一種由海洋細菌分泌的褐藻膠裂解酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術領域】。具體涉及從廢料樣品中篩選得到的一株海洋細菌Cobetiasp.WG-007及其分泌的褐藻膠裂解酶和該酶的制備方法。結合形態(tài)學及生理生化特性，該菌株屬于Cobetia屬，并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.7964。該菌株分泌褐藻膠裂解酶，通過超濾濃縮、Q-Sepharose強陰離子交換層析、PhenylSepharose6FastFlow疏水層析和Superdex-G100凝膠過濾技術對其純化，獲得電泳純度的褐藻膠裂解酶，經SDS-PAGE確定該菌株產生的褐藻膠裂解酶的分子量為35.0KDa。
【專利說明】一種由海洋細菌分泌的褐藻膠裂解酶及其制備方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】。具體涉及一種由海洋細菌CbAeiiasp.WG-007分泌的褐藻膠裂解酶及其制備方法。
【背景技術】
[0002]褐藻膠又稱褐藻酸,是由β-D-甘露糖醒酸(mannuronate,M)和a-L-古洛糖醒酸(guluix)nate，G)組成的直鏈多糖。褐藻膠主要來源于海藻、海帶、馬尾藻和巨藻等，其結構復雜，物化性質多樣，被廣泛應用到醫(yī)藥、食品級化妝品等行業(yè)。褐藻膠裂解酶是一類通過β -消去反應斷裂褐藻膠的酶，因其具有專一、高效及反應溫和等優(yōu)點，被視為改造褐藻膠的有力工具。此外，褐藻寡糖不僅具有良好的抗腫瘤活性和抗凝活性，還可以作為植物的生長促進劑。褐藻寡糖的制備方法主要由化學降解法，物理降解法和酶解法。相對前兩種降解方法，酶法降解條件溫和，不易破壞寡糖的結構，并且酶解方法所需要的設備簡單，污染小。
[0003]褐藻膠裂解酶可用于降解褐藻細胞壁，而這種酶在人體內是缺乏的，褐藻的細胞壁破損后，海藻的營養(yǎng)價值得到進一步的提高。另外，褐藻膠裂解酶還可用于降解菌膜及生產生物燃料。因此，篩選褐藻膠代謝新菌株，尋找不同類型的酶對開發(fā)高值化褐藻膠及褐藻寡糖產品具有重要意義。
[0004]發(fā)明人通過文獻檢索、查閱資料所知，迄今為止報道的產褐藻膠裂解酶的菌株主要包括海洋細菌，黃桿菌{Flavobacuterium multi volum)、固氮菌{AzobacterFi/?<97a/?￡/ii)、芽胞桿菌(Jiacillus circulans)等。專利公開了sp.HZJ216菌株產生的褐藻膠裂解酶分子 量為60.25 KDa, Vibrio sp.JG07-007產的褐藻膠裂解酶的分子量為34.6 KDa等，經檢索未見有Cbkiia屬的細菌產生與其相同的褐藻膠裂解酶。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的提供一株新型的高產褐藻酸裂解酶的菌株Cbkiia sp.WG-007,利用該菌株發(fā)酵可生產高活力的褐藻膠裂解酶。該菌株生長周期短，培養(yǎng)成分比較簡單，是一株極具開發(fā)研究價值的褐藻膠裂解酶的生產菌株。
[0006]本發(fā)明的發(fā)明人從國內生產褐藻酸鈉的化工廠的廢料樣品，分離篩選獲得一株產褐藻酸裂解酶的新型菌株，并對這株菌進行了發(fā)酵研究。根據其形態(tài)特征和生理生化特性，將其鑒定為Cobetia屬，命名為Cobetia sp.WG-007，該菌于2013年07月22日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學研究院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7964。
本發(fā)明提供的菌株WG-007的形態(tài)特征與生理生化特征為:
該菌株形態(tài)呈短桿狀，端圓，單個排列。革蘭氏染色紅色，在平板上培養(yǎng)24 h后菌落呈現圓形，直徑約為2-3 mm，表面光滑，濕潤，邊緣整齊，兩面顏色一致，稍有隆起，顏色為米黃色。無鞭毛，無孢子形成。[0007]生化特性:革蘭氏染色為陰性，該菌株可在鹽濃度為30%條件下生長，生長溫度為15-400C，但最適生長溫度為25 0C，最適的NaCl濃度為6.0%。接觸酶呈陽性，氧化酶呈陰性，M.R陽性，V.P反應為陰性，可利用葡萄糖，乳糖，甘露醇等；不能水解淀粉，及水解明膠；具有硝酸鹽還原性等生理生化特性，見表1。
[0008]表1 Cobetia鄧.WG-007菌株的生理生化特性
【權利要求】
1.一株產褐藻膠裂解酶菌株WG-007，分類命名為Cbkiia sp.，保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學研究院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7964，保藏日期2013年07月22日。
2.利用權利要求1所述的菌株WG-007發(fā)酵生產褐藻膠裂解酶的方法，其特征在于，包括如下步驟:搖瓶培養(yǎng)為250 mL搖瓶裝液量30-50 mL，培養(yǎng)溫度25-28 °C，轉速150-220 r/min，培養(yǎng)16-18 h至對數期，得到種子液；種子培養(yǎng)基組成如下:褐藻酸鈉5.0g/L,蛋白胨5.0 g/L,酵母粉L0g/L，NaCl 30 g/L，pH為7.0 ;發(fā)酵罐培養(yǎng)為將種子液按1.0%-4.0%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵；所用發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:褐藻酸鈉6.0g/L,蛋白胨 5.0 g/L, NaCl 20 g/L, K2HPO4 0.30 g/L, pH 為 8.0_8.5。
3.利用權利要求2所述的的發(fā)酵液進行褐藻膠裂解酶的純化制備方法，其特征在于，制備方法包括如下步驟:首先進行陰離子交換層析，將離子交換收集到的樣品進通過一步疏水層析，高鹽上樣，低鹽洗脫，用不同濃度的(NH4)2SO4梯度洗脫目標蛋白，透析除去(NH4)2SO4,透析液過葡聚糖凝膠G-100純化目的蛋白，其分子量為35.0 KDa0
【文檔編號】C12N9/88GK103695341SQ201310681404
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權日:2013年12月16日
【發(fā)明者】史勁松, 劉旭梅, 許正宏, 李恒, 龔勁松, 蔣敏 申請人:江南大學