一種β-葡萄糖苷酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種β-葡萄糖苷酶及其應(yīng)用，所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E，為首次從纖維素酶產(chǎn)生菌胞外粗酶液中分離得到。所述β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。所述β-葡萄糖苷酶的表達(dá)基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發(fā)明所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E在誘導(dǎo)纖維素酶或者半纖維素酶合成和提高產(chǎn)纖維素酶真菌胞外纖維素酶糖化水解效率方面都發(fā)揮了獨(dú)特的作用。
【專利說明】一種P-葡萄糖苷酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種0 -葡萄糖苷酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖往往需要至少三種不同的酶蛋白的協(xié)同作用，外切葡聚糖酶(纖維二糖水解酶，CBH)，作用于纖維素線狀結(jié)構(gòu)的末端，水解(6-1,4糖苷鍵，依次從纖維素的末端切下纖維二糖。它可以作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)。(2)內(nèi)切葡聚糖酶(EG)。這類酶作用于纖維素結(jié)構(gòu)內(nèi)部的無定形區(qū)，隨機(jī)水解(6-1,4糖苷鍵，將長鏈的纖維素截短，產(chǎn)生大量含有非還原性和還原性末端的小分子纖維素。內(nèi)切葡聚糖酶的作用是為外切酶提供大量的反應(yīng)末端。(3) P -葡萄糖苷酶(BG)。這類酶將纖維二糖或者短鏈葡聚糖水解成葡萄糖。3 -葡萄糖苷酶參與纖維素水解的最后一步，常常被認(rèn)為是纖維素降解過程的限速酶，也是利用纖維素酶進(jìn)行高效生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要瓶頸之一。3 -葡萄糖苷酶的主要功能有兩個(gè)，其一是其可以分解纖維二糖產(chǎn)生葡萄糖，減少了纖維二糖對(duì)外切酶和內(nèi)切酶的產(chǎn)物抑制作用；其二是其可以將葡萄糖進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基作用合成有誘導(dǎo)作用的二糖物質(zhì)，如龍膽二糖，槐糖。這些有誘導(dǎo)作用的二糖物質(zhì)可以促進(jìn)纖維素酶和半纖維素酶的誘導(dǎo)合成。雖然最常見的(6-葡萄糖苷酶(Cel3A)已經(jīng)被深入研究很多年，但是其轉(zhuǎn)糖基作用不明顯。為了進(jìn)一步提高纖維素水解效率，和解析纖維素酶作用機(jī)理，亟待發(fā)掘新型的(6-葡萄糖苷酶。
[0003]里氏木霉測(cè)序后發(fā)現(xiàn)真菌胞外存在七種潛在的(6-葡萄糖苷酶，分別為CellA，CellB, Cel3A, Cel3B, Cel3C, Cel3D和Cel3E。Cel3E是胞外唯——個(gè)沒有被深入研究的-葡萄糖苷酶，至今從未在真菌胞外粗酶液中分離出來，其酶學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能不明晰清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是從檜狀青霉的胞外分離純化得到了新型的P -葡萄糖苷酶，其在纖維素酶誘導(dǎo)，木質(zhì)纖維素降解方面發(fā)揮了獨(dú)特的作用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為:
[0006]一種0 -葡萄糖苷酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]一種0 -葡萄糖苷酶的表達(dá)基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]一種如權(quán)利要求1所述的P -葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，從檜狀青霉胞外粗酶液中分離如權(quán)利要求1所述的P-葡萄糖苷酶。
[0009]優(yōu)選的是，從真菌胞外粗酶液中提取蛋白質(zhì)，使用分子篩凝膠層析柱SephadexS-200從蛋白質(zhì)中分離出如權(quán)利要求1所述的P -葡萄糖苷酶。
[0010]優(yōu)選的是，使用pH值為4.8~5.0的物質(zhì)的量濃度為18~22mM的醋酸-醋酸鈉溶液，以0.15~0.3mL/min沖洗所述分子篩凝膠層析柱。
[0011]一種如權(quán)利要求1所述的(6-葡萄糖苷酶在誘導(dǎo)纖維素酶產(chǎn)生菌合成纖維素酶和半纖維素酶中的應(yīng)用。
[0012]優(yōu)選的是，利用(6-葡萄糖苷酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為龍膽二糖和槐糖，以誘導(dǎo)纖維素酶合成，以及利用3 -葡萄糖苷酶將木三糖水解為木二糖，以誘導(dǎo)纖維素酶或者半纖維素酶合成。
[0013]一種如權(quán)利要求1所述的3 -葡萄糖苷酶在提高纖維素酶產(chǎn)生菌胞外纖維素酶糖化水解效率中的應(yīng)用。
[0014]優(yōu)選的是，所述纖維素酶產(chǎn)生菌為里氏木霉或者檜狀青霉。
[0015]本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明是首次從真菌細(xì)胞的胞外粗酶液中分離出來，并且是從檜狀青霉的胞外分離純化得到的新型的3 -葡萄糖苷酶，本發(fā)明所述3 -葡萄糖苷酶PpCe13E與底物親和能力極強(qiáng)，比如:以PNPG為底物，PpCel3E Km值為0.0019mM,為已報(bào)道的真菌胞外3 -葡萄糖苷酶Km最低的。本發(fā)明所述3 -葡萄糖苷酶在提高產(chǎn)纖維素酶真菌胞外纖維素酶糖化水解效率和在提高里氏木霉或者檜狀青霉胞外纖維素酶糖化水解效率中起到很大的作用。本發(fā)明所述(6-葡萄糖苷酶通過轉(zhuǎn)糖基化作用將葡萄糖合成為龍膽二糖和槐糖以誘導(dǎo)纖維素酶合成，所述3-葡萄糖苷酶通過水解木三糖成為木二糖以誘導(dǎo)半纖維素酶合成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明所述P -葡萄糖苷酶PpCel3E的同源樹。
[0017]圖2為本發(fā)明所述P -葡萄糖苷酶PpCel3E提高里氏木霉和檜狀青霉的胞外纖維素酶糖化水解效率的比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0019]本發(fā)明所述的P -葡萄糖苷酶為從檜狀青霉的胞外粗酶液中發(fā)現(xiàn)并分離出來的，其序列與糖苷水解酶家族3相似，但是與常見的Cel3A不同，其分類屬于Cel3E，由于其來自檜狀青霉，所以命名為PpCel3E。新型的(6-葡萄糖苷酶(PpCel3E)與其他真菌的Cel3E序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，相似度大約為60%左右(如圖1所示)。PpCel3E與黑曲霉的Cel3E同源性最高，為61%。
[0020]實(shí)施例1:分離純化P -葡萄糖苷酶方法步驟為:
[0021](I).制備檜狀青霉的孢子懸液，將孢子懸液接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的容器中，發(fā)酵培養(yǎng)液包含質(zhì)量百分比為2% -8%的碳源，0.1% -5%的有機(jī)氮源，以及0.0001% -10%的無機(jī)鹽，pH值調(diào)節(jié)在3.0-5.0之間。將容器置于搖床上震蕩培養(yǎng)；
[0022](2).發(fā)酵液利用高速離心，除去雜質(zhì)，保留上清可溶性蛋白的部分。通過IOkDa膜截留蛋白，超濾濃縮蛋白質(zhì)；
[0023](3).將濃縮后的蛋白置于分子篩凝膠層析柱S^hadex S-200，對(duì)樣品進(jìn)行收集；
[0024](4)新型的(6-葡萄糖苷酶鑒定由蛋白質(zhì)質(zhì)譜MALD1-T0F鑒定；
[0025](5).以葡萄糖苷pNPG為底物，對(duì)純化后的收集液測(cè)定(6-葡萄糖苷酶酶活力,利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE對(duì)純化后蛋白純度進(jìn)行檢測(cè)。[0026]其中，
[0027]檜狀青霉(Penicilliumpiceum)H16,保藏號(hào):CGMCC N0.8339,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(china general microbiological culturecollection center)。
[0028]針對(duì)檜狀青霉，最適的培養(yǎng)基條件如下:2.7 % microcrystalline cellulose,3.3% corncob steep liquor, 0.5% (NH4) 2804,0.6 % KH2PO4,0.1 % MgSO4,0.25 % CaCO3,and0.2% Tween-80.發(fā)酵使用的玻璃容器一般選擇300mL的三角瓶，培養(yǎng)50mL的培養(yǎng)液，于28度培養(yǎng)箱，水平震蕩180rpm，5天。
[0029]蛋白分離純化使用的儀器AKTA purifier (GE, Sweden)。使用pH值為4.8~5.0的物質(zhì)的量濃度為18~22mM的醋酸-醋酸鈉溶液，以0.15~0.3mL/min沖洗所述分子篩凝膠層析柱。
[0030]本發(fā)明所述蛋白分離純化后，對(duì)分離得到的蛋白進(jìn)行了酶活力測(cè)定與MALD1-T0F相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白的種類。通過MALD1-T0F鑒定蛋白質(zhì)后，得到所述(6-葡萄糖苷酶的一段肽段序列“HYIGNEQETNR”，通過BLAST在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)該肽段與黑曲霉CBS513.88的BGL M相似度高達(dá)92.977%，驗(yàn)證了所述P -葡萄糖苷酶屬于糖苷水解酶家族3。
[0031]實(shí)施例2:0-葡萄糖苷酶的性質(zhì)的研究
[0032]I)應(yīng)用本領(lǐng)域常規(guī)方法將(6-葡萄糖苷酶對(duì)與羧甲基纖維素(CMC-Na)^Kg-(Salicin)，PNPC，微晶纖維素(Avicel)，木聚糖(Xylan)、PNPG，和纖維二糖分別進(jìn)行酶活力檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果如下表1所示:PpCel3E對(duì)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，水楊苷(Salicin)，PNPC，微晶纖維素(Avice l)， 木聚糖(Xylan)都沒有酶活力。對(duì)PNPG，纖維二糖有較高的酶活力分別為31.0IU/mg, 14.4IU/mg。PpCel3E對(duì)纖維寡糖具有水解能力，可以將纖維三糖分解為纖維二糖和葡萄糖，酶活力高達(dá)125IU/mg。
【權(quán)利要求】
1.一種(6-葡萄糖苷酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種(6-葡萄糖苷酶的表達(dá)基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.—種如權(quán)利要求1所述的(6-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，從檜狀青霉胞外粗酶液中分離如權(quán)利要求1所述的P-葡萄糖苷酶。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，從真菌胞外粗酶液中提取蛋白質(zhì)，使用分子篩凝膠層析柱Sephadex S-200從蛋白質(zhì)中分離出如權(quán)利要求1所述的P -葡萄糖苷酶。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，使用pH值為4.8~5.0的物質(zhì)的量濃度為18~22mM的醋酸-醋酸鈉溶液，以0.15~0.3mL/min沖洗所述分子篩凝膠層析柱。
6.一種如權(quán)利要求1所述的3 -葡萄糖苷酶在誘導(dǎo)纖維素酶產(chǎn)生菌合成纖維素酶和半纖維素酶中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，利用(6-葡萄糖苷酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為龍膽二糖和槐糖，以誘導(dǎo)纖維素酶合成，以及利用3 -葡萄糖苷酶將木三糖水解為木二糖，以誘導(dǎo)纖維素酶或者半纖維素酶合成。
8.—種如權(quán)利要求1所述的3 -葡萄糖苷酶在提高纖維素酶產(chǎn)生菌胞外纖維素酶糖化水解效率中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的纖維素酶產(chǎn)生菌的應(yīng)用，其特征在于，所述纖維素酶產(chǎn)生菌為里氏木霉或者檜狀青霉。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK103710326SQ201310686413
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】高樂, 張東遠(yuǎn), 陳樹林 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所