用于腫瘤細(xì)胞分離的表面聲波微流控芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于腫瘤細(xì)胞分離的表面聲波微流控芯片，包括基底和粘貼在基底上的開設(shè)有微通道的蓋片；微通道包括帶有入口和出口的中間通道，在其入口兩側(cè)開設(shè)有與其相連的細(xì)胞液注入通道，在出口兩側(cè)開設(shè)有與其相連的細(xì)胞收集通道；在注入通道和收集通道之間的中間通道兩側(cè)基底上依次沉積有兩對(duì)頻率、聲強(qiáng)一致的叉指轉(zhuǎn)換器，第二對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器距中間通道中心的距離比第一對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器距中間通道中心的距離大1/4個(gè)表面波波長；在兩對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器之間的中間通道兩側(cè)對(duì)稱開設(shè)有較小細(xì)胞收集通道。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用駐波型表面聲波技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞（CTCs）高效、經(jīng)濟(jì)、無污染的分離，同時(shí)該分離芯片成本廉價(jià)，制備工藝成熟。
【專利說明】用于腫瘤細(xì)胞分離的表面聲波微流控芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞分離技術(shù)，尤其是涉及一種用于腫瘤細(xì)胞分離的表面聲波微流控
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【背景技術(shù)】 [0002]惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，具有很高的致死率。然而原發(fā)性腫瘤的形成卻不是腫瘤病人死亡的主因，90%的腫瘤病人的死亡源于腫瘤病灶的轉(zhuǎn)移，腫瘤的轉(zhuǎn)移主要是由于腫瘤細(xì)胞的遷移引起的。腫瘤細(xì)胞之間的粘附力非常弱，很容易從原發(fā)灶脫落，脫落的腫瘤細(xì)胞分泌一種蛋白溶解酶，破壞周邊宿主結(jié)締組織而使其進(jìn)入外周血循環(huán)，成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Curculating Tumor Cells, CTCs),進(jìn)入循環(huán)的腫瘤細(xì)胞絕大多數(shù)在短期內(nèi)死亡，少數(shù)具有高度活力、高度轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來，相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶。外周血中腫瘤細(xì)胞的存在為腫瘤病灶的轉(zhuǎn)移提供了可能性。通常在CTCs的分離、捕獲中，一般均采用磁珠免疫分離方法，該方法能分離CTCs，但是會(huì)引入抗體、磁珠、熒光標(biāo)記物等材料，在某些情況下會(huì)影響被分離細(xì)胞的活性，甚至是污染細(xì)胞，被分離的細(xì)胞不能直接回收再利用。因此，找到一種簡(jiǎn)單，高效，無污染的分離方法，及時(shí)的監(jiān)測(cè)外周血中腫瘤細(xì)胞的存在性，并實(shí)時(shí)的把腫瘤細(xì)胞從血細(xì)胞中分離出來，對(duì)控制腫瘤的轉(zhuǎn)移以及腫瘤治療具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0003]微流控技術(shù)是一種精確控制和操控微尺度流體、尤其是亞微米結(jié)構(gòu)的技術(shù)。最近十幾年中，它作為一重要平臺(tái)出現(xiàn)在化學(xué)，生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具有尺寸小，試劑用量少，分析速度快，成本低等優(yōu)點(diǎn)。隨著微流控技術(shù)的迅速發(fā)展，聲波開始引入到微流控芯片實(shí)驗(yàn)室上，用于微粒、微液滴、甚至細(xì)胞的分離和操縱。微粒的聲波操縱方式有體聲波和表面聲波。表面聲波是機(jī)械波(即聲波)，是電場(chǎng)激勵(lì)壓電基片而使之震動(dòng)，基片振動(dòng)激勵(lì)了周圍介質(zhì)粒子的振動(dòng)，由此產(chǎn)生的彈性波，它沿著壓電晶體表面?zhèn)鞑?，能量只集中在晶體表面2-3個(gè)波長的范圍。和基于體聲波的微流控分離技術(shù)相比，基于表面聲波的微流控分離方法對(duì)設(shè)備制作工藝要求較低，低能耗，而且還具有較好的通用性。
[0004]現(xiàn)有基于表面聲波的微流控技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，表面聲波能依據(jù)大小和密度對(duì)微粒實(shí)現(xiàn)分離。2013年，Ding et al.對(duì)微流體中受到表面聲波作用的微粒受力的理論原理進(jìn)行了深入全面的剖析。這些微粒受到兩個(gè)力的作用:一個(gè)是聲壓波動(dòng)形成的聲輻射力；另一個(gè)是表面聲波引起的聲流。兩個(gè)力共同作用于微流體中的微粒，但是兩個(gè)力誰起主導(dǎo)作用，主要還是依據(jù)微粒的大小。當(dāng)微粒尺寸大于一個(gè)臨界值，微粒的運(yùn)動(dòng)就主要由聲輻射力主導(dǎo)，運(yùn)動(dòng)到波節(jié)或波腹處就不再運(yùn)動(dòng)；而小于臨界尺寸的微粒，就跟隨聲流做漩渦運(yùn)動(dòng)。大小不一樣的微粒，就可以在不同力的作用下實(shí)現(xiàn)分離。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該臨界尺寸主要和聲頻相關(guān)，在流動(dòng)液體中，大于臨界尺寸的顆粒，在聲輻射力的作用下遷移到遠(yuǎn)處的波節(jié)或波腹處，小于臨界尺寸的顆粒仍然沿著液流方向運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)顆粒的分離。聲場(chǎng)中，作用于顆粒的聲輻射力的大小和微粒的大小、密度、可壓縮率三者相關(guān)。大于臨界尺寸的顆粒中，尺寸較大的顆粒受到較大的聲輻射力作用，其遷移到波節(jié)或波腹的速度比尺寸較小的顆?？煲恍Ｔ诖私Y(jié)論基礎(chǔ)上，有研究采用尺寸梯度方法有效的實(shí)現(xiàn)了對(duì)血細(xì)胞的分離。
[0005]物理性質(zhì)上，腫瘤細(xì)胞(CTCs)和血細(xì)胞在大小、可壓縮率、密度三者上都存在差異。由于作用于聲場(chǎng)中細(xì)胞上的聲輻射力除了受到細(xì)胞大小的影響，還受到由細(xì)胞密度和可壓縮率共同決定的聲比因子的影響，故截至目前，還未有人將基于表面聲波的微流控分離技術(shù)應(yīng)用到CTCs分離中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、制備工藝成熟、高效無污染的用于腫瘤細(xì)胞分離的表面聲波微流控芯片。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案:
本發(fā)明所述的用于腫瘤細(xì)胞分離的表面聲波微流控芯片，包括基底和通過等離子鍵合粘貼在所述基底上的開設(shè)有微通道的蓋片；所述微通道包括水平設(shè)置的寬度為1/2表面波波長的中間通道，所述中間通道的入口和出口分別延伸至蓋片的上表面，在所述中間通道的入口兩側(cè)對(duì)稱開設(shè)有與所述中間通道相連通的細(xì)胞液注入通道，在所述中間通道的出口兩側(cè)對(duì)稱開設(shè)有與所述中間通道相連通的細(xì)胞收集通道，所述細(xì)胞液注入通道的入口和細(xì)胞收集通道的出口均延伸至蓋片的上表面；在位于細(xì)胞液注入通道和細(xì)胞收集通道之間的中間通道兩側(cè)的基底上依次沉積有兩級(jí)駐波型表面聲波生成器，所述駐波型表面聲波生成器為等距離沉積在中間通道兩側(cè)且頻率、聲強(qiáng)一致的兩對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器，靠近中間通道出口的第二對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器距中間通道中心的距離比靠近中間通道入口的第一對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器距中間通道中心的距離大1/4個(gè)表面波波長；在位于兩對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器之間的中間通道兩側(cè)對(duì)稱開設(shè)有出口延伸至蓋片上表面的 較小細(xì)胞收集通道。
[0008]基底由128° Y切，X傳播的鈮酸鋰材質(zhì)(LiNbO3)制作；所述蓋片由聚二甲基硅氧燒(PDMS)材質(zhì)制作；所述叉指換能器的叉指為由Au/Cr(100nm/10nm)薄膜沉積制備而成；表面聲波的頻率由待分離細(xì)胞體積決定，待分離細(xì)胞越大，所需的頻率越小，待分離細(xì)胞體積越小，所需頻率越大。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用駐波型表面聲波技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞(CTCs)高效、經(jīng)濟(jì)、無污染的分離。本發(fā)明芯片結(jié)合CTCs的物理性質(zhì)的不同，依據(jù)CTCs和血細(xì)胞在大小，密度和可壓縮率三者之間的差異，不需要加入任何材料即可實(shí)現(xiàn)CTCs的分離，而且分離出來的細(xì)胞都可以重復(fù)再利用。同時(shí)該分離芯片成本廉價(jià)，制備工藝成熟。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0011]圖2a、圖2b是圖1中中間通道內(nèi)聲波分離細(xì)胞示意圖。
[0012]【具體實(shí)施方式】
如圖1所示，本發(fā)明所述的用于腫瘤細(xì)胞分離的表面聲波微流控芯片，包括LiNbO3基底I和通過等離子鍵合粘貼在LiNbO3基底I上的開設(shè)有微通道的PDMS蓋片2 ;其中微通道包括水平設(shè)置的寬度為1/2表面波波長(λ )的中間通道3，中間通道3的入口 4和出口5分別延伸至蓋片2的上表面，在中間通道3的入口兩側(cè)對(duì)稱開設(shè)有與中間通道相連通的細(xì)胞液注入通道6，在中間通道3的出口兩側(cè)對(duì)稱開設(shè)有與中間通道相連通的細(xì)胞收集通道7，細(xì)胞液注入通道6的入口和細(xì)胞收集通道7的出口均延伸至蓋片2的上表面；在位于細(xì)胞液注入通道6和細(xì)胞收集通道7之間的中間通道兩側(cè)的基底I上依次沉積有兩級(jí)駐波型表面聲波生成器，即等距離沉積在中間通道兩側(cè)且頻率、聲強(qiáng)一致的兩對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器，靠近中間通道出口的第二對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器8距中間通道3中心的距離比靠近中間通道入口的第一對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器9距中間通道3中心的距離大1/4個(gè)表面波波長(如第一對(duì)兩叉指轉(zhuǎn)換器9距中間通道3中心的距離為h，則第二對(duì)兩叉指轉(zhuǎn)換器8距中間通道3中心的距離應(yīng)為h+λ /4);第一對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器9生成的駐波波節(jié)位于中間通道3的中心，第二對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器8生成的駐波波節(jié)位于中間通道的兩側(cè)邊；在位于兩對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器之間的中間通道3兩側(cè)對(duì)稱開設(shè)有出口延伸至蓋片上表面的較小細(xì)胞收集通道10。
[0013]本發(fā)明的微流控芯片分兩級(jí)實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的分離，即通過兩對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器在中間通道內(nèi)生成的駐波型表面聲波實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的分離。
[0014]中間通道的入口 4中注入血清或生理鹽水，CTCs和血細(xì)胞混合液自細(xì)胞液注入通道6的兩個(gè)入口在蠕動(dòng)泵作用下進(jìn)入中間通道3，沿著中間通道3的兩側(cè)前移，在經(jīng)過第一對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器9時(shí)，如圖2a所示，混合細(xì)胞被表面聲波按照細(xì)胞大小分離，體積較大的細(xì)胞在聲輻射力的作用下，遷移到中心通道3中心的波節(jié)處，而體積較小的細(xì)胞仍然隨著液流沿中間通道兩邊前移，至較小細(xì)胞收集通道10的出口處被收集。在中間通道3中心處的較大細(xì)胞在通過第二對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器8時(shí)，如圖2b所示，中間通道3內(nèi)駐波的波節(jié)在通道邊沿，聲比因子較大(即可壓縮率大、密度大)的細(xì)胞就獲得較大的聲輻射力，而向中間通道邊沿遷移，同時(shí)壓縮率小、密度小的CTCs獲得的聲輻射力小，仍然停留在中間通道3的中心，隨同液流前進(jìn)，在中間通道的出口· 5處被收集得到。
【權(quán)利要求】
1.一種用于腫瘤細(xì)胞分離的表面聲波微流控芯片，包括基底(I)和通過等離子鍵合粘貼在所述基底(I)上的開設(shè)有微通道的蓋片(2);其特征在于:所述微通道包括水平設(shè)置的寬度為1/2表面波波長的中間通道(3)，所述中間通道(3)的入口(4)和出口(5)分別延伸至蓋片(2)的上表面，在所述中間通道(3)的入口兩側(cè)對(duì)稱開設(shè)有與所述中間通道相連通的細(xì)胞液注入通道(6)，在所述中間通道(3)的出口兩側(cè)對(duì)稱開設(shè)有與所述中間通道相連通的細(xì)胞收集通道(7)，所述細(xì)胞液注入通道(6)的入口和細(xì)胞收集通道(7)的出口均延伸至蓋片(2)的上表面；在位于細(xì)胞液注入通道(6)和細(xì)胞收集通道(7)之間的中間通道兩側(cè)的基底(I)上依次沉積有兩級(jí)駐波型表面聲波生成器，所述駐波型表面聲波生成器為等距離沉積在中間通道兩側(cè)且頻率、聲強(qiáng)一致的兩對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器，靠近中間通道出口的第二對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器(8)距中間通道(3)中心的距離比靠近中間通道入口的第一對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器(9)距中間通道(3)中心的距離大1/4個(gè)表面波波長；在位于兩對(duì)叉指轉(zhuǎn)換器之間的中間通道(3)兩側(cè)對(duì)稱開設(shè)有出口延伸至蓋片上表面的較小細(xì)胞收集通道(10)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤細(xì)胞分離的表面聲波微流控芯片，其特征在于:所述基底(I)由128° Y切，X傳播的鈮酸鋰材質(zhì)制作；所述蓋片(2)由聚二甲基硅氧烷材質(zhì)制作；所述叉指換能器的叉指 為由Au/Cr薄膜沉積制備而成。
【文檔編號(hào)】C12M1/42GK103667051SQ201310703508
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】張麗果, 汲振余, 赫培遠(yuǎn), 趙立群, 鄭立運(yùn), 歐陽軍, 張壯麗 申請(qǐng)人:河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院