cè)量所產(chǎn)生的焦磷酸，則可選擇性定量精氨酸，并實(shí)現(xiàn)了基于以上的精氨酸定量系統(tǒng)。
[0039]本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在無(wú)tRNA添加的條件下AARS反應(yīng)混合物中未觀察到顯著的焦磷酸產(chǎn)生，但若加入分解(氨酰-AMP)-AARS復(fù)合物的試劑，焦磷酸以與樣品中氨基酸相等的量產(chǎn)生。因此，他們發(fā)現(xiàn)通過(guò)使反應(yīng)混合物中基本上所有量的氨基酸如前述反應(yīng)式I的復(fù)合物分解反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)可以以高靈敏度和小誤差定量氨基酸，并完成本發(fā)明。
[0040][I]用于定量受驗(yàn)物質(zhì)的方法，包括:
允許可通過(guò)使用三磷酸腺苷(ATP)作為底物并對(duì)受驗(yàn)物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生焦磷酸的酶作用于受驗(yàn)物質(zhì)以產(chǎn)生焦磷酸的步驟；允許丙酮酸焦磷酸二激酶(ProK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，和其中基于所獲得的丙酮酸的量確定受驗(yàn)物質(zhì)的量。
[0041][2] [I]的方法，其中所述受驗(yàn)物質(zhì)為氨基酸。
[0042][3]用于定量甲硫氨酸的方法，包括:
允許腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)在ATP的存在下作用于甲硫氨酸以產(chǎn)生腺苷甲硫氨酸和焦磷酸的步驟；
允許PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，
和
其中基于所獲得的丙酮酸的量確定甲硫氨酸的量。
[0043][4]用于定量瓜氨酸的方法，包括:
允許精氨基琥珀酸合成酶(ASS)在天冬氨酸和ATP的存在下作用于瓜氨酸以產(chǎn)生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步驟； 允許PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和
定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，
和
其中基于所獲得的丙酮酸的量確定瓜氨酸的量。
[0044][5]用于定量精氨酸的方法，包括:
允許精氨酸脫亞胺酶(ADI)作用于精氨酸以產(chǎn)生氨和瓜氨酸的步驟；
允許ASS作用于所產(chǎn)生的瓜氨酸以產(chǎn)生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步驟；
允許PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和
定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，
和
其中基于所獲得的丙酮酸的量確定精氨酸的量。
[0045][6]用于定量氨基酸的方法，包括:
允許與氨基酸相應(yīng)的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS復(fù)合物分解試劑的存在下作用于該氨基酸和ATP以獲得焦磷酸的步驟(A);和定量步驟(A)中所產(chǎn)生的焦磷酸的步驟(B)，和
其中步驟(B)包括允許PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；以及
定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，和
基于所獲得的丙酮酸的量確定所述氨基酸的量。
[0046][7] [6]的方法，其中所述復(fù)合物分解試劑為胺或負(fù)碳離子。
[0047][8] [7]的方法，其中所述復(fù)合物分解試劑為羥胺、肼或甲胺。
[0048][9] [6]_[8]中任一項(xiàng)的方法，所述方法在不存在tRNA的情況下進(jìn)行。
[0049][10] [6]_[9]中任一項(xiàng)的方法，所述方法用于定量一個(gè)樣品中的兩種或更多種氨基酸，并且包括步驟:
制備與作為定量對(duì)象的各個(gè)氨基酸相應(yīng)的AARS，
制備包含除AARS外的所需組分的反應(yīng)試劑， 混合反應(yīng)試劑與樣品，
將混合物至少分成與受驗(yàn)氨基酸的種類(lèi)數(shù)相應(yīng)的部分，和向所分成的部分中分別加入不同的AARS。
[0050][11] [6]-[10]中任一項(xiàng)的方法，其中AARS得自嗜熱生物，并且步驟(A)在50°C或更高的溫度下進(jìn)行。
[0051][12] [1]-[11]中任一項(xiàng)的方法，其中定量丙酮酸的步驟包括:
允許(i)乳酸脫氫酶、(?)丙酮酸氧化酶、(iii)丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶或(iv)丙酮酸脫羧酶和醛脫氫酶作用于丙酮酸的步驟。
[0052][13] [1]-[12]中任一項(xiàng)的方法，所述方法用于定量樣品中的受驗(yàn)物質(zhì)，其中所述樣品可包含ATP或磷酸。
[0053][14] [13]的方法，其中所述樣品得自血液。
[0054][15]用于[3]中定量甲硫氨酸的方法的試劑盒，包含單獨(dú)的ATP、AdoMetS, AMP、PEP和PPDK或上述物質(zhì)中的任意兩種或更多種物質(zhì)的混合物。
[0055][16]用于[4]中定量瓜氨酸的方法的試劑盒，包含單獨(dú)的ATP、ASS、AMP、PEP和PPDK或上述物質(zhì)中的任意兩種或更多種物質(zhì)的混合物。
[0056][17]用于[5]中定量精氨酸的方法的試劑盒，包含單獨(dú)的ATP、ASS、AD1、AMP、PEP和PPDK或上述物質(zhì)中的任意兩種或更多種物質(zhì)的混合物。
[0057][18]用于[6]中定量氨基酸的方法的試劑盒，包含單獨(dú)的ATP、AARS, AMP、PEP和PPDK或上述物質(zhì)中的任意兩種或更多種物質(zhì)的混合物。
[0058][19]用于定量氨基酸的方法，包括:
允許與氨基酸相應(yīng)的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS復(fù)合物分解試劑的存在下作用于該氨基酸和ATP以獲得反應(yīng)產(chǎn)物的步驟(A);和定量步驟(A)中所產(chǎn)生的產(chǎn)物的步驟(B)，和其中基于所獲得的產(chǎn)物的量確定所述氨基酸的量。
[0059]本發(fā)明還提供以下:
[I]用于定量焦磷酸的方法，包括:
允許丙酮酸焦磷酸二激酶(ProK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于焦磷酸以產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)、磷酸和丙酮酸的步驟，和定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，和其中基于所獲得的丙酮酸的量確定焦磷酸的量。
[0060][2] [I]的方法，其中定量丙酮酸的步驟包括:
允許(i)乳酸脫氫酶、(?)丙酮酸氧化酶、(iii)丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶或(iv)丙酮酸脫羧酶和醛脫氫酶作用于丙酮酸的步驟。
[0061][3] [I]的方法，其用于定量樣品中焦磷酸，并且其中所述樣品可包含ATP或磷酸。
[0062][4] [3]的方法，其中所述樣品得自血液。
[0063][5]用于定量受驗(yàn)物質(zhì)的方法，包括:
允許可通過(guò)使用ATP作為底物并對(duì)受驗(yàn)物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生焦磷酸的酶作用于受驗(yàn)物質(zhì)以產(chǎn)生焦磷酸的步驟；
允許PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和
定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，和其中基于所獲得的丙酮酸的量確定受驗(yàn)物質(zhì)的量。
[0064][6]用于定量甲硫氨酸的方法，包括:
允許腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)在ATP的存在下作用于甲硫氨酸以產(chǎn)生腺苷甲硫氨酸和焦磷酸的步驟；
允許PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和
定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，和其中基于所獲得的丙酮酸的量確定甲硫氨酸的量。
[0065][7]用于定量瓜氨酸的方法，包括:
允許精氨基琥珀酸合成酶(ASS)在天冬氨酸和ATP存在情況下作用于瓜氨酸以產(chǎn)生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步驟；
允許PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和
定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，和
其中基于所獲得的丙酮酸的量確定瓜氨酸的量。
[0066][8]用于定量精氨酸的方法，包括:
允許精氨酸脫亞胺酶(ADI)作用于精氨酸以產(chǎn)生氨和瓜氨酸的步驟；
允許ASS作用于所產(chǎn)生的瓜氨酸以產(chǎn)生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步驟；
允許PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和
定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，和
其中基于所獲得的丙酮酸的量確定精氨酸的量。
[0067][9]用于[6]中定量甲硫氨酸的方法的試劑盒，包含單獨(dú)的ATP、AdoMetS、AMP、PEP和PPDK或上述物質(zhì)中的任意兩種或更多種物質(zhì)的混合物。
[0068][10]用于[7]中定量瓜氨酸的方法的試劑盒，包含單獨(dú)的ATP、ASS、AMP、PEP和PPDK或上述物質(zhì)中的任意兩種或更多種物質(zhì)的混合物。
[0069][11]用于[8]中定量精氨酸的方法的試劑盒，包含單獨(dú)的ATP、ASS、AD1、AMP、PEP和PPDK或上述物質(zhì)中的任意兩種或更多種物質(zhì)的混合物。
[0070]本發(fā)明進(jìn)一步提供以下:
[I]用于定量氨基酸的方法，包括:
允許與氨基酸相應(yīng)的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS復(fù)合物分解試劑的存在下作用于該氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)以獲得反應(yīng)產(chǎn)物的步驟(A);和定量步驟(A)中所產(chǎn)生的產(chǎn)物的步驟(B)，和其中基于所獲得的產(chǎn)物的量確定所述氨基酸的量。
[0071][2] [I]的方法，所述方法在不存在tRNA的情況下進(jìn)行。
[0072][3] [I]或[2]的方法，其中所述復(fù)合物分解試劑為胺或負(fù)碳離子。
[0073][4] [3]的方法，其中所述復(fù)合物分解試劑為羥胺、肼或甲胺。
[0074][5] [1]-[4]中任一項(xiàng)的方法，其中所述產(chǎn)物在步驟(B)中通過(guò)測(cè)量吸光度定量。
[0075][6] [1]-[5]中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(B)中定量的產(chǎn)物為焦磷酸，并且焦磷酸的定量包括允許丙酮酸焦磷酸二激酶(PTOK)作用于焦磷酸的步驟。
[0076][7] [1]-[6]中任一項(xiàng)的方法，所述方法用于定量樣品中的氨基酸，并且所述樣品得自血液。
[0077][8] [1]-[7]中任一項(xiàng)的方法，所述方法用于定量一個(gè)樣品中的兩種或更多種氨基酸，并且包括步驟:
制備與作為定量對(duì)象的各個(gè)氨基酸相應(yīng)的AARS， 制備包含除AARS外的所需組分的反應(yīng)試劑，
混合反應(yīng)試劑與樣品，
將混合物至少分成與受驗(yàn)氨基酸的種類(lèi)數(shù)相應(yīng)的部分，和向所分成的部分中分別加入不同的AARS。
[0078][9] [1]-[8]中任一項(xiàng)的方法，其中AARS得自嗜熱生物，并且步驟(A)在50°C或更高的溫度下進(jìn)行。
[0079]發(fā)明效果
由于本發(fā)明用于定量焦磷酸的方法的定量能力不受無(wú)機(jī)磷酸或ATP存在的影響，所以其可在包含大量污染物的樣品例如血液中進(jìn)行。而且，由于使用了 PPDK，因此在與通過(guò)使用ATP作為底物產(chǎn)生焦磷酸的酶的偶聯(lián)系統(tǒng)中，ATP可從焦磷酸再生。根據(jù)本發(fā)明，反應(yīng)完成后系統(tǒng)顯示用于定量的信號(hào)強(qiáng)度僅小量變化，并且該系統(tǒng)使得能夠基于吸光度測(cè)量定量。因此，所述方法可方便地甚至在缺乏昂貴的專(zhuān)門(mén)用途的裝置例如發(fā)光檢測(cè)裝置的測(cè)量條件中進(jìn)行。
[0080]本發(fā)明的甲硫氨酸定量方法可針對(duì)包含除甲硫氨酸外的氨基酸或氨的樣品作為對(duì)象進(jìn)行而無(wú)需任何預(yù)處理。而且，由于其不是終止反應(yīng)方法，并且樣品中基本上全部的甲硫氨酸可作為相應(yīng)量的焦磷酸定量，因而能夠容易地監(jiān)測(cè)甲硫氨酸隨時(shí)間的產(chǎn)生。
[0081 ] 本發(fā)明的瓜氨酸定量方法可針對(duì)包含除瓜氨酸外的氨基酸或尿素的樣品作為對(duì)象進(jìn)行而無(wú)需任何預(yù)處理。而且，其不需要高溫孵育，使得能夠容易地監(jiān)測(cè)瓜氨酸隨時(shí)間的產(chǎn)生。
[0082]本發(fā)明的精氨酸定量方法可針對(duì)包含除精氨酸和瓜氨酸外的氨基酸、尿素或氨的樣品作為對(duì)象進(jìn)行而無(wú)需任何預(yù)處理。
[0083]與非專(zhuān)利文獻(xiàn)4中所述的定量方法相比，本發(fā)明使用AARS的定量方法顯示了下列無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。
[0084]-由于它們不使用放射性同位素及對(duì)其的檢測(cè)裝置，故其可用普通裝置在普通環(huán)境中使用。
[0085]-它們不需要復(fù)雜的過(guò)程例如酶促反應(yīng)后吸附在小珠上和從小珠分離以及反應(yīng)混合物與樣品的混合，因?yàn)闃悠房捎糜跍y(cè)量。
[0086]-鑒于即使除去吸附在小珠上和后續(xù)過(guò)程所需要的時(shí)間，非專(zhuān)利文獻(xiàn)4中所述的定量方法也需要2小時(shí)用于測(cè)量，本發(fā)明方法使能夠在約10分鐘內(nèi)測(cè)量。
[0087]與專(zhuān)利文獻(xiàn)7和8中所述的定量方法相比，本發(fā)明使用AARS的定量方法顯示下列無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。
[0088]-由于產(chǎn)物以與樣品中氨基酸的量相等的量獲得，使得能夠進(jìn)行高靈敏度和高精度定量。
[0089]-它們使得能夠用普通的吸光度測(cè)量而不使用任何熒光試劑或傳感器電極定量。
[0090]-鑒于專(zhuān)利文獻(xiàn)7和8中所述的定量方法分別需要40分鐘(專(zhuān)利文獻(xiàn)7，段落
[0075])和55分鐘(專(zhuān)利文獻(xiàn)8，段落
[0024])用于測(cè)量，本發(fā)明方法使得能夠在約10分鐘內(nèi)測(cè)量。
[0091]附圖簡(jiǎn)述
[圖1]圖1為顯示使用乳酸脫氫酶的情況下的焦磷酸校正曲線(xiàn)的曲線(xiàn)圖(用比色計(jì)測(cè)量)。
[0092][圖2]圖2為顯示使用乳酸脫氫酶的情況下的焦磷酸校正曲線(xiàn)的曲線(xiàn)圖(用酶標(biāo)儀測(cè)量)。
[0093][圖3]圖3為顯示使用丙酮酸氧化酶和顯色染料的情況下的焦磷酸校正曲線(xiàn)的曲線(xiàn)圖。
[0094][圖4]圖4為顯示使用丙酮酸氧化酶和熒光染料的情況下的焦磷酸校正曲線(xiàn)的曲線(xiàn)圖。
[0095][圖5]圖5為顯示用包含磷酸或ATP的反應(yīng)混合物建立的焦磷酸校正曲線(xiàn)的曲線(xiàn)圖。
[0096][圖6]圖6為顯示通過(guò)向生物樣品中加入焦磷酸所進(jìn)行的試驗(yàn)的結(jié)果的曲線(xiàn)圖。
[0097][圖7]圖7為顯示甲硫氨酸校正曲線(xiàn)的曲線(xiàn)圖。
[0098][圖8]圖8為顯示瓜氨酸校正曲線(xiàn)的曲線(xiàn)圖。
[0099][圖9]圖9為顯示精氨酸校正曲線(xiàn)的曲線(xiàn)圖。
[0100][圖10]圖10顯示加入不同濃度的羥胺(0、50、100、200、400、600、800和1000
mM)時(shí)Tyr定量反應(yīng)混合物的吸光度的瞬時(shí)變化。曲線(xiàn)圖中的數(shù)字(25、50、100和150)代表反應(yīng)混合物中的Tyr濃度(μΜ)。水平軸代表開(kāi)始測(cè)量后的時(shí)間，垂直軸代表吸光度與無(wú)Tyr添加的樣品所觀察到的吸光度相比的差異。結(jié)果通過(guò)對(duì)每個(gè)反應(yīng)混合物制備一個(gè)樣品并用其進(jìn)行測(cè)量來(lái)獲得。
[0101] [圖11]圖11顯示從測(cè)量開(kāi)始后20分鐘獲得的測(cè)量值建立的Tyr校正曲線(xiàn)。曲線(xiàn)圖中的數(shù)字(0、50、100、200、400、600、800和1000)代表用于各個(gè)校正曲線(xiàn)的羥胺濃度(mM)。對(duì)于包含200、400、600、800和1000 mM羥胺的樣品所獲得的結(jié)果，還繪制了初級(jí)近似線(xiàn)。
[0102][圖12]圖12顯示Tyr濃度與吸光度差異的相關(guān)系數(shù)的瞬時(shí)變化。曲線(xiàn)圖中的數(shù)字(0、50、100、200、400、600、800 和 1000)代表羥胺濃度(mM)。
[0103][圖13]圖13顯示通過(guò)使用得自于棲熱袍菌屬(Jhermotoga)的CysRS獲得的Cys校正曲線(xiàn)。
[0104][圖14]圖14顯示通過(guò)使用得自于棲熱袍菌屬的LysRS獲得的Lys校正曲線(xiàn)。
[0105][圖15]圖15顯示通過(guò)使用得自于棲熱袍菌屬的SerRS獲得的Ser校正曲線(xiàn)。
[0106][圖16]圖16顯示通過(guò)使用得自于棲熱袍菌屬的TyrRS獲得的Tyr校正曲線(xiàn)。
[0107][圖17]圖17顯示通過(guò)使用得自于棲熱菌屬(Jhernms)的TyrRS獲得的Tyr校正曲線(xiàn)。
[0108][圖18]圖18顯示通過(guò)使用鑰藍(lán)方法獲得的His校正曲線(xiàn)。
[0109][圖19]圖19顯示通過(guò)使用鑰藍(lán)方法獲得的Pro校正曲線(xiàn)。
[0110][圖20]圖20顯示通過(guò)使用鑰藍(lán)方法獲得的Trp校正曲線(xiàn)。
[0111][圖21]圖21顯示通過(guò)使用得自于棲熱菌屬的IleRS并在70°C進(jìn)行反應(yīng)獲得的Ile校正曲線(xiàn)。
[0112][圖22]圖22顯示通過(guò)使用得自于棲熱菌屬的MetRS并在70°C進(jìn)行反應(yīng)獲得的Met校正曲線(xiàn)。
[0113][圖23]圖23顯示通過(guò)使用得自于棲熱菌屬的TyrRS并在70°C進(jìn)行反應(yīng)獲得的Tyr校正曲線(xiàn)。
[0114][圖24]圖24顯示通過(guò)使用肼作為復(fù)合物分解試劑獲得的Tyr校正曲線(xiàn)。
[0115][圖25]圖25顯示通過(guò)使用甲胺作為復(fù)合物分解試劑獲得的Tyr校正曲線(xiàn)。
[0116]用于實(shí)施本發(fā)明的方式
本發(fā)明提供用于定量受驗(yàn)物質(zhì)的方法，受驗(yàn)物質(zhì)的典型實(shí)例包括氨基酸。本發(fā)明方法包括下列步驟:
允許可通過(guò)使用三磷酸腺苷(ATP)作為底物并對(duì)受驗(yàn)物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生焦磷酸的酶作用于受驗(yàn)物質(zhì)以產(chǎn)生焦磷酸的步驟；
允許丙酮酸焦磷酸二激酶(PI3DK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟。
[0117]此外，在本發(fā)明的方法中，受驗(yàn)物質(zhì)的量基于所獲得的丙酮酸的量確定。本發(fā)明的方法還具有這樣的特征，第一步反應(yīng)里消耗的ATP在檢測(cè)焦磷酸的同時(shí)再生。
[0118]作為通過(guò)使用ATP與受驗(yàn)物質(zhì)一起作為底物產(chǎn)生焦磷酸的酶，已經(jīng)知道多種不同的酶，并且根據(jù)EC分類(lèi)已注冊(cè)幾十種以上的酶。實(shí)例包括，例如，黃素腺嘌呤二核苷酸合成酶(FAD合成酶)、磷酸核酮糖激酶、鏈霉素3’ ’ -腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、生物素-CoA連接酶和乙酰乙酸-CoA連接酶。在本說(shuō)明書(shū)中，通過(guò)使用ATP與受驗(yàn)物質(zhì)一起作為底物產(chǎn)生焦磷酸的酶可通過(guò)舉例來(lái)說(shuō)明，特別是腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)、精氨基琥珀酸合成酶(ASS)、精氨酸脫亞胺酶(ADI)和氨酰-tRNA合成酶(AARS)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠理解的是，此說(shuō)明可適當(dāng)應(yīng)用于其它酶的使用。
[0119]通過(guò)使用ATP與受驗(yàn)物質(zhì)一起作為底物產(chǎn)生焦磷酸的酶可根據(jù)來(lái)源、存在位置(細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外等)、底物特異性和反應(yīng)特異性、活性位點(diǎn)、活性位點(diǎn)的殘基等等分類(lèi)。例如，雖然目前為止尚未知任何不含AARS的生物，但存在不含AdoMetS、ASS或ADI的生物。另外，AdoMetS和ASS與氨基酸的側(cè)鏈部分反應(yīng)，AARS與氨基酸的羧基反應(yīng)。
[0120]1.用于利用特別的焦磷酸定量方法定量氨基酸的方法
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了使用特別的用于定量焦磷酸的方法來(lái)定量甲硫氨酸的方法、定量瓜氨酸的方法和定量精氨酸的方法。
[0121]本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)受驗(yàn)物質(zhì)的“定量(定量化)”意指測(cè)量受驗(yàn)物質(zhì)的量，除非特別指明，并且該量可測(cè)量為絕對(duì)量，或可測(cè)量為樣品中的濃度。
[0122][用于定量焦磷酸的方法]
本發(fā)明用于定量焦磷酸的方法包括:
允許PPDK在金屬離子、AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟(1-A)，和
定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟(1-B)，和基于所獲得的丙酮酸的量確定焦磷酸的量。
[0123]步驟(1-A)可通過(guò)用PTOK、金屬離子、AMP和PEP孵育樣品中的焦磷酸來(lái)進(jìn)行。PPDK催化的反應(yīng)由下列反應(yīng)式表示。
[0124][式I]
焦磷酸+ PEP + AMP —丙酮酸+ ATP +磷酸
本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“磷酸”指無(wú)機(jī)磷酸(H3PO4),除非特別指明。磷酸還可被稱(chēng)為正磷酸。
[0125]用于本發(fā)明的PPDK不受來(lái)源、酶名稱(chēng)、EC編號(hào)、生產(chǎn)方法等限制，只要其為顯示對(duì)前述反應(yīng)的催化作用的酶。例如，得自丙酸桿菌屬{Prop1nibacteriuni)或熱變形菌屬(Jhermoproteus')的那些,更特別地，可優(yōu)選使用得自費(fèi)氏丙酸桿菌(Prop1nibacteriumfreudenreichii) (Pf)和附著熱變形菌(Jlwrmoproteusteimx) (Tt)的那些。Pf-來(lái)源的PPDK為充分研究的細(xì)菌來(lái)源的酶的一種。其優(yōu)勢(shì)在于可期望在大腸桿菌(Bscherichiacoli)表達(dá)系統(tǒng)中大量表達(dá)，其可作為與甘油的混合物在4°C穩(wěn)定貯存，并且甚至反復(fù)凍融后不顯示活性顯著降低。由于Tt為超級(jí)嗜熱生物，Tt-來(lái)源的PPDK在這些方面占優(yōu)勢(shì):可期望其能在常溫下純化，并且甚至在高溫時(shí)其不變性且可用。更特別地，可優(yōu)選使用得自費(fèi)氏丙酸桿菌亞種NBRC 12426菌株或附著熱變形菌NBRC 100435菌株的酶。
[0126]所使用的PPDK的量無(wú)特別限制，只要其使得能夠進(jìn)行本發(fā)明的焦磷酸定量，并且其可適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)樣品中包含的焦磷酸的量、使用的裝置、PPDK純度和類(lèi)型決定。所使用的PPDK的量，就最低量而言，優(yōu)選0.001 U/ml或更多、更優(yōu)選0.005 U/ml或更多、還更優(yōu)選0.01 U/ml或更多。無(wú)論如何，就最大量而言，所述量?jī)?yōu)選10 U/ml或更低、更優(yōu)選5 U/ml或更低、還更優(yōu)選I U/ml或更低。
[0127]步驟(1-A)在AMP的存在下進(jìn)行。存在的AMP濃度，就最小濃度而言，為0.01 mM或更高、更優(yōu)選0.025 mM或更高、還更優(yōu)選0.05 mM或更高。此外，無(wú)論如何，就最大濃度而言，優(yōu)選20 mM或更低、更優(yōu)選10 mM或更低、還更優(yōu)選5 mM或更低。
[0128]步驟(1-A)還在高能磷酸化合物例如PEP的存在下進(jìn)行。存在的PEP濃度，就最小濃度而言，優(yōu)選0.01 mM或更高、更優(yōu)選0.025 mM或更高、還更優(yōu)選0.05 mM或更高。而且，無(wú)論如何，就最大濃度而言，優(yōu)選20 mM或更低、更優(yōu)選10 mM或更低、還更優(yōu)選5 mM或更低。
[0129]步驟(1-A)優(yōu)選在金屬離子的存在下進(jìn)行。所述金屬離子可為鎂離子、鈷離子和錳離子中的任一種，并且優(yōu)選鎂離子。所使用的金屬離子的量，就最小量而言，在例如鎂離子的情況下，優(yōu)選AMP濃度的0.1當(dāng)量或更多、更優(yōu)選AMP濃度的0.2當(dāng)量或更多、還更優(yōu)選AMP濃度的0.4當(dāng)量或更多。而且，無(wú)論如何，就最大量而言，優(yōu)選10當(dāng)量或更低、更優(yōu)選5當(dāng)量或更低、還更優(yōu)選2.5當(dāng)量或更低。最優(yōu)選的量為磷酸供體的0.5-2當(dāng)量，例如，I
=I里。
[0130]在步驟(1-B)中，反應(yīng)系統(tǒng)中的丙酮酸被定量，并且其可通過(guò)使用例如乳酸脫氫酶反應(yīng)定量。乳酸脫氫酶為一種分布在廣泛范圍的生物中的酶，并且催化下列反應(yīng)。
[0131][式2]
丙酮酸+ NADH —乳酸+ NAD+
對(duì)于本發(fā)明，可使用得自于各種生物的乳酸脫氫酶。例如，得自兔子、豬、牛、家禽、乳酸菌或酵母的多種乳酸脫氫酶已在市場(chǎng)出售，并且可優(yōu)選使用這些中的任一種。
[0132]所使用的乳酸脫氫酶的量無(wú)特別限制，只要使得能夠進(jìn)行本發(fā)明焦磷酸的定量，并且可適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)樣品包含的焦磷酸的量、使用的裝置、酶純度和類(lèi)型決定。所使用的酶量，就最小量而言，優(yōu)選0.002 U/ml或更多、更優(yōu)選0.005 U/ml或更多、還更優(yōu)選0.01 U/ml或更多。此外,無(wú)論如何,就最大量而言,優(yōu)選4 U/ml或更低、更優(yōu)選2 U/ml或更低、還更優(yōu)選I U/ml或更低。
[0133]此外， 步驟(1-B)還在NADH的存在下進(jìn)行。NADH濃度的影響比較顯著。例如，如果NADH濃度過(guò)度低，則吸光度的檢測(cè)變得困難，如果其過(guò)度高，其減少量的測(cè)量值的精確度降低。存在的NADH的量，就最小濃度而言，優(yōu)選0.01 mM或更高、更優(yōu)選0.02 mM或更高、還更優(yōu)選0.05 mM或更高。無(wú)論如何,就最大濃度而言,優(yōu)選4 mM或更低、更優(yōu)選2 mM或更低、還更優(yōu)選I mM或更低。
[0134]在使用乳酸脫氫酶的系統(tǒng)中，丙酮酸的產(chǎn)量通過(guò)測(cè)量340 nm處的吸光度測(cè)量NADH量的減少來(lái)計(jì)算，NADH的量隨反應(yīng)前進(jìn)減少。
[0135]使用乳酸脫氫酶的步驟(1-B)可與步驟(1-A)在同一系統(tǒng)中同時(shí)前進(jìn)。盡管反應(yīng)溫度適當(dāng)?shù)乜紤]所使用酶的最佳溫度等決定，反應(yīng)可適當(dāng)?shù)卦谑覝刂?7°C，例如30°C的溫度下進(jìn)行。盡管反應(yīng)時(shí)間可適當(dāng)?shù)乜紤]試驗(yàn)樣品中含有的焦磷酸的量等決定，但反應(yīng)迅速前進(jìn)，樣品中基本上全部量的焦磷酸可在20分鐘內(nèi)，例如約7-13分鐘內(nèi)用于NADH的氧化。若需要，這些步驟可在適當(dāng)?shù)木彌_液例如20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)中進(jìn)行。上述系統(tǒng)中的組分濃度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)確定，例如，其可在下列范圍內(nèi)。
[0136]MgCl2:0.5-50 mM
PEP:0.05-5 mM
AMP:0.05-5 mM
NADH:0.05-1 mM
PPDK:0.01-1 U/ml
乳酸脫氫酶:0.01-1 U/ml
在使用乳酸脫氫酶反應(yīng)的實(shí)施方案中，可定量至少0-200 μΜ范圍內(nèi)的焦磷酸。
[0137]步驟(1-B)也可在過(guò)氧化氫檢測(cè)系統(tǒng)中通過(guò)使用丙酮酸氧化酶催化的反應(yīng)進(jìn)行。
[0138]丙酮酸氧化酶催化下列反應(yīng)。
[0139][式3]
丙酮酸+磷酸+ O2 + H2O —乙酰磷酸+ 二氧化碳+ H2O2
可用于本發(fā)明的丙酮酸氧化酶無(wú)特別限制，可優(yōu)選使用得自不同類(lèi)型的生物的那些，例如，得自假單胞菌屬{Pseudomonas、的那些。
[0140]所使用的丙酮酸氧化酶的量無(wú)特別限制，只要使得能夠進(jìn)行本發(fā)明的焦磷酸定量，并且可適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)樣品中包含的焦磷酸的量、使用的裝置、酶的純度和類(lèi)型決定。所使用的酶量，就最小量而言，優(yōu)選0.03 U/ml或更多、更優(yōu)選0.07 U/ml或更多、還更優(yōu)選0.15U/ml或更多。無(wú)論如何,就最大量而言,優(yōu)選60 U/ml或更少、更優(yōu)選30 U/ml或更少、還更優(yōu)選15 U/ml或更少。
[0141]由丙酮酸氧化酶作用所產(chǎn)生的過(guò)氧化氫可通過(guò)已知的方法，例如通過(guò)使用過(guò)氧化物酶反應(yīng)定量。所述過(guò)氧化物酶可為任何可用于定量過(guò)氧化氫的過(guò)氧化物酶，并且其實(shí)例包括辣根來(lái)源的過(guò)氧化物酶。
[0142]所使用的過(guò)氧化物酶的量無(wú)特別限制，只要使得能夠進(jìn)行本發(fā)明的焦磷酸定量，并且可適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)樣品中包含的焦磷酸的量、使用的裝置、酶的純度和類(lèi)型決定。所使用的酶量，就最小量而言，優(yōu)選0.03 U/ml或更多、更優(yōu)選0.07 U/ml或更多、還更優(yōu)選0.15 U/ml或更多。無(wú)論如何,就最大量而言,優(yōu)選300 U/ml或更少、更優(yōu)選150 U/ml或更少、還更優(yōu)選75 U/ml或更少。
[0143]另外,作為與過(guò)氧化物酶反應(yīng)的電子受體,可使用可用作所使用的過(guò)氧化物酶的底物的任何顯色劑或熒光劑。顯色劑的實(shí)例包括，例如，4-氨基安替比林:苯酚等。伴隨辣根來(lái)源的過(guò)氧化物酶，過(guò)氧化氫與前述顯色劑如下所示反應(yīng)，并且作為產(chǎn)物的醌亞胺染料可通過(guò)在505 nm處測(cè)量吸光值檢測(cè)。
[0144][式4]
2H20 + 4-氨基安替比林+苯酌.一醌亞胺染料+ 4H20
此外，與過(guò)氧化物酶反應(yīng)的熒光劑的實(shí)例包括10-乙?；?3，7- 二羥基吩噁嗪(ADHP)等。伴隨辣根來(lái)源的過(guò)氧化物酶，過(guò)氧化氫與ADHP反應(yīng)產(chǎn)生突光物質(zhì)試鹵靈(resorufin),并且其可基于590 nm處的熒光(激發(fā)，530 nm)檢測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)使用的過(guò)氧化酶類(lèi)型適當(dāng)?shù)剡x擇顯色劑和熒光劑例如，4-氨基安替比林和ADHP。此外，檢測(cè)波長(zhǎng)也可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)使用的顯色劑或熒光劑類(lèi)型適當(dāng)?shù)剡x擇。
[0145]使用丙酮酸氧化酶的步驟(1-B)也可與步驟(1-A)在同一系統(tǒng)中同時(shí)前進(jìn)。盡管反應(yīng)溫度考慮所使用酶的最佳溫度等適當(dāng)決定，但反應(yīng)可適當(dāng)?shù)卦谑覝刂?7°C，例如30°C的溫度下進(jìn)行。盡管反應(yīng)時(shí)間可考慮試驗(yàn)樣品中包含的焦磷酸的量適當(dāng)決定，但反應(yīng)迅速前進(jìn)，樣品中基本上全部量的焦磷酸可在20分鐘內(nèi)，例如約7-13分鐘內(nèi)用于產(chǎn)生過(guò)氧化氫。若需要，這些步驟可在適當(dāng)?shù)木彌_液例如20 mM咪唑-HCl (pH 7.0)中進(jìn)行。
[0146]當(dāng)所有的步驟在同一系統(tǒng)中通過(guò)使用4-氨基安替比林和苯酚進(jìn)行時(shí)，組分的濃度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卮_定，并且例如，其可在下列范圍內(nèi)。
[0147]MgCl2:2.5-250 mM
NH4Cl:1-100 mM
PEP:0.05-5 mM
AMP:0.05-5 mM
PPDK:0.01-1 U/ml
4-氨基安替比林:0.1-10 mM
苯酚:0.1-10 mM丙酮酸氧化酶:0.15-15 U/ml 過(guò)氧化物酶:0.15-75 U/ml
在使用4-氨基安替比林和苯酚的實(shí)施方案中，可定量至少0-200 μΜ范圍內(nèi)的焦磷酸。
[0148]當(dāng)所有的步驟在同一系統(tǒng)中通過(guò)使用ADHP進(jìn)行時(shí)，組分的濃度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卮_定，并且例如，其可在下列范圍內(nèi)。
[0149]MgCl2:0.5-50 mM
NH4Cl:1-100 mM
PEP:0.05-5 mM
AMP:0.05-5 mM
PPDK:0.01-1 U/ml
Na-PO4:0.05-5 mM
ADHP:50 μΜ
丙酮酸氧化酶:0.15-15 U/ml 過(guò)氧化物酶:0.15-75 U/ml
在使用ADHP的實(shí)施方案中，可定量至少0-10 μΜ范圍內(nèi)的焦磷酸。根據(jù)此實(shí)施方案，可測(cè)量痕量的焦磷酸。
[0150]步驟(1-B)還可為在這樣的系統(tǒng)中進(jìn)行的步驟，所述系統(tǒng)經(jīng)構(gòu)建使得除兩種前述酶外丙酮酸還與顯色劑例如2，4- 二硝基苯肼反應(yīng)，并測(cè)量產(chǎn)物的吸光度。值得推薦的是關(guān)注該系統(tǒng)用除丙酮酸外的2-含氧酸可同樣顯色這一事實(shí)。步驟(1-B)還可在經(jīng)構(gòu)建使得通過(guò)使用丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶檢測(cè)NADH的減少的系統(tǒng)中進(jìn)行。此外，其還可為在經(jīng)構(gòu)建使得通過(guò)使用丙酮酸脫羧酶和乙醛脫氫酶檢測(cè)NADH產(chǎn)生的系統(tǒng)中進(jìn)行的步驟。進(jìn)行這些步驟所需的條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)。
[0151]本發(fā)明用于定量焦磷酸的方法可甚至在焦磷酸或ATP的存在下進(jìn)行。此外，其具有可產(chǎn)生ATP這一優(yōu)點(diǎn)。作為用于定量焦磷酸的常規(guī)方法，存在用焦磷酸酶從焦磷酸產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸并通過(guò)各種檢測(cè)方法中的任一種定量無(wú)機(jī)磷酸的方法(1-a)、用ATP硫酸化酶或PPDK從焦磷酸產(chǎn)生ATP并通過(guò)各種檢測(cè)方法中的任一種定量ATP的方法(1-b)和用次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶從焦磷酸產(chǎn)生次黃嘌呤并定量次黃嘌呤的方法(1-c)，但它們不具有如上所述的特征。
[0152]本發(fā)明方法和常規(guī)方法的特征在下表中概括給出。
[0153][表 I]

【權(quán)利要求】
1.用于定量受驗(yàn)物質(zhì)的方法，包括: 允許可通過(guò)使用三磷酸腺苷(ATP)作為底物并對(duì)受驗(yàn)物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生焦磷酸的酶作用于受驗(yàn)物質(zhì)以產(chǎn)生焦磷酸的步驟； 允許丙酮酸焦磷酸二激酶(PI3DK)在一磷酸腺苷(AMP)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，和其中基于所獲得的丙酮酸的量確定受驗(yàn)物質(zhì)的量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述受驗(yàn)物質(zhì)為氨基酸。
3.用于定量甲硫氨酸的方法，包括: 允許腺苷甲硫氨酸合成酶(AdoMetS)在ATP的存在下作用于甲硫氨酸以產(chǎn)生腺苷甲硫氨酸和焦磷酸的步驟； 允許PPDK在AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟， 和 其中基于所獲得的丙酮酸的量確定甲硫氨酸的量。
4.用于定量瓜氨酸的方法，包括: 允許精氨基琥珀酸合成酶(ASS)在天冬氨酸和ATP的存在下作用于瓜氨酸以產(chǎn)生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步驟； 允許PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和 定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟， 和 其中基于所獲得的丙酮酸的量確定瓜氨酸的量。
5.用于定量精氨酸的方法，包括: 允許精氨酸脫亞胺酶(ADI)作用于精氨酸以產(chǎn)生氨和瓜氨酸的步驟； 允許ASS作用于瓜氨酸以產(chǎn)生AMP、精氨基琥珀酸和焦磷酸的步驟； 允許PPDK在AMP和PEP 的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；和 定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟， 和 其中基于所獲得的丙酮酸的量確定精氨酸的量。
6.用于定量氨基酸的方法，包括: 允許與所述氨基酸相應(yīng)的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP) -AARS復(fù)合物分解試劑的存在下作用于所述氨基酸和ATP以獲得焦磷酸的步驟(A);和定量步驟(A)中所產(chǎn)生的焦磷酸的步驟(B)，和 其中步驟(B)包括允許PPDK在AMP和PEP的存在下作用于所產(chǎn)生的焦磷酸以產(chǎn)生ATP、磷酸和丙酮酸的步驟；以及 定量所產(chǎn)生的丙酮酸的步驟，和基于所獲得的丙酮酸的量確定所述氨基酸的量。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述復(fù)合物分解試劑為胺或負(fù)碳離子。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述復(fù)合物分解試劑為羥胺、肼或甲胺。
9.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的方法，所述方法在不存在tRNA的情況下進(jìn)行。
10.權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的方法，所述方法用于定量一個(gè)樣品中的兩種或更多種氨基酸，并且包括步驟: 配制與作為定量對(duì)象的各個(gè)氨基酸相應(yīng)的AARS， 配制包含除AARS外的所需組分的反應(yīng)試劑， 混合反應(yīng)試劑與樣品， 將混合物至少分成與受驗(yàn)氨基酸的種類(lèi)數(shù)相應(yīng)的部分，和 向所分成的部分中分別加入不同的AARS。
11.權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)的方法，其中AARS得自嗜熱生物，并且步驟(A)在50°C或更高的溫度下進(jìn)行。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中定量丙酮酸的步驟包括: 允許(i)乳酸脫氫酶、(?)丙酮酸氧化酶、(iii)丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶或(iv)丙酮酸脫羧酶和醛脫氫酶作用于丙酮酸的步驟。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，所述方法用于定量樣品中的受驗(yàn)物質(zhì)，其中所述樣品可包含ATP或磷酸。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述樣品得自血液。
15.用于權(quán)利要求3的定量甲硫氨酸的方法的試劑盒，包含單獨(dú)的ATP、AdoMetS、AMP、PEP和PPDK或上述物質(zhì)中的任意兩種或更多種物質(zhì)的混合物。
16.用于權(quán)利要求4的定量瓜氨酸的方法的試劑盒，包含單獨(dú)的ATP、ASS、AMP、PEP和PPDK或上述物質(zhì)中的任意兩種或更多種物質(zhì)的混合物。
17.用于權(quán)利要求5的定量精氨酸的方法的試劑盒，包含單獨(dú)的ATP、ASS、AD1、AMP、PEP和PPDK或上述物質(zhì)中的任意兩種或更多種物質(zhì)的混合物。
18.用于權(quán)利要求6的定量氨基酸的方法的試劑盒，包含單獨(dú)的ATP、AARS、AMP、PEP和PPDK或上述物質(zhì)中的任意兩種或更多種物質(zhì)的混合物。
19.用于定量氨基酸的方法，包括: 允許與所述氨基酸相應(yīng)的氨酰-tRNA合成酶(AARS)在(氨酰-AMP)-AARS復(fù)合物分解試劑的存在下作用于所述氨基酸和ATP以獲得反應(yīng)產(chǎn)物的步驟(A);和 定量步驟(A)中所產(chǎn)生的產(chǎn)物的步驟(B)，和 其中基于所獲得的產(chǎn)物的量確定所述氨基酸的量。
【文檔編號(hào)】C12Q1/25GK104136627SQ201380008746
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2013年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月9日
【發(fā)明者】淺野泰久, 龜谷將史 申請(qǐng)人:富山縣政府, 味之素株式會(huì)社