小麥-濱麥3D（3Ns）異代換系的培育方法和鑒定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的培育方法，包括下述步驟：1)四倍體硬粒小麥與八倍體小濱麥雜交，對(duì)每個(gè)世代均進(jìn)行鑒定，篩選出染色體數(shù)目為2n＝42，且含有濱麥Ns基因組染色體的單株；2)篩選出的單株均套袋自交，在F5世代，選育出含有2條濱麥Ns基因組染色體的小麥-濱麥異代換系。進(jìn)一步的本發(fā)明還公開(kāi)了上述小麥種質(zhì)的鑒定方法，包括采用熒光原位雜交(FISH)方法，采用EST-STS分子標(biāo)記鑒定方法。本發(fā)明方法培育的小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系在株高、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀方面得到了明顯的改善。
【專(zhuān)利說(shuō)明】小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的培育方法和鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物新品種的培育方法，屬于植物育種與生物遺傳學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】 [0002]小麥遠(yuǎn)緣雜交是利用外源遺傳物質(zhì)豐富小麥遺傳基礎(chǔ)和人工創(chuàng)制合成新物種的重要途徑和手段之一。濱麥(Leymus mollis (Trin.)Hara),又名柔軟賴(lài)草,屬禾本科,大麥亞族，賴(lài)草屬野生雜草，具有抗旱，耐寒，耐鹽堿，耐瘠薄，抗多種真菌，細(xì)菌病害和莖桿粗壯，大穗多花等特性，是麥類(lèi)作物品種改良的優(yōu)異種質(zhì)資源。濱麥的基因組為NsNsXmXm,其中Ns基因組來(lái)自于華山新麥草(Psathyrostachys huashanica Keng),而Xm基因組的來(lái)源目前尚未確定。
[0003]上世紀(jì)60年代，Tsitsin等通過(guò)幼胚培養(yǎng)，獲得了四倍體、六倍體小麥與大賴(lài)草、濱麥和沙生賴(lài)草的雜種。Anamthawat_j0nsson等采用胚拯救和秋水仙堿加倍,獲得了普通小麥、波斯小麥與濱麥的雜種雙二倍體，并報(bào)道了 I個(gè)包含全部A和B基因組染色體、I對(duì)D基因組染色體和6對(duì)濱麥染色體的小麥-濱麥雙二倍體材料AD99，利用AD99與普通小麥雜交，篩選出了 6個(gè)抗白粉病的純合株系。Li等(2005,2006)對(duì)八倍體小濱麥小孢子的發(fā)生、配子體的形成及濱麥染色體的遺傳行為進(jìn)行了分析，并通過(guò)利用八倍體小黑麥與八倍體小濱麥雜交，獲得了一個(gè)包含6條黑麥染色體和6條濱麥染色體的小麥-黑麥-濱麥三屬雜種。
[0004]研究通過(guò)胚拯救和秋水仙堿染色體加倍，獲得了具有濱麥的大穗、多花、大粒、抗病等特性的普通小麥-濱麥不完全雙二倍體M842 ;利用M842與普通小麥和缺體小麥雜交，培育出了 3個(gè)異附加系和2個(gè)異代換系；應(yīng)用基因組原位雜交對(duì)6種類(lèi)型的八倍體小濱麥(Octoploid Tritileymus)的染色體組構(gòu)成進(jìn)行了分子細(xì)胞遺傳學(xué)分析，將八倍體小濱麥M842-4、M842-8、M842-12 和 M842-16 的染色體組構(gòu)成確定為 AABBDDNsNs，M842-10 的染色體組構(gòu)成確定為AABBDDNsNs+2Ta-2Lm(Ns)，M842-13的染色體組構(gòu)成確定為AABBDDJJ ;利用八倍體小濱麥與八倍體小偃麥、八倍體小簇麥進(jìn)行了雜交，獲得了小麥-濱麥-偃麥草、小麥-濱麥-簇毛麥三屬雜種。
[0005]盡管現(xiàn)有技術(shù)在小麥雜交培育新的小麥品種上取得了巨大的技術(shù)進(jìn)步，但是目前尚未有將硬粒小麥與濱麥雜交獲得3D(3Ns)異代換系的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]在長(zhǎng)期的研發(fā)和育種過(guò)程中， 申請(qǐng)人:對(duì)小麥與濱麥的雜交進(jìn)行了深入研究，并在硬粒小麥與濱麥的雜交后代中令人驚喜的獲得了染色體數(shù)目為2n = 42，含有2條濱麥染色體的株系，將此獲得的株系采用、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、熒光原位雜交和SSR、EST-STS分子標(biāo)記等技術(shù)進(jìn)行了深入研究，不僅確定了該株系的形態(tài)特征、遺傳行為、染色體構(gòu)成，及所含濱麥染色體的同源群歸屬等，而且發(fā)現(xiàn)該株系在株高、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀方面得到了明顯的改善，為小麥品種改良和染色體工程育種提供新的種質(zhì)資源。[0007]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:[0008]小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的培育方法，包括下述步驟:1)四倍體硬粒小麥與八倍體小濱麥雜交，在各世代均進(jìn)行鑒定，篩選出染色體數(shù)目為2n = 42，且含有濱麥Ns基因組染色體的單株；2)篩選出的單株均套袋自交，在F5世代，選育出含有2條濱麥Ns染色體的小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系。
[0009]通常的，上述鑒定是在Fl，F(xiàn)2，F(xiàn)3和F4世代均進(jìn)行鑒定，以更好的篩選出單株。
[0010]其中，上述篩選過(guò)程所采用的鑒定方法可采用任意可行的生物學(xué)方法，優(yōu)選的是采用熒光原位雜交(GISH和FISH)和分子標(biāo)記(SSR和EST-STS)鑒定，這兩種方法能夠高效、準(zhǔn)確的進(jìn)行鑒定。
[0011]在本發(fā)明中，在培育開(kāi)始時(shí)所用的父本和母本可采用合適的硬粒小麥品種和八倍體小濱麥品種，優(yōu)選的，所述四倍體硬粒小麥品種為D4286(2n = 4x = 28，AABB)(又稱(chēng)硬粒小麥 4286)，八倍體小濱麥品種為 M842-16 (2n = 8x = 56，AABBDDNsNs)。
[0012] 申請(qǐng)人:對(duì)所得到的F5代小麥-濱麥3D (3Ns)異代換系進(jìn)行了生物學(xué)分析鑒定，確定所得小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的染色體構(gòu)型為2n = 42 = 2111，染色體組成為由40條小麥染色體和2條濱麥Ns基因組染色體構(gòu)成，濱麥的2條Ns基因組染色體可以完全配對(duì)為I個(gè)二價(jià)體染色體，且為濱麥的3Ns染色體。
[0013] 申請(qǐng)人:進(jìn)行的形態(tài)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)顯示，本發(fā)明培育方法所得的小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系相對(duì)親本，株高顯著升高，小穗數(shù)和千粒重顯著增高，穗長(zhǎng)顯著變長(zhǎng)。
[0014]進(jìn)一步的，本發(fā)明公開(kāi)了用來(lái)鑒定小麥-濱麥3D (3Ns)異代換系的鑒定方法，包括但不限于下述方法:
[0015]1.采用細(xì)胞遺傳學(xué)分析方法:將F5后代小濱麥3D(3Ns)異代換系種子室內(nèi)發(fā)芽，剪取根尖冰水預(yù)處理24h，卡諾固定液固定，I %纖維素酶+1 %果膠酶酶解，醋酸洋紅染色壓片；花粉母細(xì)胞觀察:田間取適齡幼穗，用卡諾固定液固定，醋酸洋紅染色壓片，顯微鏡觀察。
[0016]在上述方法中，根尖的取樣時(shí)間、冰水溫度可根據(jù)實(shí)際情況確定，優(yōu)選的，待根長(zhǎng)至I~2cm時(shí)，剪取根尖于O~4°C冰水預(yù)處理24h。
[0017]2.采用基因組原位雜交(GISH)方法:采用CTAB法提取濱麥和華山新麥草全基因組DNA并進(jìn)行標(biāo)記，染色體制片及原位雜交，每張制片加40 μ I雜交液，然后95°C變性8min,雜交在原位雜交儀上依照程序進(jìn)行。
[0018]其中所用的雜交液可以采用原位雜交領(lǐng)域任意可用的組成，此類(lèi)雜交液的組成和配置方法在常見(jiàn)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)均有記載，優(yōu)選的，所述雜交液組成為:20XSSC4y 1，ssDNA(鮭魚(yú)精 DNA，5ug/uL) 1μ 1,10% (ff/V) SDS 即十二烷基磺酸鈉 1μ 1,50% (ff/V)DS 即硫酸葡聚糖8 μ 1，去離子甲酰胺20 μ 1，探針0嫩100叩，無(wú)菌去離子水加至4(^1。
[0019]其中所采用的原位雜交儀可采用任意廠家提供的此類(lèi)產(chǎn)品，其程序參數(shù)設(shè)置按照儀器的推薦設(shè)置即可，優(yōu)選的，所用原位雜交儀為HYBrite原位雜交儀，程序設(shè)置為750C 8min,37°C 16h。
[0020]3.采用重復(fù)序列原位雜交(FISH)方法:采用缺刻平移法對(duì)重復(fù)序列pAsl進(jìn)行標(biāo)記，染色體制片及原位雜交，每張制片加40 μ I雜交液，然后95°C變性8min，雜交在原位雜交儀上依照程序進(jìn)行。[0021]其中所用的雜交液可以采用原位雜交領(lǐng)域任意可用的組成，此類(lèi)雜交液的組成和配置方法在常見(jiàn)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)均有記載，優(yōu)選的，所述雜交液組成為:20XSSC4y 1，ssDNA(鮭魚(yú)精 DNA，5ug/uL) 1μ 1,10% (ff/V) SDS 即十二烷基磺酸鈉 1μ 1,50% (ff/V)DS 即硫酸葡聚糖8 μ I,去離子甲酰胺20 μ I, pAsl探針DNAlOOng,無(wú)菌去離子水加至40 μ I。
[0022]其中所采用的原位雜交儀可采用任意廠家提供的此類(lèi)產(chǎn)品，其程序參數(shù)設(shè)置按照儀器的推薦設(shè)置即可，優(yōu)選的，所用原位雜交儀為HYBrite原位雜交儀，程序設(shè)置為750C 8min,37°C 16h。
[0023]4.采用SSR和EST-STS標(biāo)記分析方法:采用小麥D基因組ID~7D染色體的14對(duì) SSR 引物(引物來(lái)自 Pestsova E,Ganal M and R5der M (2000).Genome.43:689-697.和Roder MS,Korzun V,Wendehake K，et al.(1998)..Genetics.149:2007-2023)，對(duì) F5 后代小濱麥3D(3Ns)異代換系及其親本進(jìn)行分析，確定D基因組染色體的組成；
[0024]采用小麥1-7同源群染色體的14對(duì)EST-STS引物(引物來(lái)自:http://wheat,pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml),確定Ns基因組染色體的同源群歸屬；采用PCR擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，點(diǎn)樣量8 μ 1,150V恒壓條件下電泳4~5h，硝酸銀染色。
[0025]其中PCR反應(yīng)所采用的反應(yīng)條件可采用本領(lǐng)域常用條件，優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為包含 I Xbuffer (IOOmM Tris-HCl pH8.3,1.5mM MgC12)，0.2M dNTPs，50ng引物，IU Taq DNA聚合酶，50~IOOng模板DNA，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，34個(gè)循環(huán)按照94°C變性lmin，50，55 或60°C退火lmin，72°C延伸2min進(jìn)行，最后充分延伸lOmin。
[0026]本發(fā)明公開(kāi)的小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系為小麥品種改良和染色體工程育種提供新的種質(zhì)資源，所公開(kāi)的鑒定方法可有效準(zhǔn)確的對(duì)株系進(jìn)行鑒定。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為所得小麥-濱麥3D (3Ns)異代換系的根尖體細(xì)胞染色體(a)及其和花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I染色體(b)；
[0028]圖2為小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的根尖體細(xì)胞的基因組原位雜交(GISH)鑒定(a)和花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I的基因組原位雜交(GISH)鑒定(b)；
[0029]圖3為小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系同一個(gè)根尖體細(xì)胞的重復(fù)序列原位雜交(FISH)鑒定(a)和基因組/重復(fù)序列原位雜交(GISH/FISH)鑒定(b)，以及小麥3D染色體和濱麥3Ns染色體的pAsl帶型比較(c)；
[0030]圖4為14對(duì)小麥第1-7同源群SSR引物對(duì)小濱麥3D (3Ns)異代換系的分析；
[0031]圖5為14對(duì)小麥1-7同源群EST-STS引物對(duì)小濱麥3D(3Ns)異代換系的分析；
[0032]圖6為小麥-濱麥3D (3Ns)異代換系及其親本的植株(a)和穗子(b)。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1:小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的培育
[0034]利用硬粒小麥(2n = 4x = 28，AABB)品種D4286與八倍體小濱麥M842-16 (2n =8x = 56，AABBDDNsNs)雜交，在Fl，F(xiàn)2，F(xiàn)3和F4世代均進(jìn)行細(xì)胞學(xué)染色體鏡檢和基因組原位雜交(GISH)鑒定，篩選染色體數(shù)目為2n = 42，且含有濱麥Ns基因組染色體的單株，對(duì)篩選出的單株均套袋自交，在F5世代，選育出I個(gè)含有2條濱麥3Ns染色體的小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系，命名為10DM57。
[0035]實(shí)施例2:實(shí)施例1的小麥-濱麥3D (3Ns)異代換系的鑒定
[0036]細(xì)胞遺傳學(xué)分析:D4286XM842-16的F5后代小濱麥3D(3Ns)異代換系10DM50，種子室內(nèi)發(fā)芽，待根長(zhǎng)至1~2em時(shí)，剪取根尖于O~4°C冰水預(yù)處理24h，卡諾固定液固定，1 %纖維素酶+1 %果膠酶酶解，醋酸洋紅染色壓片；花粉母細(xì)胞觀察:田間取適齡幼穗，用卡諾固定液固定，醋酸洋紅染色壓片，01ympusBX60顯微鏡觀察；利用硬粒小麥品種D4286(AABB,2n = 28)與 M842-16 (AABBDDNsNs，2n = 56)雜交，后代經(jīng) 4 代套袋自交，在 F5后代中，通過(guò)根尖體細(xì)胞染色體鏡檢，篩選到I株2n = 42的植株10DM50，收獲該單株，對(duì)其15粒種子室內(nèi)發(fā)芽，固定根尖后播種于大田；15粒種子的根尖體細(xì)胞染色體數(shù)目都為2n =42 (圖1a)。
[0037]田間選取10DM50的適齡幼穗，對(duì)58個(gè)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I染色體配對(duì)情況進(jìn)行鏡檢觀察，結(jié)果顯示，10DM50有52個(gè)花粉母細(xì)胞的染色體構(gòu)型為2n = 2111，占觀察細(xì)胞數(shù)的90%，只有5個(gè)花粉母細(xì)胞的染色體構(gòu)型為2n = 2111+21，占觀察細(xì)胞數(shù)的9%(圖1b)。
[0038]基因組原位雜交(GISH) =DNA提取及探針標(biāo)記:采用CTAB法提取濱麥和華山新麥草全基因組DNA并進(jìn)行標(biāo)記，染色體制片及原位雜交,每張制片加40 μ I雜交液(包含20XSSC4y 1，ssDNA (鮭魚(yú)精 DNA，5ug/uL) I μ 1,10% (W/V) SDS (十二烷基磺酸鈉)I μ 1，50% (W/V)DS(硫酸葡聚糖)8μ 1，去離子甲酰胺20μ 1，探針DNAlOOng，無(wú)菌去離子水加至40 μ I)。95°C變性8min，雜交在hybrite原位雜交儀上依照程序:75°C 8min，37°C 16h進(jìn)行；
[0039]對(duì)10DM57的根尖體細(xì)胞分別以濱麥和華山新麥草全基因組DNA為探針進(jìn)行基因組熒光原位雜交(GISH)鑒定，結(jié)果顯示，10DM57細(xì)胞都含有2條完整的黃綠色染色體信號(hào)，推斷10DM57含有2條Ns基因組染色體(圖2a)。
[0040]以華山新麥草總基因組DNA作為探針，對(duì)其花粉母細(xì)胞進(jìn)行基因組原位雜交(GISH)鑒定，結(jié)果顯示，10DM57花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I細(xì)胞都有I個(gè)完整的二價(jià)體顯示黃綠色信號(hào)，表明10DM57中的2條Ns基因組染色體可以完全配對(duì)為I對(duì)染色體(圖2b)。由此說(shuō)明，10DM57是I個(gè)遺傳穩(wěn)定的，包含40條小麥染色體和I對(duì)濱麥Ns基因組染色體的小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系。
[0041]重復(fù)序列原位雜交(FISH):探針標(biāo)記:采用缺刻平移法對(duì)重復(fù)序列pAsl進(jìn)行標(biāo)記，染色體制片及原位雜交，每張制片加40μ1雜交液(包含20XSSC4y 1，ssDNA(鮭魚(yú)精DNA，5ug/uL)ly 1，10% (ff/V) SDS即十二烷基磺酸鈉1μ 1,50% (ff/V)DS即硫酸葡聚糖8 μ 1,去離子甲酰胺20 μ I,pAsl探針DNAlOOng,無(wú)菌去離子水加至40 μ 1), 95°C變性8min,雜交在原位雜交儀HYBrite上依照程序:75°C 8min，37°C 16h進(jìn)行。
[0042]以重復(fù)序列pAsl為探針，對(duì)小麥-濱麥3D (3Ns)異代換系的根尖體細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)鑒定(圖3a)，結(jié)果顯示:10DM57中，小麥的1D，2D，4D，5D，6D和7D染色體根據(jù)其特有的PAsl帶型都可以準(zhǔn)確的標(biāo)注，而小麥的3D染色體卻無(wú)法準(zhǔn)確標(biāo)注，同時(shí)，看到一對(duì)與3D染色體具有相似帶型的染色體。以華山新麥草全基因組DNA為探針對(duì)同一張制片進(jìn)行基因組原位雜交(GISH)鑒定(圖3b)，結(jié)果顯示:具有與3D染色體相似帶型的染色體為來(lái)自濱麥的Ns染色體，推斷其為3Ns染色體。該結(jié)果表明:3Ns染色體顯示出與小麥3D染色體不同的帶型，即在染色體的長(zhǎng)臂和短臂端部各有一條pAsl帶，同時(shí)在長(zhǎng)臂的近端部也顯示一條PAsl帶。這種帶型特征可用于鑒定小麥遺傳背景下的濱麥3Ns染色體。
[0043]SSR分子標(biāo)記分析:采用Roder等和Pestsova等公布的小麥D基因組ID~7D染色體的14對(duì)SSR引物(如下表1所示)，對(duì)10DM57及其親本進(jìn)行分析，確定10DM57中D基因組染色體的組成；
[0044]SSR結(jié)果分析顯示(圖4)，D基因組的1D，2D，4D，5D，6D和7D染色體上的引物，在10DM57 (圖4泳道3)，八倍體小濱麥M842-16 (圖4泳道4)和小麥品種7182 (圖4泳道I)中都擴(kuò)增出了預(yù)期的目標(biāo)條帶，而3D染色體上的引物，雖然在八倍體小濱麥M842-16和小麥品種7182中擴(kuò)增出了預(yù)期的目標(biāo)條帶，但在10DM57中卻沒(méi)有擴(kuò)增出預(yù)期的目標(biāo)條帶，說(shuō)明10DM57可能含有小麥D基因組的1D，2D，4D，5D，6D和7D染色體，而缺失的了小麥的3D染色體。
[0045]表1:14 對(duì) SSR 引物
[0046]
【權(quán)利要求】
1.小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的培育方法，其特征在于包括下述步驟:1)四倍體硬粒小麥與八倍體小濱麥雜交，在各世代均進(jìn)行鑒定，篩選出染色體數(shù)目為2n = 42，且含有濱麥Ns基因組染色體的單株；2)篩選出的單株均套袋自交，在F5世代，選育出含有2條濱麥Ns染色體的小麥-濱麥3D (3Ns)異代換系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育方法，其特征在于所述四倍體硬粒小麥品種為D4286，八倍體小濱麥品種為M842-16。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育方法，其特征在于所得小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的染色體構(gòu)型為2n = 42 = 2111，染色體組成為由40條小麥染色體和2條濱麥Ns染色體構(gòu)成，濱麥的2條Ns染色體配對(duì)為I個(gè)二價(jià)體染色體。
4.小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于采用細(xì)胞遺傳學(xué)分析方法:將F5后代小濱麥3D (3Ns)異代換系種子室內(nèi)發(fā)芽，剪取根尖于冰水預(yù)處理24h，卡諾固定液固定，I %纖維素酶+1%果膠酶酶解，醋酸洋紅染色壓片；花粉母細(xì)胞觀察:田間取適齡幼穗，用卡諾固定液固定，醋酸洋紅染色壓片，顯微鏡觀察。
5.小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于采用基因組原位雜交(GISH)方法:采用CTAB法提取濱麥和華山新麥草全基因組DNA并進(jìn)行標(biāo)記，染色體制片及原位雜交，每張制片加40 μ I雜交液，然后95°C變性8min，雜交在原位雜交儀上依照程序進(jìn)行。
6.小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于采用重復(fù)序列(pAsl)熒光原位雜交(FISH)方法:采用缺刻平移法對(duì)重復(fù)序列pAsl進(jìn)行標(biāo)記，然后進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)，每張制片加40 μ I雜交液，然后95°C變性8min，雜交在原位雜交儀上依照程序進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求5`或6所述的小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于所述雜交液組成為:20XSSC4y 1，ssDNA(鮭魚(yú)精 DNA，5ug/uL) I μ 1，10 % (ff/V)SDSly I,50% (W/V)DS8y 1，去離子甲酰胺20 μ 1，探針DNA或pAsl探針DNAIOOng，無(wú)菌去離子水加至 40 μ I。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于所用原位雜交儀為HYBrite原位雜交儀，程序設(shè)置為75°C 8min，37°C 16h。
9.小麥-濱麥3D(3Ns)異代換系的鑒定方法，其特征在于采用SSR和EST-STS標(biāo)記分析方法:采用小麥D基因組ID~7D染色體的14對(duì)SSR引物，對(duì)F5后代小濱麥3D (3Ns)異代換系及其親本進(jìn)行分析，確定D基因組染色體的組成；采用小麥1-7同源群染色體的14對(duì)EST-STS引物，確定Ns基因組染色體的同源群歸屬；采用PCR擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，點(diǎn)樣量8 μ 1，150V恒壓條件下電泳4~5h，硝酸銀染色。
10.根據(jù)權(quán)利要求11所述的鑒定方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為包含 I Xbuffer (IOOmM Tris-HCl ρΗ8.3，1.5mM MgCl2)，0.2M dNTPs，50ng 引物，IU Taq DNA聚合酶，50~IOOng模板DNA，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，34個(gè)循環(huán)按照94°C變性lmin，`50，55或601:退火lmin，72°C延伸2min進(jìn)行，最后充分延伸lOmin。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103688846SQ201310646553
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】趙繼新, 龐玉輝, 陳新宏, 武軍, 程雪妮, 楊群慧 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)