一種編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶基因的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明披露了一種編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶基因在黃原膠生產(chǎn)中的應(yīng)用。該基因用于構(gòu)建及選育黃原膠高產(chǎn)的基因工程菌。該基因工程菌攜帶該基因的重組質(zhì)粒pL0495，通過將pL0495導(dǎo)入野油菜黃單胞菌野油菜變種的野生型菌株8004獲得。本發(fā)明鑒定了Xcc8004菌株基因組中編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶基因與黃原膠產(chǎn)量有關(guān)，該基因可用于構(gòu)建、選育黃原膠高產(chǎn)的基因工程菌株。
【專利說明】—種編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶基因的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物遺傳工程技術(shù)，尤其涉及一種編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶基因在改良黃原膠高產(chǎn)菌株中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黃原膠(Xanthan gum)是一種由野油菜黃單胞菌(Xanthomonas oampestris)所產(chǎn)生的胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)聚合物，由多個(gè)“五糖單元”聚合而成。兩個(gè)D-葡萄糖分子通過(6-(1 — 4)糖苷鍵連接成主鏈骨架，一條由甘露糖-(P — 1，
4)_葡萄糖醛酸-(P — 1，2)_甘露糖組成的側(cè)鏈通過a_(l —3)糖苷鍵連接到主鏈的一個(gè)D-葡萄糖殘基，組成一個(gè)“五糖單元”(Swings & Civerolo, 1993)?！拔逄菃卧崩湹母事短菤埢煌潭鹊乇灰阴；虮；?。不同來源的菌株和不同培養(yǎng)條件所產(chǎn)生的黃原膠的結(jié)構(gòu)基本相同，但側(cè)鏈的?；潭炔煌?，因而乙酸和丙酮酸的含量不同，黃原膠的質(zhì)量也就不同(Cadmus et al., 1976 ；Stankowski et al., 1993)。工業(yè)生產(chǎn)上通常采用野油菜黃單胞菌野油菜變種(Xanthomonas campestris pv.campestris,簡稱Xcc)作為生產(chǎn)菌種進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠。
[0003]黃原膠是目前僅次于抗生素和溶劑的第三大類發(fā)酵產(chǎn)品，具有良好的假塑性和流變性，被作為懸浮劑、增稠劑、乳化劑等廣泛應(yīng)用于二十多個(gè)工業(yè)行業(yè)的一百多種產(chǎn)品的生產(chǎn)中。目前全球?qū)S原膠的年消耗量超過5萬噸，并且每年仍以10%的速度增長(Beckeret al., 1998 ；Garcia~0choa et al., 2000 ；Swings & Civerolo，1993)。
[0004]由于黃原膠具`有巨大的商業(yè)價(jià)值，其生物合成機(jī)理的研究從上世紀(jì)八十年代起在國際上就受到人們的重視，已發(fā)現(xiàn)黃原膠合成的一些重要途徑和所需的酶系統(tǒng)。目前已鑒定Xcc染色體上有三簇基因與黃原膠合成有關(guān):參與糖核苷等衍生物前體形成的一個(gè)
35.3kb 的基因簇(Harding etal., 1993 ；Koplin et al., 1992),參與“五糖單元”的順序性
組裝、殘基修飾、重復(fù)單元間的聚合以及黃原膠分泌的gum基因簇(Harding et al., 1987 ；Ielpi et al.，1993)，以及一個(gè)包含三個(gè)基因但在黃原膠合成過程的具體作用尚未十分清楚的基因簇(Lu et al.，2007)。盡管人們已對黃原膠的生物合成機(jī)理作了較多的研究，但有關(guān)黃原膠生物合成的調(diào)控、影響黃原膠生物合成的產(chǎn)量和質(zhì)量的其他代謝途徑等問題仍尚未十分清楚。
[0005]黃原膠在我國的研究開發(fā)始于八十年代，并于八十年代末實(shí)現(xiàn)了國產(chǎn)黃原膠的工業(yè)化生產(chǎn)。但是，國產(chǎn)黃原膠與國外產(chǎn)品相比，生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品質(zhì)量差，不具備與國外產(chǎn)品競爭的能力。目前國外產(chǎn)品在國內(nèi)黃原膠市場仍占很大的份額，并隨著國內(nèi)黃原膠市場需求的增加其市場份額有逐漸增加趨勢。改良黃原膠生產(chǎn)菌株、提高黃原膠產(chǎn)量和質(zhì)量，是我國黃原膠生產(chǎn)面臨的主要問題。發(fā)達(dá)國家黃原膠生產(chǎn)菌株的黃原膠產(chǎn)量比國內(nèi)的生產(chǎn)菌株往往高出20%以上。另外，在黃原膠的粘度、抗鹽性和對酸堿熱的穩(wěn)定性等質(zhì)量指標(biāo)方面，國外產(chǎn)品也比國內(nèi)產(chǎn)品要高。因此國內(nèi)黃原膠生產(chǎn)企業(yè)迫切需要優(yōu)良的黃原膠生產(chǎn)菌株和新的生產(chǎn)工藝。由于采用傳統(tǒng)的育種方法改良菌種效果有限，故人們寄望于采用現(xiàn)代遺傳工程手段來定向改良菌種。鑒定和克隆與黃原膠生物合成相關(guān)的基因，將可為通過遺傳工程改良菌種或設(shè)計(jì)新工藝提供工作基礎(chǔ)。
[0006]許多生物體的蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮需要形成并維持一定的空間構(gòu)象，二硫鍵對形成和維持穩(wěn)定的且具有活性蛋白質(zhì)構(gòu)象起著非常重要的作用。近年來，在一些細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了七個(gè) Dsb 家族(DsbA-G)的疏基-二硫鍵氧化還原酶(thiol-disulf ide oxidoreductase)催化細(xì)胞周質(zhì)多肽的折疊和氧化，DsbD便是其中的一種。另外，也發(fā)現(xiàn)了 DsbD在細(xì)胞色素C的合成過程有關(guān)，作用于細(xì)胞色素C的還原。但有關(guān)DsbD在黃原膠生產(chǎn)中的應(yīng)用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
[0007]主要參考文獻(xiàn)
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶基因的應(yīng)用，該基因用于構(gòu)建能夠改良黃原膠生產(chǎn)菌株的基因工程菌。
[0021]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶基因在黃原膠生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0022]優(yōu)選地，所述基因用于構(gòu)建及選育黃原膠高產(chǎn)的基因工程菌。
[0023]優(yōu)選地，所述基因工程菌攜帶該基因的重組質(zhì)粒PL0495，通過將pLp495導(dǎo)入野油菜黃單胞菌野油菜變種的野生型菌株8004獲得。
[0024]優(yōu)選地，所述基因工 [0025]優(yōu)選地，所述基因是下列核苷酸序列之一:
[0026]I)序列表中序列I的DNA序列；
[0027]2)與序列表中序列I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
[0028]優(yōu)選地，序列表中序列I的DNA序列是野油菜黃單胞菌8004菌株的基因組中的一段DNA序列，由2820個(gè)核苷酸組成，含完整的編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶的基因，自5'端的第481-2787位核苷酸為該基因的開放閱讀框，自5'端的第481-483位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5'端的第2785-2787位核苷酸為終止密碼子TGA。
[0029]優(yōu)選地，在序列表中序列2的蛋白質(zhì)是所述基因編碼的巰基-二硫鍵氧化還原酶演繹的氨基酸序列，由768個(gè)氨基酸組成。該蛋白質(zhì)預(yù)測分子量為81817道爾頓，等電點(diǎn)為8.92。
[0030]優(yōu)選地，含有所述基因的表達(dá)載體為pL0495。
[0031]優(yōu)選地，所述基因的缺失突變體0495nK。
[0032]本發(fā)明鑒定了 Xcc8004菌株基因組中編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶基因(編號為XC_0531，其EC為1.8.1.8)與黃原膠產(chǎn)量有關(guān)，該基因可用于構(gòu)建、選育黃原膠高產(chǎn)的基因工程菌株。
【專利附圖】

【附圖說明】[0033]圖1為本發(fā)明對XC_0531基因整合突變體0495nk的PCR驗(yàn)證，其中:
[0034]M:100bp DNA ladder ；1:野生型菌株 8004 ;2 ~5:整合突變體 0495nk ；
[0035]圖2為克隆有XC_0531基因的重組質(zhì)粒pL0495酶切電泳圖譜，其中:
[0036]Ml:100bp 標(biāo)準(zhǔn) DNA ；1:載體 pLAFR3 ；2:重組質(zhì)粒 pL0495 ；
[0037]M2:DNA 標(biāo)記入 DNA / HindIII ；
[0038]圖3為本發(fā)明對Xcc的XC_0531基因突變體0495nk及其及工程菌8004 / pL0495
黃原膠產(chǎn)量的定性檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0039]以下結(jié)合附圖和優(yōu)選實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地闡述。以下例舉的實(shí)施例僅意圖說明本發(fā)明，而不意圖限制本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求限定。
[0040]本發(fā)明提供的黃單胞菌中一種編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶(thiol-disulfideoxidoreductase)的基因(在Xcc8004菌株基因組中編號為XC_0531基因)，其是下列核苷酸序列之一:
[0041]I)序列表中序列I的DNA序列；
[0042]2)與序列表中序列I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
[0043]序列表中序列I的DNA序列是野油菜黃單胞菌(Xcc) 8004菌株的基因組中的一段DNA序列，由2820個(gè)核苷酸組成，含完整的編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶(thiol-disulfideoxidoreductase)的基因(編號為XC_0537)，自5'端的第481-2787位核苷酸為該基因的開放閱讀框(Open Reading Frame,0RF),自5'端的第481—483位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5'端的第2785— 2787位核苷酸為終止密碼子TGA。
[0044]序列表中序列2的蛋白質(zhì)是XC_0531基因編碼的疏基_ 二硫鍵氧化還原酶(thiol-disulfide oxidoreductase)的氨基酸序列，由768個(gè)氨基酸組成。該蛋白質(zhì)預(yù)測分子量為81817道爾頓，等電點(diǎn)為8.92。
[0045]該基因的序列已在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布，基因組序列號NC_007086，該基因編碼蛋白序列號YP_241632。該基因的整合突變體0495nk、攜帶該基因的質(zhì)粒PL0495以及攜帶多拷貝PL0495的Xcc基因工程菌8004 / pL0495已在廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院保存。
[0046]本發(fā)明還涉及含有上述基因的表達(dá)載體，優(yōu)選為pL0495。
[0047]本發(fā)明提供上述基因在基因工程改良黃原膠的生產(chǎn)菌種中的應(yīng)用。
[0048]在以下本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括:
[0049]野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xcc)野生型菌株8004，購于英國植物病原細(xì)菌國家保藏中心(The National Collection of Plant Pathogenic Bacteria,NCPPB),保藏號為 NCPPB N0.1145 ；
[0050]大腸桿菌(Escherichiacoli)株系 JM109、載體pGEM_3Zf (+)購自 Promega 公司，帶有 Iac 啟動子的載體 pLAFR3 (Staskawicz et al., 1987)
[0051]自殺質(zhì)粒pK18mob ( Schafer et al., 1994)為本研究室保存的質(zhì)粒；
[0052]限制性內(nèi)切酶、連接酶和其它修飾酶等試劑購自Promega、QIAGEN公司等；[0053]PCR反應(yīng)所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0054]實(shí)施例1
[0055]野油菜黃單胞菌Xcc中巰基-二硫鍵氧化還原酶編碼基因(XC_0531)突變體的構(gòu)
建
[0056]采用自殺質(zhì)粒pK18mob誘變XC_0531基因，具體方法參照windgassen等(FEMSMicrobiol.Lett.2003，193:201— 205)所描述。[0057]根據(jù)XC_0531基因的DNA序列(基因組序列號NC_007086，Qian et al.，2005)，設(shè)計(jì)引物 0531F/R(0531F:ACAGTTGGATCCAGCACGCCGGTAAAGAAG:0531R:ACAGTTGGATCCGATCCTGTCGCTGAAGGT)，以野油菜黃單胞菌8004菌株總DNA為模板，采用PCR法(95°C預(yù)變性4min ;95°C變生lmin，55°C復(fù)性30s，74°C延伸30s,30個(gè)循環(huán)；74°C延伸5min)擴(kuò)增XC_0531基因的ORF內(nèi)800~1126bp之間的327bp區(qū)域的同源片段，為方便克隆，引物的5'端分別加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)序列(即上述DNA引物序列中的下劃線部分)。DNA片段經(jīng)BamHI酶切后，克隆到pK18mob上。將獲得的重組質(zhì)粒通過三親本接合導(dǎo)入Xcc野生型菌株8004，篩選具有卡那霉素(Km)和利福平(Rif)抗性的接合子，三親本接合具體方法可參考Turner等所述(1985)。隨機(jī)挑選4株接合子，分別提取總DNA作為模板，以根據(jù)自殺質(zhì)粒pK18mob的序列和XC_0531終止密碼子下游的DNA序列分別設(shè)計(jì)的引物P18conF (GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCAC)和 C0531R1 (GCGGCAGTCAGTACTGAT)進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證，以野生型菌株8004作為對照。根據(jù)設(shè)計(jì)，如XC_0531被整合突變，可從突變體的總DNA中擴(kuò)增出約1300bp左右的PCR產(chǎn)物。
[0058]圖1所示的PCR反應(yīng)結(jié)果顯示，以接合子總DNA為模板時(shí)，擴(kuò)增所獲得DNA片段約1300bp (圖1中2-5泳道)，與預(yù)期的大小相符，而在對照中則沒有PCR產(chǎn)物(圖1中I泳道)，這證實(shí)了這些接合子是XC_0531基因的整合突變體，命名為0495nk。
[0059]實(shí)施例2
[0060]巰基-二硫鍵氧化還原酶編碼基因(XC_0531)的克隆、序列測定及攜帶多個(gè)拷貝XC_0531基因的基因工程菌的構(gòu)建
[0061]根據(jù)XC_0531 基因的 DNA 序列(NC_007086, Qian et al.，2005)，設(shè)計(jì)引物C0531F/R(C0531F=AAGCTT GCGGCAGTCAGTACTGAT ；C0531R:GGATCCTCCCATGCTGAATCAAGC)，以 Xcc8004 菌株總 DNA 為模板，PCR(95°C預(yù)變性 4min ;95°C變性 lmin，55°C復(fù)性 30s，74°C延伸3min，30個(gè)循環(huán)；74°C延伸5min)擴(kuò)增該基因全長序列(包含XC_0537基因編碼區(qū)上游439bp和下游28bp的2774bp的DNA片段)。為方便克隆，引物的5'端分別加上BamHI和HindIII的酶切位點(diǎn)序列(上述DNA引物序列中的下劃線部分)。將所獲得的DNA片段克隆至載體pGEM3Zf (+)中，用Sanger末端中止法對所克隆的DNA核苷酸序列進(jìn)行測序驗(yàn)證。將測序驗(yàn)證正確的DNA片段克隆到廣譜宿主質(zhì)粒PLAFR3位點(diǎn)上，獲得了含XC_0531基因的重組質(zhì)粒PL0495。該質(zhì)粒用BamH、HindIII酶切，除了一條約22kb的載體DNTA片段外，還有一條約2.8kb的外源片段(請參見圖2，M為Marker，I為質(zhì)粒pLAFR3，2為重組質(zhì)粒 pL0495)。
[0062]構(gòu)建攜帶多拷貝的XC_0531基因的基因工程菌的實(shí)施，是采用Turner等所述的三親本接合法將重組質(zhì)粒PL0495導(dǎo)入Xcc野生型菌株8004，獲得攜帶重組質(zhì)粒pL0495的基因工程菌株8004 / pL0495，請參見圖3。[0063]實(shí)施例3
[0064]巰基-二硫鍵氧化還原酶編碼基因(XC_0531)突變體及工程菌8004 / pL0495的
黃原膠產(chǎn)量檢測
[0065]Xcc黃原膠產(chǎn)量的定性定量的檢測是參照Tang等(Mol.Gen.Genet.1991，226:409-417)所描述方法進(jìn)行。
[0066](I)定性檢測
[0067]將XC_0531基因的突變體0495nk、攜帶多拷貝XC_0531的基因工程菌8004 /PL0495接種在含2%葡萄糖或蔗糖的NYG培養(yǎng)基的平板上，以野生型菌株g004作對照，培養(yǎng)5cL
[0068]結(jié)果可見突變體形成的菌落要比野生型菌株8004小，而工程菌8004 / pL0495形成的菌落則比野生型菌株較大較圓潤粘稠，如圖3所示。這表明與野生型菌株8004相比，突變體0495nk的黃原膠產(chǎn)量可能降低，而工程菌8004 / pL0495的產(chǎn)量增加。
[0069](2)定量檢測
[0070]為準(zhǔn)確衡量EPS的產(chǎn)量，采用搖瓶發(fā)酵準(zhǔn)確測定Xcc菌株的產(chǎn)量。將菌株培養(yǎng)在分別添加有葡萄糖和蔗糖的NYG液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5d后，8004菌株、突變體0495nk以及工程菌8004 / pL0495在含葡萄糖、蔗糖的培養(yǎng)基中黃原膠產(chǎn)量如表1所示。
[0071]表1
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一種編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶基因在黃原膠生產(chǎn)中的應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因用于構(gòu)建及選育黃原膠高產(chǎn)的基因工程菌。
3.按照權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因工程菌攜帶所述基因的重組質(zhì)粒pL0495，通過將所述pL0495導(dǎo)入野油菜黃單胞菌野油菜變種的野生型菌株8004獲得。
4.按照權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因工程菌為攜帶所述基因的多拷貝 pL0495 的 8004 / pL0495。
5.按照權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因是下列核苷酸序列之 1)序列表中序列I的DNA序列； 2)與序列表中序列I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
6.按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于， 所述序列表中序列I的DNA序列是所述野油菜黃單胞菌8004菌株的基因組中的一段DNA序列，由2820個(gè)核苷酸組成，含完整的編碼巰基-二硫鍵氧化還原酶的基因，自5'端的第481-2787位核苷酸為該基因的開放閱讀框，自5'端的第481-483位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5'端的第2785-2787位核苷酸為終止密碼子TGA。
7.按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于， 在所述序列表中序列2的蛋白質(zhì)是所述基因編碼的巰基-二硫鍵氧化還原酶演繹的氨基酸序列，由768個(gè)氨基酸組成。該蛋白質(zhì)預(yù)測分子量為81817道爾頓，等電點(diǎn)為8.92。`
8.按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，含有所述基因的表達(dá)載體為所述pL0495。
9.按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因的缺失突變體0495nK。
【文檔編號】C12N15/74GK103695453SQ201310705911
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】陸光濤, 胡杰, 李磊, 王一諾, 崔萍, 陳蕾, 唐紀(jì)良 申請人:廣西大學(xué)