毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH及其編碼蛋白的制作方法
【專利摘要】毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH及其編碼蛋白，本發(fā)明涉及一種與植物抗旱性有關(guān)的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列，還涉及該基因抵抗干旱機制的研究及轉(zhuǎn)基因植物抗旱能力的分析與應(yīng)用。本發(fā)明提供了毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH及其編碼蛋白。毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的基因序列如序列表Seq?ID?No：1所示。毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的編碼蛋白，編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq?ID?No：2所示。本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【專利說明】毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH及其編碼蛋白
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種與植物抗旱性有關(guān)的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列，還涉及該基因抵抗干旱機制的研究及轉(zhuǎn)基因植物抗旱能力的分析與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]自然界中，植物的生長發(fā)育與環(huán)境的變化密切相關(guān)。環(huán)境中存在多種多樣的動態(tài)因素，如干旱、高低溫等，這些因素在特定環(huán)境下會對植物造成不利影響，形成非生物脅迫。而干旱是制約植物生長的一個重要脅迫因素。我國干旱、半干旱地區(qū)約占國土面積的1/2，主要分布于北方和西北地區(qū)，干旱尤其是重大干旱引起的水資源短缺、糧食危機、生態(tài)惡化(如荒漠化)，直接威脅到國家的長期糧食安全和社會穩(wěn)定。因而，研究植物的耐旱特征、尋找植物抵御干旱脅迫的機制，改造植物的耐旱特性，進一步開發(fā)和利用耐旱植物資源有著重要的經(jīng)濟價值和實用價值。
[0003]苔蘚植物是最古老的由水生向陸生過渡的植物類群，現(xiàn)存的種類數(shù)量僅次于被子植物，分布于世界各地，包括南北兩極和赤道。中國是苔蘚大國，地理自然環(huán)境復(fù)雜，使得苔蘚植物的多樣性非常豐富，其中已報道的蘚類植物有67科421屬近2500種。而蘚類植物在長期的進化過程及自然選擇下形成了適應(yīng)環(huán)境的多種多樣的形態(tài)結(jié)構(gòu)。其構(gòu)造較簡單，沒有真正的維管系統(tǒng)，在進化上較為低等。但是許多種類能在干旱、高寒、高溫和弱光等其他植物難以生存的極端環(huán)境中繁衍生長，如一些耐旱種類能生活在裸露的巖石上，長期忍受干燥，具有較強的抗旱能力。
[0004]毛尖紫萼蘚(Grimmia pilifera)屬紫萼蘚科(Grimmiaceae)紫萼蘚屬(Grimmia)，生于光照強烈的巖石上或林下石面上，在干燥幾分鐘后葉片就會卷縮，慢慢進入休眠狀態(tài)，而復(fù)水后瞬間可恢復(fù)活力，積累了大量的抗逆基因，是典型的小型耐旱蘚類。因此，從毛尖紫萼蘚中克隆出與抗旱性有關(guān)的基因，初步研究其潛在的生物學(xué)功能，可為深入研究該基因的抗旱相關(guān)機理和苔蘚植物的耐旱機制提供理論依據(jù)，為創(chuàng)造新的抗旱性材料奠定基礎(chǔ)。
[0005]泛素(ubiquitin)是真核生物中廣泛存在的一類具有76個氨基酸殘基的高度保守的小蛋白，在動植物、藻類和酵母中僅有1-3個氨基酸差異，主要功能是標記生物體內(nèi)需要分解掉的蛋白質(zhì)，使其被水解，避免異常蛋白過多積累對生物體造成傷害。植物體內(nèi)存在一系列的酶介導(dǎo)著泛素與底物的結(jié)合，但同時也有許多酶進行著相反作用，它們將泛素從標記的底物上水解下來并回收泛素，行使著泛素化逆向調(diào)節(jié)的作用，這些酶叫做去泛素化酶。泛素羧基末端水解酶(ubiquitin Carboxy-terminal hydrolase,UCHs)就是其中一種，可通過打 開泛素C末端的甘氨酸與靶蛋白之間的異肽鍵，將泛素釋放出來，從而參與細胞內(nèi)許多重要的生化過程，如DNA損傷修復(fù)、重要蛋白質(zhì)翻譯后修飾和改造、離子通道、細胞器的形成等。UCHs含有組氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸等活性位點，這種特殊的結(jié)構(gòu)對于調(diào)節(jié)其催化酶活性起著關(guān)鍵作用。UCHs家族由UCH-L1，UCH-L2，UCH-L3，UCH-L4，UCH-L5五個成員組成，主要功能是將泛素羧基末端所連接的小肽或酯類分子水解下來，特異性識別泛素C-末端區(qū)域，促進泛素再循環(huán)，對泛素系統(tǒng)的正常運行非常重要。
[0006]UCHs的研究大部分集中在人和哺乳動物中，植物中研究的較少，苔蘚植物中尚未有該基因研究的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH及其編碼蛋白。
[0008]毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的基因序列如序列表Seq ID No:1所
/Jn ο
[0009]毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的編碼蛋白，編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No:2所示。
[0010]本發(fā)明包含以下有益效果:
[0011]本發(fā)明以毛尖紫萼蘚為材料，克隆出與抗旱緊密相關(guān)的基因泛素羧基末端水解酶基因，研究其基本的生物學(xué)特性和功能，不僅為植物基因工程育種提供優(yōu)良基因資源，而且對于作物抗逆育種顯得尤為重要。
[0012]從轉(zhuǎn)基因植株耐旱性鑒定中可以看出，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力與野生型植株有著較大的區(qū)別。通過測定轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系在干旱脅迫處理后各項生理指標的動態(tài)變化得知，煙草植物體內(nèi)非常重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白和可溶性糖的含量增加，轉(zhuǎn)基因植株的可溶性蛋白的含量是對照的2.61倍，而轉(zhuǎn)基因植株可溶性糖的含量是對照的
2.37倍。膜系統(tǒng)是受環(huán)境脅迫最敏感的部位之一，干旱脅迫使膜透性增加產(chǎn)生大量的MDA，在干旱20天時轉(zhuǎn)基因植株MD A含量為對照的1.3倍。脯氨酸在受到干旱脅迫時植物體內(nèi)主動積累參與植物的滲透調(diào)節(jié)，在干旱20天時轉(zhuǎn)基因植株為對照的2.05倍。以上指標都表明轉(zhuǎn)GpUCH基因可能通過調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)的含量提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性，以維持正常的生理生化過程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為實施例中毛尖紫萼蘚總RNA圖；
[0014]圖2為實施例中:V -RACE結(jié)果圖；其中，M為DNA Marker，I為:V -RACE擴增結(jié)果;
[0015]圖3為實施例中GPUCH PCR擴增結(jié)果圖；其中，M為DNA Marker, I為PCR擴增結(jié)果;
[0016]圖4為實施例中重組質(zhì)粒PGpUCH雙酶切結(jié)果圖；其中，M為DNA Marker，I為GpUCH酶切產(chǎn)物；
[0017]圖5為實施例中重組質(zhì)粒PR1-GpUCH雙酶切結(jié)果圖；其中，M為DNA Marker, I為PR1-GpOsmC酶切產(chǎn)物；
[0018]圖6為實施例中煙草再生體系建立過程中共培養(yǎng)圖；
[0019]圖7為實施例中煙草再生體系建立過程中生芽培養(yǎng)圖；
[0020]圖8為實施例中煙草再生體系建立過程中伸長培養(yǎng)圖；
[0021]圖9為實施例中煙草再生體系建立過程中生根培養(yǎng)圖；
[0022]圖10為實施例中煙草再生體系建立過程中室外培養(yǎng)圖；[0023]圖11為實施例中轉(zhuǎn)基因煙草T1 RPCR結(jié)果圖；其中，M:DNA Marker ; 1-15:轉(zhuǎn)化植株；16:純水對照；CK-:非轉(zhuǎn)化植株；
[0024]圖12為實施例中轉(zhuǎn)基因煙草T1 RRT-PCR結(jié)果圖；其中，M:DNA Marker ; 1-15:轉(zhuǎn)化植株；16:純水對照；CK-:非轉(zhuǎn)化植株；
[0025]圖13為實施例中干旱脅迫對土壤含水量的影響圖；其中，A:轉(zhuǎn)基因煙草土壤水分含量；B:野生型煙草土壤水分含量；
[0026]圖14為實施例中干旱脅迫對1\代煙草可溶性蛋白含量的影響圖；其中，A:轉(zhuǎn)基因煙草可溶性蛋白含量變化；B:野生型煙草可溶性蛋白含量變化；C:未處理野生型煙草可溶性蛋白含量變化； [0027]圖15為實施例中干旱脅迫對T1代煙草可溶性糖含量的影響圖；其中，A:轉(zhuǎn)基因煙草可溶性糖含量變化；B:野生型煙草可溶性糖含量變化；C:未處理野生型煙草可溶性糖含量變化；
[0028]圖16為實施例中干旱脅迫對1\代煙草丙二醛含量的影響圖；其中，A:轉(zhuǎn)基因煙草丙二醛含量變化；B:野生型煙草丙二醛含量變化；C:未處理野生型煙草丙二醛含量變化；
[0029]圖17為實施例中干旱脅迫對1\代煙草脯氨酸含量的影響圖；其中，A:轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量變化；B:野生型煙草脯氨酸含量變化；C:未處理野生型煙草脯氨酸含量變化。
【具體實施方式】
[0030]【具體實施方式】一:本實施方式的毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的基因序列如序列表Seq ID No: I所不。
[0031]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的編碼蛋白，編碼蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
[0032]其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一相同。
[0033]通過以下試驗驗證本發(fā)明的效果:
[0034]一: GPUCH基因的克隆
[0035]1.以毛尖紫萼蘚為材料，采用改良的SDS法提取總RNA:
[0036](I)取0.3g毛尖紫萼蘚于液氮中快速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中，加入750 μ LSDS, 350 μ L Tris 飽和酚，350 μ L 氯仿，震蕩 IOmin, 4°C 12000rpm 離心 IOmin ；
[0037]SDS配方:2 % SDS, 0.0125mol/L 四硼酸鈉，50mmol/L Tris-Cl，200mmol/L氯化鈉，20mmol/L EDTA ；
[0038](2)取上清,分別加入350 μ L Tris飽和酹和氯仿,震蕩IOmin, 4°C 12000rpm離心IOmin ；
[0039](3)重復(fù)步驟(2) —次；
[0040](4)取上清,加入等體積氯仿,震蕩IOmin, 4°C 12000rpm離心IOmin ；
[0041](5)取上清，加入1/2體積的8mmol/L LiCl，1/2體積75 %乙醇，于_20°C沉降Ih ；
[0042](6) 40C 12000rpm離心20min，棄上清，用600 μ L75 %乙醇洗滌沉淀2次，冰浴晾干;
[0043](7)加適量DEPC處理水溶解沉淀，用I %瓊脂糖凝膠電泳檢查其完整性，檢測結(jié)果如圖1所示。[0044]2.以RNA為模板，按照Promega公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書對2 μ g總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。
[0045]3.GpUCH 基因克隆
[0046]從毛尖紫萼蘚干旱cDNA文庫中獲得的GpUCH基因長為666bp，經(jīng)NCBI Blast驗證有完整的5 '端，無3 '端，因此設(shè)計3 ' -RACE弓丨物GpUCH_GSP和GpUCH_NGSP，分別與通用引物UMP進行2輪PCR，擴增獲得全長序列，操作步驟按SMART-ER?RACE cDNAAmplification Kit (Clontech)試劑盒說明書進行。將目的條帶進行膠回收，回收產(chǎn)物與PMD-18T Simple Vector連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆并測序，命名為PGpUCH。測序后得到871bp的特異性條帶。如圖2和3所示(2為:V -RACE擴增結(jié)果；3為PCR擴增結(jié)果)。
[0047]其中，所述SMART-ER?RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒購買自 Clontech 公司；
[0048]毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GPUCH制備過程中設(shè)計的上游引物3' -RACE特異上游引物如序列表SEQ ID N0.3所示；
[0049]毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GPUCH制備過程中設(shè)計的下游引物3' -RACE特異下游引物如序列表SEQ ID N0.4所示；
[0050]通用引物UMP核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.5所示；
[0051]全長驗證引物上游GpUCH-F引物核苷酸序列通用引物UMP核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.6 所示；
[0052]全長驗證引物下游GpUCH-R引物核苷酸序列通用引物UMP核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.7 所示；
[0053]二、含有目的基因GpUCH表達載體的構(gòu)建
[0054]1.提取含有GpUCH基因的T載體質(zhì)粒，用Sal I和BamH I雙酶切，獲得帶有粘性末端的GpUCH基因的cDNA片段。結(jié)果如圖3所示(泳道M為Marker2000，泳道I為PGpUCH酶切產(chǎn)物)克隆載體雙酶切反應(yīng)體系如表1所示:
【權(quán)利要求】
1.毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH，其特征在于毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的基因序列如序列表Seq ID No: I所不。
2.毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的編碼蛋白，其特征在于該蛋白由如權(quán)利要求I所述的毛尖紫萼蘚泛素羧基末端水解酶基因GpUCH編碼，編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No:2所示。
【文檔編號】C12N15/57GK103695402SQ201310703425
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】沙偉, 劉博 , 張梅娟, 宋璐, 安洪雪 申請人:齊齊哈爾大學(xué)