一種spf小鼠病原菌核酸熒光定量pcr聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。目的是提供的檢測(cè)試劑盒應(yīng)可同時(shí)對(duì)四種常見SPF動(dòng)物攜帶病原進(jìn)行檢測(cè)；提供的方法具有操作簡單、檢測(cè)快速的特點(diǎn)。技術(shù)方案是：一種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒，包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混體系以及ddH2O，該試劑盒還包括針對(duì)4種病原菌的4對(duì)特異性引物；特異性引物如下：金黃色葡萄球菌；肺炎克雷伯菌；沙門氏菌；綠膿桿菌。一種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)方法，按以下步驟進(jìn)行：（1）提取樣品DNA；（2）以樣品DNA為模板，進(jìn)行聯(lián)合PCR檢測(cè)；（3）反應(yīng)產(chǎn)物置于定量PCR儀進(jìn)行熒光檢測(cè)。
【專利說明】—種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種SPF小鼠病原菌熒光定量聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒，可應(yīng)用于SPF小鼠病原菌攜帶的實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和重要支撐條件，也是藥品生產(chǎn)檢測(cè)和新藥研究的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按其微生物、寄生蟲控制程度，可劃分為四個(gè)等級(jí)，即普通動(dòng)物、清潔動(dòng)物、無特定病原體動(dòng)物(SPF動(dòng)物)和無菌動(dòng)物。SPF動(dòng)物是國際上公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，適用于所有科研實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否達(dá)到了 SPF級(jí)別，其重要的評(píng)價(jià)手段就是微生物和寄生蟲質(zhì)量控制，必須建立一套完整的微生物和寄生蟲檢測(cè)體系，來確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不攜帶有應(yīng)排除的病原體 。
[0003]研究發(fā)現(xiàn)，目前我國商品化SPF小鼠的細(xì)菌污染主要包括肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和綠膿桿菌。通過采用生物信息學(xué)分析手段分析上述病原菌的特異性基因靶點(diǎn)，基于特異性保守基因片段建立病原菌核酸熒光定量聯(lián)合快速檢測(cè)方法，可以為SPF小鼠的相關(guān)病原菌攜帶情況調(diào)查提供分子生物學(xué)檢測(cè)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒；該檢測(cè)試劑盒應(yīng)可同時(shí)對(duì)四種常見SPF動(dòng)物攜帶病原進(jìn)行檢測(cè)，并具有檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、使用方便的特點(diǎn)。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供一種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)方法，該方法具有操作簡單、檢測(cè)快速的特點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒，包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混體系以及ddH20 (重蒸水);其特征在于該試劑盒還包括針對(duì)4種病原菌的4對(duì)特異性引物；所述特異性引物序列如下:
[0008]金黃色葡萄球菌:
【權(quán)利要求】
1.一種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒，包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混體系以及ddH20 ;其特征在于該試劑盒還包括針對(duì)4種病原菌的4對(duì)特異性引物；所述特異性引物序列如下: 金黃色葡萄球菌:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述熒光定量PCR預(yù)混體系的濃度為2X。
3.—種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)方法，按以下步驟進(jìn)行: (1)提取待測(cè)樣品DNA; (2)以待測(cè)樣品DNA為模板，4對(duì)特異性引物與熒光定量PCR預(yù)混體系以及ddH20混合后分別配制成4個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行聯(lián)合PCR檢測(cè)； (3)反應(yīng)產(chǎn)物置于定量PCR儀進(jìn)行熒光檢測(cè)；選擇熒光檢測(cè)模式為SYBR熒光，基線調(diào)整取3~15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；PCR反應(yīng)熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長，同時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線顯示為單峰的特異性檢測(cè)體系判斷為陽性，即待測(cè)樣品含有相應(yīng)的病原細(xì)菌；若無典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(2)中PCR反應(yīng)體系中各成分的終濃度如下:熒光定量PCR預(yù)混體系使用濃度為IX 各特異性引物的上游與下游引物的濃度為IOpmol/μ 1，使用量I μ I/反應(yīng) DNA模板使用量5 μ I/反應(yīng) ddH20用于補(bǔ)足反應(yīng)體系至50 μ I。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的一種SPF小鼠病原菌核酸熒光定量PCR聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(3)中的PCR反應(yīng)條件如下:95°C IOmin進(jìn)行解鏈；95°C 15s，60°C Imin后進(jìn)行熒光檢測(cè)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，溶解曲線分析條件為:95°C 15s,60°C lmin,95°C 15s后進(jìn)行熒光檢測(cè)，60°C 15s。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103740822SQ201310754981
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】蔣錦琴, 張磊, 銀國利, 徐小寅, 吳錦芳, 馮春燕 申請(qǐng)人:浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校