基于卵裂球分裂和運動的胚胎質(zhì)量評估的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及測定胚胎質(zhì)量的系統(tǒng)和方法，其包括監(jiān)測胚胎一段時間期間，所述時間期間的長度足以包括至少一個細(xì)胞分裂期和至少一部分分裂間期，以及測定所述至少一個細(xì)胞分裂期的長度；和/或ii)測定在細(xì)胞分裂期內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞器運動的程度和/或空間分布；和/或iii)測定分裂間期的持續(xù)時間；和/或iv)測定在分裂間期內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞器運動的程度和/或空間分布，從而獲得胚胎質(zhì)量測量。因此，基于所觀察到的細(xì)胞分裂以及伴隨的細(xì)胞和細(xì)胞器運動的計時、持續(xù)時間、空間分布以及程度，可促進(jìn)對體外受精(IVF)后被植入的最佳胚胎的選擇。
【專利說明】基于卵裂球分裂和運動的胚胎質(zhì)量評估
[0001]本申請是申請日為2007年6月15日、發(fā)明名稱為“基于卵裂球分裂和運動的胚胎質(zhì)量評估”的中國專利申請?zhí)?00780027901.8的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及基于所觀察的細(xì)胞分裂以及伴隨的細(xì)胞和細(xì)胞器運動的計時、持續(xù)時間、空間分布和程度，選擇用于體外受精的胚胎的方法和系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0003]不育癥影響全球8千多萬人。據(jù)估計，10%的夫婦患有原發(fā)性或繼發(fā)性不育癥(Vayena等，2001)。體外受精(IVF)是一種有效的內(nèi)科療法，其可以提供給以其他方式不能具有懷孕機(jī)會的夫婦。這是一種將卵(卵母細(xì)胞)從女性卵巢中取出然后在實驗室與精子受精的過程。在該過程中所創(chuàng)造的胚然后被放置到潛在植入的子宮內(nèi)。為避免多胎妊娠和多胞胎，僅僅移植幾個胚胎(通常少于四個并且理想地僅為一個(Bhattacharya等，2004))。選擇用于移植的適當(dāng)胚胎在任何IVF處理中是關(guān)鍵的步驟。目前的選擇程序大部分完全基于在發(fā)育過程的不同時間點處對胚胎的形態(tài)學(xué)評價，特別是在移植時利用標(biāo)準(zhǔn)立體顯微鏡進(jìn)行的評價。然而，廣泛認(rèn)識到，該評價過程需要定性的以及定量的改進(jìn)。
[0004]早期細(xì)胞分裂。一種有前景的新方法是利用'早期分裂'至2-細(xì)胞期(即在授精/注射后25-27h之前)作為質(zhì)量指示。在該方法中，在受精后25-27小時視覺觀察胚胎，以確定是否第一細(xì)胞分裂已經(jīng)完成。幾項研究證明，在個體胚胎的早期卵裂以及隨后的發(fā)育潛能之間存在強(qiáng)的關(guān)聯(lián)(Shoukir 等，1997 ;Sakkas 等，1998, 2001 ;Bos_Mikich 等，2001 ；Lundin 等,2001 ;Petersen 等，2001 ;Fenwick等，2002 ;Neuber 等，2003 ;Salumets 等，2003 ；Windt等，2004)。幾位觀察者已經(jīng)指出需要更頻繁的觀察。然而，頻繁的視覺觀察由于伴隨從溫育器轉(zhuǎn)移至倒置顯微鏡，引起可能阻礙或者甚至使胚胎發(fā)育停止的生理應(yīng)激。其也是耗時的并且難以并入IVF臨床的日常工作中。
[0005]幾位研究者已經(jīng)在胚胎發(fā)育過程中進(jìn)行了縮時圖像采集。這主要通過將研究用顯微鏡放置在溫育器內(nèi)部或者將“溫育器載物臺(stage) ”構(gòu)建到具有自動圖像采集的顯微鏡鏡臺上來進(jìn)行?！皽赜鳌北３挚山邮艿臏囟?37°C )、濕度(> 90% )和氣體組成(5% C02和在一些情況下減少的氧濃度)。縮時圖像的手動評估已經(jīng)產(chǎn)生了關(guān)于定時以及連續(xù)細(xì)胞分裂起始之間的時間間隔的重要信息(Grisart等，1994, Holm等，1998, Majerus等,2000,Holm 等，2002, Hol m 等，2003, Lequarre 等，2003, Motosugi 等，2005)。
[0006]在申請中或在本申請中所引用的所有專利和非專利參考文獻(xiàn)因此也通過參考以其全部并入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明涉及基于所觀察到的細(xì)胞分裂以及伴隨的細(xì)胞和細(xì)胞器運動的計時、持續(xù)時間、空間分布以及程度，有助于選擇體外受精(IVF)后所植入的最佳胚胎的方法和系統(tǒng)。[0008]因此，在第一方面，本發(fā)明涉及用于測定胚胎質(zhì)量的方法，其包括監(jiān)測胚胎一段時間期間，所述時間期間的長度足以包括至少一個細(xì)胞分裂期和至少一部分分裂間期(inter-division period),以及測定:i)所述至少一個細(xì)胞分裂期的持續(xù)時間；和/或ii)測定在細(xì)胞分裂期內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞器運動的程度和/或空間分布；和/或iii)測定分裂間期的持續(xù)時間；和/或iv)測定在分裂間期內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞器運動的程度和/或空間分布，從而獲得胚胎質(zhì)量測量。
[0009]所得到的胚胎質(zhì)量測量然后可以被用于鑒定和選擇適于移植到女性子宮中的胚胎以便提供妊娠和活產(chǎn)嬰兒。
[0010]因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及選擇適合用于移植的胚胎的方法，所述方法包括如上述定義監(jiān)測胚胎，獲得胚胎質(zhì)量測量，并選擇具有最高胚胎質(zhì)量測量的胚胎。
[0011]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有實施上述方法的裝置。所述系統(tǒng)可以是任何合適的系統(tǒng)，諸如包括計算機(jī)代碼部分的計算機(jī)，該計算機(jī)構(gòu)成執(zhí)行上述方法的裝置。所述系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括用于在不同時間間隔下獲取胚胎圖像的裝置，諸如在于2006年10月16日提交的名稱為“細(xì)胞群變化之測定(Determination of a change in acell population) ”的在審PCT申請中所述的系統(tǒng)。
[0012]在又一方面，本發(fā)明涉及數(shù)據(jù)載體，該數(shù)據(jù)載體包括計算機(jī)代碼部分，所述數(shù)據(jù)載體構(gòu)成用于執(zhí)行上述方法的裝置。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1:兩個代表性牛胚胎的卵裂球活動?！昂玫摹卑l(fā)育成孵化的胚泡。“壞的”從不發(fā)育成胚泡。
[0014]圖2:41個牛胚胎的卵裂球活動。卵裂球活動以假-凝膠-圖像顯示，其中活動峰由黑色條帶表示，無活動是白色的，每個泳道對應(yīng)單個胚胎。黑色帶型圖案或拖尾反應(yīng)胚胎內(nèi)細(xì)胞活動的期間?！昂玫摹迸咛グl(fā)育成上面所示的胚泡，“壞的”胚胎不發(fā)育成胚泡期。對于好的胚胎觀察到更清晰的初始條帶(通常為三個)。
[0015]圖3:13個代表性牛胚胎的卵裂球活動?！昂谩迸咛グl(fā)育成由綠色曲線表示的孵化胚泡?！皦牡摹迸咛牟话l(fā)育成以紅色顯示的胚泡。X-軸是幀數(shù)，y-軸是卵裂球活動。圖像采集始于受精后24小時并以2幀/小時進(jìn)行。通過向卵裂球活動值添加30，綠色曲線已經(jīng)在I—軸上被移位。
[0016]圖4:所有獲得幀的平均卵裂球活動(亮區(qū)=高卵裂球活動，暗區(qū)=低卵裂球活動)。
[0017]圖5:21個牛胚胎的卵裂球活動，其不發(fā)育成高質(zhì)量胚泡。用于劃分卵裂球活動模式的三個曲線部分被標(biāo)明。
[0018]圖6:18個牛胚胎的卵裂球活動，其不發(fā)育成高質(zhì)量胚泡。用于劃分卵裂球活動模式的三個曲線部分被標(biāo)明。
[0019]圖7:13個代表性胚胎的手動檢測與自動檢測的細(xì)胞分裂之間的關(guān)聯(lián)性。大約10 %的細(xì)胞分裂通過該算法未被檢測到，但是其它的對應(yīng)性是優(yōu)良的。
[0020]圖8:好和壞胚胎的手動檢測的細(xì)胞分裂。
[0021]圖9:衍生參數(shù)的估計。右上角中的圖顯示作為幀數(shù)函數(shù)的原始卵裂球活動。綠色和藍(lán)色直線分別表示第二和第三時間間隔的開始。在右下角中的圖顯示如上所述的衍生參數(shù)。垂直的紅線分別表示峰或谷內(nèi)最高或最低活動值的時間和值。
[0022]圖10:來自94個胚胎的卵裂球活動分析的衍生參數(shù)(見上圖)。發(fā)育成質(zhì)量好的擴(kuò)張胚細(xì)胞的胚胎以紅色顯示(好實例)，不發(fā)育成質(zhì)量好的擴(kuò)張胚細(xì)胞的胚胎以藍(lán)色顯示(壞實例)。
[0023]圖11:前五個PCA軸的PCA繪圖。紅色點是具有好質(zhì)量的胚胎,而藍(lán)色是具有壞質(zhì)量的胚胎。
[0024]圖12:94個不同胚胎在時段3 (即受精后76至96小時)的卵裂球活動基線值。該等級是給定的牛胚胎在溫育7天后的卵裂球質(zhì)量量度。等級I胚胎品質(zhì)最佳并且具有比等級5顯著更高的基線值，等級5是最低的品質(zhì)并且經(jīng)常是閉鎖的(attretic)。
【具體實施方式】
[0025]定義
[0026]細(xì)胞分裂期:從在細(xì)胞膜中第一次觀察到凹入(表明胞質(zhì)分裂開始)到胞質(zhì)細(xì)胞分裂完成使得隨后的子細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被分離成兩個個體細(xì)胞的時間期間。
[0027]分裂間期(Inter-division period):從一個細(xì)胞分裂期結(jié)束到隨后的細(xì)胞分裂期開始的時間期間。
[0028]分裂周期:在連續(xù)細(xì)胞分裂開始之間的時間間隔，即從一個細(xì)胞分裂期開始到隨后的細(xì)胞分裂開始。
[0029]細(xì)胞位置的重排=細(xì)胞運動(見下述)。
[0030]細(xì)胞運動:細(xì)胞中心以及外部細(xì)胞膜的運動。細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)部運動不是細(xì)胞運動。外部細(xì)胞膜是動態(tài)結(jié)構(gòu)，因此細(xì)胞界限將連續(xù)輕微地改變位置。然而，這些輕微的變動不被認(rèn)為是細(xì)胞運動。細(xì)胞運動是指細(xì)胞的重心的改變及其位置相對于其他細(xì)胞改變以及指細(xì)胞分裂。細(xì)胞運動可以通過計算運動細(xì)胞的兩個連續(xù)數(shù)字圖像之間的差異來量化。此類量化的實例詳細(xì)描述在于2006年10月16日提交的名稱為“細(xì)胞群變化之測定”的在審PCT中。然而，測定細(xì)胞重心和/或細(xì)胞質(zhì)膜位置運動的其他方法可以通過例如利用FertiMorph軟件(丹麥哥本哈根的ImageHouse Medical)以便半自動描繪在通過胚胎的連續(xù)光學(xué)狹樣區(qū)中每一卵裂球的界限來預(yù)見。
[0031]細(xì)胞器運動:可以通過顯微鏡觀察胚胎內(nèi)的內(nèi)部細(xì)胞器以及細(xì)胞器膜的運動。在本申請的上下文中細(xì)胞器運動不是細(xì)胞運動。
[0032]運動:物體的空間重排。運動通過很多不同參數(shù)來表征和/或量化和/或描述，所述參數(shù)包括但不限于:運動的程度、運動中所涉及的面積和/或體積、旋轉(zhuǎn)、平移向量、運動的方向、運動的速度、大小調(diào)整(resizing)、膨脹/收縮等。細(xì)胞或細(xì)胞器運動的不同量度因此可以被用于不同的目的，一些目的反映出運動的程度或強(qiáng)度，一些反映出運動物體的空間分布，一些反映出運動所經(jīng)歷的軌跡或體積。
[0033]胚胎:在一些情況中術(shù)語“胚胎”被用于描述在受精后八周變成胎兒前移植入子宮后的受精卵母細(xì)胞。根據(jù)該定義，受精的卵母細(xì)胞在進(jìn)行移植前通常被稱為胚前期(pre-embryo)。然而，貫穿該專利申請，我們將使用更寬的術(shù)語胚胎定義，其包括胚前期階段。因此其包括從卵母細(xì)胞受精到桑葚胚、胚泡期孵化和植入的所有發(fā)育階段。[0034]胚胎質(zhì)量是所述胚胎在轉(zhuǎn)移之后在子宮中成功植入和發(fā)育的能力的量度。高質(zhì)量的胚胎在轉(zhuǎn)移后將在子宮中成功植入和發(fā)育，而低質(zhì)量胚胎將不會。
[0035]胚胎成活力是所述胚胎在轉(zhuǎn)移后在子宮內(nèi)成功植入和發(fā)育的能力的量度。高成活力的胚胎在轉(zhuǎn)移后將在子宮內(nèi)成功植入和發(fā)育，而低成活力的胚胎將不會。成活力和質(zhì)量在本文中被互換使用。
[0036]胚胎質(zhì)量(或成活力)測量是意欲反映胚胎質(zhì)量(或成活力)的參數(shù)，以便具有高質(zhì)量參數(shù)值的胚胎具有高的概率成為高質(zhì)量(或成活力)的胚胎，以及具有低的概率成為低質(zhì)量(或成活力)的胚胎。然而具有相關(guān)的低質(zhì)量(或成活力)參數(shù)值的胚胎僅具有具備高質(zhì)量(或成活力)胚胎的低概率以及具有成為低質(zhì)量(或成活力)胚胎的高概率。
[0037]胚胎
[0038]胚胎近似球形并且由一個或多個由明膠樣外殼包圍的細(xì)胞(卵裂球)組成，無細(xì)胞的基質(zhì)被稱為透明帶。透明帶執(zhí)行多種功能，直到胚胎孵化為止，并且透明帶是用于胚胎評價的好標(biāo)志。該帶是球狀且半透明的，并且應(yīng)當(dāng)清晰地區(qū)別于細(xì)胞碎片。
[0039]當(dāng)通過精細(xì)胞(精子)的融合或注射而使卵母細(xì)胞受精時，形成胚胎。該術(shù)語傳統(tǒng)也用于孵化后(即透明帶的破裂)和隨后的植入。對于人類而言，受精的卵母細(xì)胞在前八周傳統(tǒng)上被稱為胚胎。之后(即在八周之后，以及當(dāng)所有主要器官已經(jīng)被形成時)其被稱為胎兒。然而，胚胎與胎兒之間的差別通常未被充分限定。
[0040]在胚胎發(fā)育期，卵裂球數(shù)目幾何增加(1-2-4-8-16-等)。同步的細(xì)胞分裂通常被保持到胚胎中的16-細(xì)胞期。之后，細(xì)胞分裂變成不同步的，并且最終個體細(xì)胞擁有它們自己的細(xì)胞周期。對于牛胚胎 :組成胚胎的卵裂球在16-細(xì)胞期成為球形細(xì)胞前應(yīng)當(dāng)是容易識別的，。在大約32-細(xì)胞期(桑葚胚期)，胚胎經(jīng)歷壓縮(compaction)，因為當(dāng)黏著蛋白被表達(dá)時發(fā)生細(xì)胞間粘附。結(jié)果是，經(jīng)過該階段后，難于評價胚胎中的個體細(xì)胞的數(shù)目。對于人胚胎，壓縮發(fā)生地稍微更早，并且在16細(xì)胞期，個體卵裂球不易識別。在不育癥治療中所產(chǎn)生的人胚胎通常在桑葚胚期前被轉(zhuǎn)移至受體，而其他哺乳動物胚胎在轉(zhuǎn)移至受體或排出之前通常被實驗培養(yǎng)到進(jìn)一步的發(fā)育階段(擴(kuò)張胚泡)。在一些情況中，人胚胎在移植之前也被培養(yǎng)到胚泡期，在有很多好質(zhì)量胚胎或者需要長時間的溫育來等待植入前遺傳診斷(P⑶)的結(jié)果時，這種情況被優(yōu)選地進(jìn)行。因此，術(shù)語胚胎被用來表示以下的各個階段一一受精卵母細(xì)胞、受精卵(zygote)、2_細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、16-細(xì)胞、桑葚胚、胚泡、擴(kuò)張胚泡和孵化胚泡，以及位于其間的所有階段(例如3-細(xì)胞或5-細(xì)胞)。
[0041]質(zhì)量測定
[0042]基于一種或多種胚胎的測定，本發(fā)明提供胚胎質(zhì)量測量[見上述胚胎質(zhì)量測量的定義]，諸如:i)至少一個細(xì)胞分裂期的持續(xù)時間；和/或ii)測定在細(xì)胞分裂期期間細(xì)胞或細(xì)胞器運動的程度和/或空間分布；和/或iii)測定分裂間期的持續(xù)時間；和/或iv)測定分裂間期期間細(xì)胞或細(xì)胞器運動的程度和/或空間分布，從而獲得胚胎質(zhì)量測量。
[0043]本發(fā)明依賴于這樣的觀察:除每一細(xì)胞分裂前后短的時間間隔，細(xì)胞位置在細(xì)胞分裂之間通常是相對固定的(即很少的細(xì)胞運動)，此時一個細(xì)胞分裂成兩個，導(dǎo)致分裂細(xì)胞以及周圍細(xì)胞的短暫但是相當(dāng)大的重排(即顯著的細(xì)胞運動)。
[0044]本發(fā)明的特定用途是評價發(fā)育中的胚胎的圖像系列(縮時圖像)。這些縮時圖像可以通過差分成像來分析(見于2006年10月16日提交的名稱為“細(xì)胞群變化之測定”的在審PCT申請)。得到的差分圖像可以用于量化在圖像系列中連續(xù)幀之間發(fā)生的變化量。
[0045]本發(fā)明可以被應(yīng)用于差分圖像數(shù)據(jù)的分析，其中作為細(xì)胞運動結(jié)果的細(xì)胞界限改變的位置(即細(xì)胞膜)使得衍生自該差分圖像的一系列參數(shù)暫時增加(見于2006年10月16日提交的名稱為“細(xì)胞群變化之測定”的在審PCT申請)。這些參數(shù)包括(但不限于)平均絕對強(qiáng)度或方差的增加。細(xì)胞分裂及其持續(xù)時間以及相關(guān)的細(xì)胞重排因此能夠通過差分圖像中所有像素的標(biāo)準(zhǔn)偏差上的暫時變化——即增加或減少，或者通過在于2006年10月16日提交的名稱為“細(xì)胞群變化之測定”的在審PCT申請中所列舉的“卵裂球活動”的任何其他衍生參數(shù)進(jìn)行檢測。然而，所述選擇標(biāo)準(zhǔn)也可以被用于視覺觀察和分析縮時圖像以及與胚胎發(fā)育有關(guān)的其他暫時分辨的數(shù)據(jù)(例如代謝產(chǎn)物的排泄或攝取，物理或化學(xué)外觀變化，衍射，散射，吸收等)——這些數(shù)據(jù)如在2006年10月16日提交的名稱為“細(xì)胞群變化之測定”的在審PCT申請所定義，與卵裂球活動無關(guān)。
[0046]特別感興趣的是細(xì)胞分裂的開始、強(qiáng)度和持續(xù)時間，它們在衍生參數(shù)值中可以被量化為波峰或波谷。這些極限——波峰或波谷——通常表示細(xì)胞分裂事件。這些事件的定時和持續(xù)時間以及在這些事件過程中以及之間所觀察到的參數(shù)值用來表征胚胎以及評價其發(fā)育潛能。和通常峰的大小一樣，每個峰的形狀也提供另外的信息。峰也可以表示卵裂球的突然崩潰以及同時發(fā)生的細(xì)胞死亡。然而，通過事件前后峰形狀以及基線值的變化區(qū)分細(xì)胞分裂與細(xì)胞死亡事件也是可能的。大多數(shù)參數(shù)的基線通常不受細(xì)胞分裂的影響，而細(xì)胞溶解通常伴隨著基線值的顯著變化(對于大多數(shù)參數(shù)，溶解后減小)。
[0047]另一特別感興趣的是細(xì)胞和細(xì)胞器運動的空間分布。缺乏運動的透明帶內(nèi)的體積(或類似地，保持靜止的胚胎投影2D圖像中的面積)表示胚胎內(nèi)的“死亡”區(qū)。這些不能動的“死亡”區(qū)越多越大，成功胚胎發(fā)育的可能性越低。在縮時系列胚胎圖像內(nèi)缺乏任何類型運動(即既無細(xì)胞運動也無細(xì)胞器運動)的大片面積表明低的成活力。細(xì)胞器運動通常應(yīng)當(dāng)在整個胚胎中是可檢測的 ，即使當(dāng)僅比較兩個或幾個連續(xù)的幀時也是如此。細(xì)胞運動可以更集中在特別是胚胎發(fā)育的后期中，然而，當(dāng)評價很多連續(xù)的幀時，細(xì)胞運動應(yīng)當(dāng)在透明帶內(nèi)在整個體積內(nèi)是可檢測的，這表明胚胎內(nèi)所有卵裂球都分裂并改變位置。
[0048]因此，胚胎質(zhì)量測量包括關(guān)于在至少一個細(xì)胞分裂和/或一個分裂間期的至少一部分期間細(xì)胞和細(xì)胞器運動的信息，諸如:i)所述至少一個細(xì)胞分裂期的持續(xù)時間；和/或ii)測定在細(xì)胞分裂期內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞器運動的程度和/或空間分布；和/或iii)測定分裂間期的持續(xù)時間；和/或iv)測定在分裂間期內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞器運動的程度和/或空間分布。在優(yōu)選的實施方式中，胚胎質(zhì)量測量包括本文所述的兩個或多個測定信息，諸如三個或多個本文所述的測定。在更優(yōu)選的實施方式中，胚胎質(zhì)量測量包括本文所述的所有測定的信息。具體而言，胚胎質(zhì)量測量包括關(guān)于細(xì)胞分裂期長度和分裂間期長度的信息，或者胚胎質(zhì)量測量包括關(guān)于細(xì)胞分裂期中的運動以及分裂間期中的運動方面的信息。在另一實施方式中，胚胎質(zhì)量測量包括關(guān)于期間的長度以及在該相同期間內(nèi)的運動方面的信息。
[0049]胚胎質(zhì)量測量基于下面的觀察:
[0050]a)突然的細(xì)胞分裂一其中真正的細(xì)胞質(zhì)分裂進(jìn)展迅速并且隨后發(fā)生的其他卵裂球位置的重排也迅速發(fā)生(例如，尖的卵裂球活動峰)，預(yù)示著高質(zhì)量的胚胎。延長的胞質(zhì)分裂持續(xù)時間以及其他卵裂球隨后廣泛的空間重排(即細(xì)胞運動)表示胚胎質(zhì)量差(例如寬的卵裂球活動峰)。(實施例1)[0051]b)細(xì)胞分裂之間很少的卵裂球位置重排表示高質(zhì)量胚胎，而可見的細(xì)胞分裂之間的運動經(jīng)常表示胚胎質(zhì)量差。(實施例1)
[0052]c)細(xì)胞分裂之間延長的細(xì)胞位置重排(例如寬的卵裂球活動峰)通常與差的胚胎質(zhì)量、不同步的細(xì)胞分裂和大量斷裂有關(guān)。(實施例1)
[0053]d)當(dāng)胚胎基因組被活化并且蛋白質(zhì)合成從母體轉(zhuǎn)向胚胎轉(zhuǎn)錄時，對于大多數(shù)哺乳動物而言，觀察到非常少的細(xì)胞運動的靜息期間。如果該期間具有:i)早期開始，ii)非常低的活動(=很少的細(xì)胞運動=靜息的)，和iii)早期終止，則其是高質(zhì)量胚胎的強(qiáng)有力的象征。在壞胚胎中靜息期間的開始經(jīng)常被延遲，并且有時被細(xì)胞運動中斷。壞胚胎也可以在“靜息”期具有升高的細(xì)胞運動基線水平，而無可檢測的細(xì)胞分裂。(實施例2)
[0054]e)在隨后停止發(fā)育的劣質(zhì)胚胎中，經(jīng)常觀察到特定的且始終不移動的區(qū)域，其持續(xù)不變并最終導(dǎo)致發(fā)育停止。此類不移動的區(qū)域可與大量斷裂或卵裂球死亡和溶解有關(guān)。如果這些區(qū)域在給定的發(fā)育期大于給定的百分比，則胚胎具有非常低的存活可能性。在高質(zhì)量胚胎中，在每一胞質(zhì)分裂事件之后很快發(fā)生的細(xì)胞活動最初分布在整個胚胎表面上(即所有的卵裂球輕微移動)，僅在桑葚胚期的壓縮之后觀察到局部運動(實施例3)。
[0055]f)細(xì)胞器運動的均勻空間分布通常發(fā)現(xiàn)于有活力的高質(zhì)量胚胎中；而缺乏活動的“死亡”區(qū)通常發(fā)現(xiàn)于低質(zhì)量胚胎中。已經(jīng)對細(xì)胞運動進(jìn)行了類似的觀察，但是在較長時間-窗口期間進(jìn)行的觀察是測定細(xì)胞運動的空間均勻性所必需的(實施例3)。
[0056]g)在不同時間間隔中細(xì)胞運動的量是胚胎質(zhì)量的優(yōu)良指標(biāo)。質(zhì)量相關(guān)的參數(shù)可以從不同時間段中的平均運動的比率和/或不同時間段中標(biāo)準(zhǔn)偏差的比率計算。胚胎選擇程序可以基于這些參數(shù)的 值來建立(實施例4)。
[0057]h)細(xì)胞運動和細(xì)胞器運動的基線水平逐漸或突然的減小通常與低胚胎質(zhì)量和發(fā)育停止的高度可能性相關(guān)。基線水平的變化可與不活動區(qū)/區(qū)域的出現(xiàn)相關(guān)(見上述(e)和⑴)。(實施例6)
[0058]i)首次細(xì)胞分裂的早期開始是高胚胎質(zhì)量的象征。首次(和隨后細(xì)胞分裂)的晚期開始表示低質(zhì)量胚胎。然而，對于大多數(shù)胚胎而言，單獨首次細(xì)胞分裂的確切開始不提供明確的胚胎質(zhì)量指示(實施例4)。
[0059]j)對于描述細(xì)胞和細(xì)胞器運動的大部分衍生參數(shù)，可以定義正常范圍，使得在該正常范圍之外的值(例如異常高的或異常低的)都表明壞的胚胎質(zhì)量(實施例6)。
[0060]k)連續(xù)的細(xì)胞分裂之間的間隔是胚胎成活力的重要(以及種類特異的)指標(biāo)，一個實例是I — 2和2 — 4細(xì)胞分裂之間的間隔的比率與2 — 4和4 — 8細(xì)胞分裂之間的間隔之間的比率。這些間隔的比率應(yīng)當(dāng)在活胚胎的給定范圍內(nèi)。
[0061]I)在后期(例如2 —4，4 —8)的同步進(jìn)行的細(xì)胞分裂主要發(fā)現(xiàn)于高質(zhì)量胚胎中，而對于低質(zhì)量胚胎經(jīng)常觀察到不同步的細(xì)胞分裂(例如2 — 3 — 4 — 5 — 6 — 7 — 8)(實施例I)。
[0062]下面的測定產(chǎn)生最高的胚胎質(zhì)量測量:
[0063]?短的細(xì)胞分裂期，其中短的被定義為小于2小時。
[0064]?在分裂間期很少的細(xì)胞運動，其中很少的被定義為視覺上不存在超出常規(guī)的振蕩和細(xì)胞器運動的細(xì)胞位置變化，所述常規(guī)的振蕩和細(xì)胞器運動總是促成差分圖像。很少的細(xì)胞運動暗示細(xì)胞的重心是固定的(運動<3i!m)并且細(xì)胞質(zhì)膜很大程度上是不移動的(< 3 ii m) o
[0065]?首次細(xì)胞分裂期的早期開始，即對于人胚胎而言，在受精后25小時之前(對于牛胚胎而言，在受精后30小時之前)。
[0066]?在分裂間期中短的細(xì)胞運動期，其中短的被定義為小于3小時。
[0067]?在透明帶內(nèi)細(xì)胞運動隨時間均勻的分布，即不存在在較長時間期間內(nèi)未觀察到細(xì)胞運動(即>24小時)的胚胎的不活動區(qū)域/區(qū)/體積。此類不移動的區(qū)域可能是由于死亡的或瀕死的卵裂球和碎片，其可阻礙進(jìn)一步的發(fā)育。
[0068]?細(xì)胞運動的基線值持續(xù)的輕微的增加。
[0069]?所有衍生參數(shù)在特定胚胎的正常范圍內(nèi)。
[0070]胚胎質(zhì)量測量越接近最高質(zhì)量測量，胚胎的質(zhì)量越高。
[0071]神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或者其他定量模式識別算法可以用于評價上述復(fù)雜的細(xì)胞運動模式。此類網(wǎng)絡(luò)可以用來發(fā)現(xiàn)最佳質(zhì)量的胚胎用于IVF治療中的移植。實施例6描述了在胚胎發(fā)育期間從“卵裂球活動”(見于2006年10月16日提交的名稱為“細(xì)胞群變化之測定”的在審PCT申請)獲得的胚胎發(fā)育的關(guān)鍵參數(shù)，并隨后利用不同的數(shù)學(xué)模型(線性，主成分分析，Markov模型等)評價所述衍生參數(shù)。
[0072]其他測量
[0073]最終的分析 步驟可以包括比較所進(jìn)行的觀察與不同質(zhì)量和發(fā)育能力的胚胎的類似觀察，以及比較給定胚胎的參數(shù)值與在同一胚胎上進(jìn)行的其他定量測量。這可以包括與在線測量諸如卵裂球運動性、呼吸率、氨基酸攝取等的比較。卵裂球活動性分析、呼吸率以及其他定量參數(shù)的結(jié)合數(shù)據(jù)組有可能改進(jìn)胚胎選擇并使胚胎學(xué)家能夠可靠地選擇用于移植的最佳胚胎。
[0074]因此，在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法可以結(jié)合其他測量，以便評價正在討論的胚胎，并且可以用于選擇用于移植至受體的有能力的胚胎。
[0075]此類其他測量可以選自呼吸率、氨基酸攝取、運動性分析、卵裂球活動、形態(tài)、卵裂球大小、卵裂球?；?blastomere granulation)、斷裂、卵裂球顏色、極體定向、核化、紡錘體形成和完整性以及很多其他定量測量。呼吸測量可以如在PCT公布號WO 2004/056265中所述進(jìn)行。
[0076]培養(yǎng)基
[0077]在優(yōu)選的實施方式中，在細(xì)胞群培養(yǎng)的過程中進(jìn)行觀察，諸如其中細(xì)胞群被放置在培養(yǎng)基中。培養(yǎng)細(xì)胞群的方法在本領(lǐng)域是已知的。培養(yǎng)胚胎的實例描述在PCT公布號TO2004/056265 中。
[0078]數(shù)據(jù)載體
[0079]本發(fā)明進(jìn)一步涉及數(shù)據(jù)載體，其包含直接可裝載在數(shù)字處理設(shè)備的存儲器中的計算機(jī)程序以及包含構(gòu)成用于執(zhí)行如上所述的本發(fā)明方法的裝置的計算機(jī)代碼部分。
[0080]數(shù)據(jù)載體可以是磁盤或光盤或者可以是EEPROM或Flash類型的電子卡的形狀，并且被設(shè)計成裝載到現(xiàn)有的數(shù)字處理裝置中。
[0081]胚胎的選擇或鑒定
[0082]本發(fā)明進(jìn)一步提供選擇用于移植的胚胎的方法。該方法暗示已經(jīng)如上所述對胚胎進(jìn)行監(jiān)測，以測定胚胎中的變化，以便測定細(xì)胞分裂何時發(fā)生以及任選測定是否已經(jīng)發(fā)生細(xì)胞死亡以及測定細(xì)胞分裂的質(zhì)量和胚胎的總體質(zhì)量。優(yōu)選選擇具有基本同步的細(xì)胞分裂、產(chǎn)生差分圖像的清晰衍生參數(shù)的胚胎，以及更優(yōu)選選擇無細(xì)胞死亡的胚胎。
[0083]選擇或鑒定方法可以結(jié)合如上所述的其他方法，以便評價胚胎的質(zhì)量。胚胎的形態(tài)學(xué)評價的重要標(biāo)準(zhǔn)是:(1)胚胎的形狀，包括卵裂球的數(shù)目和斷裂的程度；(2)透明帶的存在和質(zhì)量；(3)大?。?4)顏色和結(jié)構(gòu)；(5)對與胚胎發(fā)育期有關(guān)的胚胎年齡的了解；和
(6)卵裂球膜完整性。
[0084]移植然后可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法進(jìn)行。
[0085]實施例1
[0086]材料和方法.從得自屠宰場的卵巢抽取牛未成熟卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，選擇并在四孔皿中成熟24h(Nunc，Roskilde，丹麥)。每孔含有400 y L的碳酸氫鹽緩沖的TCM-199培養(yǎng)基(Gibco BRL, Paisley, UK)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充以15%牛血清(CS ；DanishVeterinary Institute, Frederiksberg,丹麥)、10IU/mL eCG 和 5IU/mL hCG(SuigonanVet ；Intervet Scandinavia, Skovlunde,丹麥)。使胚胎在 38.5°C在 5% C02 于增濕空氣中在礦物油下成熟。利用凍融的Percoll-選擇精子在改良的Tyrode' s培養(yǎng)基中進(jìn)行受
不目o
[0087]在22h后，通過渦旋去除卵丘細(xì)胞，并將假定的受精卵轉(zhuǎn)移至400 Ul培養(yǎng)基——該培養(yǎng)基由含有氨基酸、檸檬酸和肌醇(SOFaaci)并補(bǔ)充抗生素(硫酸慶大霉素，10mg/ml)的合成的輸卵管液體和5% CS組成——中，并在38.5°C下于具有最大濕度的5% C02、5%02,90% N2氣體下溫育。
[0088]溫育器系統(tǒng)已`經(jīng)在以前予以詳細(xì)地描述，并且已經(jīng)證明適于體外胚胎培養(yǎng)(Holm等，1998)。簡言之，將4-孔培養(yǎng)皿放置在倒置Nikon TMD顯微鏡(Diaphot，DFA A/S，哥本哈根，丹麥)的顯微鏡鏡臺上(MultiControl 2000掃描臺,Marzhauser,德國)。通過空氣溫度控制器(Air-Therm?, World Precision Instruments, Aston, UK)調(diào)節(jié)的黑色有機(jī)玻璃溫育箱圍繞鏡臺固定。具有開放底部的塑料蓋被放在培養(yǎng)皿上，并將已經(jīng)經(jīng)過放置在溫育器箱內(nèi)部的洗氣瓶之后的增濕的氣體混合物導(dǎo)入該半封閉培養(yǎng)室中。
[0089]該培養(yǎng)箱先前已經(jīng)證明可用于體外胚胎培養(yǎng)(Holm等，1998，2003)，其提供穩(wěn)定的溫度和濕度條件。在試驗期間我們每周例行的體外胚胎生產(chǎn)用作該基本培養(yǎng)系統(tǒng)完整性的對照。
[0090]照相機(jī)系統(tǒng).縮時記錄通過圖像分析軟件(ImagePro?，Unit One, Birkered5丹
麥)指揮，該圖像分析軟件控制掃描臺在X-軸、y_軸和Z-軸的運動、所連接的高度光敏錄像攝像機(jī)的操作(WAT-902H, Watec, DFA A/S, Copenhagen,丹麥)以及縮時順序在計算機(jī)硬盤上的記錄和存儲。在整個7天的培育期內(nèi)每個胚胎的縮時圖像(總放大率:x265)在30分鐘間隔下以最小光順序進(jìn)行記錄。在記錄之間，胚胎被移出光場。
[0091]手動分析縮時圖像系列由記錄首次出現(xiàn)下列卵裂/胚胎階段一2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、16-細(xì)胞一的時間和具有可見的相干細(xì)胞群和桑葚胚的時間:最大的致密桑葚胚，胚泡的第一擴(kuò)張，胚泡的崩潰以及胚泡的孵化組成。
[0092]基于自動化計算機(jī)的分析由計算差分圖像的標(biāo)準(zhǔn)偏差組成，該標(biāo)準(zhǔn)偏差計算為兩個連續(xù)幀之間的差異。為避免校準(zhǔn)的人為產(chǎn)物以及其他問題，使用下面的詳細(xì)步驟:
[0093]I)圖像采集。(見上述)。[0094]2)通過從序列中的每個圖像中扣除人為產(chǎn)物的散焦參考圖像，去除固定位置的人為產(chǎn)物(照相機(jī)灰塵)。
[0095]3)移位以補(bǔ)償不精確的鏡臺運動(stage movement)。非常簡單的校準(zhǔn)圖像的方法是比較原始差分圖像與在給定方向移動原始圖像之一后以單像素計算的差分圖像。如果改變位置之后計算的差分圖像的方差低于原始的差分圖像的方差，則改變位置產(chǎn)生改進(jìn)的校準(zhǔn)。通過系統(tǒng)地嘗試所有可能的移動方向以及所有相關(guān)的移動幅度，能夠得到校準(zhǔn)的時間序列。然而，在目前的情況下，我們使用由Thevenaz等1998開發(fā)的高級ImageJ macro進(jìn)行圖像校準(zhǔn)。
[0096]4)鑒定感興趣區(qū)(ROI)和外部參考區(qū)域。由于布朗運動排列問題等，比較胚胎內(nèi)的細(xì)胞運動與胚胎外的“運動”是有利的。這是通過描繪胚胎并比較胚胎內(nèi)的差分圖像與胚胎外類似區(qū)域中計算的差分完成的。描繪胚胎通常手動完成。參比區(qū)域:我們選擇無任何胚胎的圖像區(qū)域。
[0097]5)計算強(qiáng)度差。
[0098]6)計算各差分圖像的衍生參數(shù)。計算幾種差分參數(shù)，但是證明最有益的參數(shù)是差分圖像中所有像素的強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差。該參數(shù)在下面被稱為“卵裂球活動”。
[0099]7)鑒定和測定卵裂球活動的峰的形狀。
[0100]8)計算診斷相關(guān)時間間隔的卵裂球活動的標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均值。見實施例4。
[0101]試驗設(shè)計.大約20牛胚胎于Nunc-4孔皿的單孔中一起溫育7天，每30分鐘采集圖像。該試驗被重復(fù)5 次，總計產(chǎn)生99個牛胚胎的縮時圖像系列。
[0102]結(jié)果:
[0103]基于發(fā)育胚胎的縮時圖像系列的定性評價，(基本通過使它們作為電影演示很多次進(jìn)行觀察并記錄變化)，我們觀察到:高質(zhì)量胚胎的指標(biāo)是突然的細(xì)胞分裂，其中真正的細(xì)胞質(zhì)分裂進(jìn)展迅速，并且跟著發(fā)生的其他卵裂球位置的重排快速發(fā)生，接著為很少細(xì)胞位置重排的靜息“期間”，直到下一次細(xì)胞質(zhì)分裂突然開始。壞胚胎經(jīng)常在細(xì)胞質(zhì)分裂之后以及胞質(zhì)細(xì)胞分裂之間顯示出延長的卵裂球位置重排。為定量和記錄這些觀察，我們從縮時圖像系列計算卵裂球活動，如在上面定義的PCT申請中所述。代表性的卵裂球活動示于圖1中。
[0104]一些觀察的活動是由于不同步的細(xì)胞分裂(例如2 — 3 — 4 — 5 — 6 — 7 — 8)和斷裂，這與所觀察的高質(zhì)量胚胎的同步細(xì)胞分裂(例如2 —4，4 —8)相反。
[0105]41個胚胎卵裂球活動以假-凝膠-圖像展示在圖2中，其中活動峰以黑帶表示，不活動是白色的。
[0106]實施例2
[0107]材料和方法.與實施例1相同
[0108]結(jié)果
[0109]在哺乳動物胚胎中的最初蛋白質(zhì)合成使用來自卵母細(xì)胞的母體mRNA，但是在數(shù)次細(xì)胞分裂之后，胚胎基因組被激活、轉(zhuǎn)錄和翻譯。從母體基因組向胚胎基因組的轉(zhuǎn)變在胚胎發(fā)育中是關(guān)鍵的步驟。對于牛而言該期間發(fā)生在8-細(xì)胞期并具有相對長的持續(xù)時間，對于人胚胎而言，該轉(zhuǎn)變發(fā)生在4至8細(xì)胞期的早期并具有較短的持續(xù)時間。
[0110]當(dāng)胚胎基因組被激活并且蛋白質(zhì)合成從母體轉(zhuǎn)向胚胎基因時，對于大多數(shù)哺乳動物而言，觀察到非常少的細(xì)胞運動的靜息期間。如果該期間具有:i)早期開始，ii)非常低的活動(=很少的細(xì)胞運動=靜息的)，和iii)早期終止，則其是高質(zhì)量胚胎的強(qiáng)有力的象征。在壞胚胎中靜息期間經(jīng)常被延遲，并且有時被細(xì)胞運動中斷。顯示13個不同胚胎的卵裂球活動的實例示于圖3中。
[0111]實施例3
[0112]材料和方法.與實施例1相同
[0113]結(jié)果.在隨后停止發(fā)育的壞胚胎中，經(jīng)常觀察到特定的且始終不移動的區(qū)域，其持續(xù)不變并最終導(dǎo)致發(fā)育停止。此類不移動的區(qū)域可與大量斷裂或卵裂球死亡和溶解有關(guān)。如果這些區(qū)域在給定的發(fā)育期大于給定的百分比，則胚胎具有非常低的存活可能性。在高質(zhì)量胚胎中，在每一胞質(zhì)分裂事件之后很快跟著發(fā)生的細(xì)胞活動最初分布在整個胚胎表面上(即所有的卵裂球輕微移動)，僅在桑葚胚期的壓縮之后觀察到局部運動。
[0114]發(fā)育成胚泡的胚胎諸如圖4中的左側(cè)板具有均勻分布的卵裂球活動。不具有均勻分布的卵裂球活動的胚胎諸如圖4中的右側(cè)板從不發(fā)育成胚泡。
[0115]實施例4
[0116]材料和方法.與實施例1相同
[0117]結(jié)果.在不同時間間隔中細(xì)胞運動的量是胚胎質(zhì)量的好指標(biāo)。質(zhì)量相關(guān)的參數(shù)可以從不同時間段中的平均運動的比率和/或不同時間段中標(biāo)準(zhǔn)偏差的比率計算。胚胎選擇程序可以基于這些參數(shù)的值來建立。不同階段(=部分)的實例示于圖5和圖6上。在這種情況下，部分I是受 精之后32至60小時的時間段，部分2是受精之后的60至75小時，部分3是受精之后的75至96小時。
[0118]基于不同部分中的卵裂球活動和/或卵裂球活動的標(biāo)準(zhǔn)偏差，能夠?qū)ε咛ミM(jìn)行分類。在此種情況下，我們使用下述選擇標(biāo)準(zhǔn)，其基于:? Rl =對于給定胚胎，胚泡活動模式的部分I與部分3中的平均胚泡活動之間的比率
[0119]
【權(quán)利要求】
1.用于測定胚胎質(zhì)量的方法，其包括監(jiān)測胚胎一段時間，所述時間的長度足以包括至少一個分裂間期，以及測定分裂間期的持續(xù)時間，從而獲得胚胎質(zhì)量測量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胚胎被監(jiān)測包括至少兩個細(xì)胞分裂期的時間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胚胎被監(jiān)測包括至少三個細(xì)胞分裂期的時間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中所述每個細(xì)胞分裂期的長度被測定。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中所述每個分裂間期的長度被測定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中在至少兩個分裂間期中的細(xì)胞運動期被測定。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中在至少兩個分裂間期中的細(xì)胞運動的程度被測定。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述至少兩個分裂間期是連續(xù)的分裂間期。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中進(jìn)行至少一個細(xì)胞分裂期長度的測定以及分裂間期中細(xì)胞運動的測定。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中進(jìn)行至少一個細(xì)胞分裂期長度的測定以及分裂間期中細(xì)胞運動期的測定。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項`所述的方法，其中進(jìn)行至少一個細(xì)胞分裂期長度的測定和分裂間期中細(xì)胞運動的測定以及分裂間期中細(xì)胞運動期的測定。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中胚胎質(zhì)量測量基于測定的分裂間期的持續(xù)時間表明同步的細(xì)胞分裂的程度。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中所述胚胎是人類胚胎。
14.一種用于選擇適合移植的胚胎的方法，所述方法包括如權(quán)利要求1-13任一項所定義監(jiān)測所述胚胎，獲得胚胎質(zhì)量測量，以及選擇具有最高胚胎質(zhì)量測量的胚胎。
15.用于測定胚胎質(zhì)量的系統(tǒng)，其包含用于監(jiān)測胚胎一段時間的照相機(jī)系統(tǒng)，所述時間的長度足以包括至少一個分裂間期，所述系統(tǒng)進(jìn)一步具有用于測定分裂間期的持續(xù)時間的計算機(jī)，由此獲得胚胎質(zhì)量測量。
【文檔編號】C12N5/073GK103757087SQ201310705183
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2007年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2006年6月16日
【發(fā)明者】尼爾斯·B·拉姆辛, 于爾根·伯恩特森 申請人:尤尼森斯繁殖技術(shù)公司