發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法中，對(duì)菌種活化的斜面培養(yǎng)基組份、液體培養(yǎng)基組份、種子液接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基組份等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，維持鏈霉菌的生長(zhǎng)活性和發(fā)酵活性，提高他克莫司的生產(chǎn)量；在發(fā)酵過(guò)程中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加哌啶酸，并對(duì)其添加時(shí)間和添加量等添加方式進(jìn)行優(yōu)化，減少了產(chǎn)物的反饋抑制，同時(shí)增加了終產(chǎn)物他克莫司的產(chǎn)量，使他克莫司的終產(chǎn)量達(dá)到385μg/mL。
【專利說(shuō)明】發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]近十多年來(lái)，我國(guó)器官移植發(fā)展迅速，已躍居亞洲首位，世界第二。用于器官移植后減少排異反應(yīng)的免疫抑 制劑類藥物也呈現(xiàn)快速的增長(zhǎng)，普遍用于預(yù)防抑制排斥的免疫抑制劑是環(huán)孢菌素，但是其使用常常伴隨著副作用。開(kāi)發(fā)新型免疫抑制劑變得尤為需要，目前一種新型的免疫抑制劑他克莫司使用正日漸廣泛。
[0004]他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是由日本藤澤制藥公司于1984年從土壤放線菌中提取的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有較強(qiáng)的免疫抑制特性。其預(yù)防各種器官移植所出現(xiàn)的排斥反應(yīng)的效果優(yōu)于環(huán)孢菌素。他克莫司能減少肝腎移植受體的急、慢性排斥反應(yīng)。用本品的患者，細(xì)菌和病毒感染率也較環(huán)孢素治療者低，尤其是該藥品有較強(qiáng)的親肝性，對(duì)肝移植的功效比環(huán)孢素高100倍，因而大大降低了臨床使用劑量，可降低原治療費(fèi)用1/3~1/2。FK-506和環(huán)孢菌素合用具有明顯的協(xié)同作用，效果更好。他克莫司不僅可用于防止免疫反應(yīng)的發(fā)生，還可用于治療已發(fā)生的免疫反應(yīng)及自身免疫性疾病，對(duì)防止器官移植的免疫反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療具有重要意義。
[0005]目前有關(guān)他克莫司生產(chǎn)方法的報(bào)道不多，主要有美國(guó)專利US.4，894，366，US.4929611，US5, 116，756，US5, 264，355，US.5，496，727 和 US5, 624，842。這些專利報(bào)道了用不同的鏈霉菌株生產(chǎn)他克莫司，產(chǎn)量不是很高，US5, 116, 756專利中提到的streptomycessp.MA6858 和 US5, 624，842 中提到的 streptomyces tsukubaensis 的他克莫司生產(chǎn)菌株，生產(chǎn)他克莫司的產(chǎn)量都很低，其發(fā)酵液中他克莫司的濃度最高只有37.Smg/L，導(dǎo)致工業(yè)化生產(chǎn)以后產(chǎn)品的成本很高，給患者造成沉重的負(fù)擔(dān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用CN1876822公開(kāi)了的鏈霉菌(Streptomyces sp1908) CGMCC N0.1288進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，采用如下技術(shù)方案:
一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，包括以下內(nèi)容:
a.制備鏈霉菌(Streptomycesspl908)CGMCC N0.1288的種子液:將保藏的鏈霉菌(Streptomyces sp 1908) CGMCC N0.1288菌株接種在斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)50h，然后接種于液體培養(yǎng)基中，在30°C的搖床中培養(yǎng)50h，即得所述的鏈霉菌種子液；
b.接種:將步驟a中得到的種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1%；
c.發(fā)酵培養(yǎng):將步驟b中得到的接種后的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28~30 0C ；d.補(bǔ)加哌啶酸:當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)120h以后，于每升發(fā)酵液中以0.1~lml//h的流速往發(fā)酵罐中補(bǔ)料流加1.0%的哌啶酸溶液；
e.發(fā)酵結(jié)束并分離:當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)140~192h以后，結(jié)束發(fā)酵，將得到的發(fā)酵液進(jìn)行提取分離，即得所述的他克莫司。
[0007]優(yōu)選地，步驟a中所述的斜面培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組份:葡萄糖10%，麥芽粉20%，酵母粉5%，氯化鈉1.5%，瓊脂15%，余量為去離子水。
[0008]優(yōu)選地，步驟a中所述的液體培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組份:葡萄糖10%，玉米粉20%，酵母粉5%，可溶性淀粉20%，甘油15%，碳酸鈣2%，余量為去離子水。
[0009]優(yōu)選地，步驟a中所述的搖床的轉(zhuǎn)速為10(T300rpm。
[0010]優(yōu)選地，步驟b中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組份:酵母粉1.5%，可溶性淀粉40%，玉米漿30%，甘油20%，磷酸氫二鉀1.5%，碳酸鈣2%，余量為去離子水。
[0011]優(yōu)選地，步驟c中所述的發(fā)酵培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為15(T200rpm。
[0012]本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法中，對(duì)菌種活化的斜面培養(yǎng)基組份、液體培養(yǎng)基組份、種子液接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基組份等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，維持鏈霉菌的生長(zhǎng)活性和發(fā)酵活性，提高他克莫司的生產(chǎn)量；在發(fā)酵過(guò)程中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加哌啶酸，并對(duì)其添加時(shí)間和添加量等添加方式進(jìn)行優(yōu)化，減少了產(chǎn)物的反饋抑制，同時(shí)增加了終產(chǎn)物他克莫司的產(chǎn)量，使他克莫司的終產(chǎn)量達(dá)到385 μ g/mL。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以`任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014]實(shí)施例1
制備斜面培養(yǎng)基:稱取葡萄糖10g，麥芽粉20g，酵母粉5g，氯化鈉1.5g，瓊脂15g，用去離子水定容至1L,在0.1MPa下滅菌30min,即得。
[0015]制備液體培養(yǎng)基:稱取葡萄糖10g，玉米粉20g，酵母粉5g，可溶性淀粉20g，甘油15g,碳酸鈣2g,用去離子水定容至1L,在0.1MPa下滅菌30min,即得。
[0016]制備發(fā)酵培養(yǎng)基:稱取酵母粉1.5g，可溶性淀粉40g，玉米漿30g，甘油20g，磷酸氫二鉀1.5g,碳酸鈣2g,用去離子水定容至1L,在0.1MPa下滅菌30min,即得。
[0017]實(shí)施例2
利用實(shí)施例1中提供的各種培養(yǎng)基進(jìn)行下面的發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，包括以下內(nèi)
容:
a.制備鏈霉菌(Streptomycesspl908)CGMCC N0.1288的種子液:將保藏的鏈霉菌(Streptomyces sp 1908) CGMCC N0.1288菌株接種在斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)50h，然后接種于液體培養(yǎng)基中，在30°C的搖床中培養(yǎng)50h (搖床的轉(zhuǎn)速為10(T300rpm)，即得所述的鏈霉菌種子液；
b.接種:將步驟a中得到的種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1%；C.發(fā)酵培養(yǎng):將步驟b中得到的接種后的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28~30°C，發(fā)酵培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為15(T200rpm ；
d.補(bǔ)加哌啶酸:當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)120h以后，于每升發(fā)酵液中以0.1~lml//h的流速往發(fā)酵罐中補(bǔ)料流加1.0%的哌啶酸溶液；
e.發(fā)酵結(jié)束并分離:當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)140~192h以后，結(jié)束發(fā)酵，將得到的發(fā)酵液中他克莫司的濃度高達(dá)385 μ g/mL,然后將發(fā)酵液進(jìn)行提取分離，即得所述的他克莫司。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，包括以下內(nèi)容: 制備鏈霉菌(Sti^ptomyces spl908) CGMCC N0.1288的種子液:將保藏的鏈霉菌(Streptomyces sp1908) CGMCC N0.1288菌株接種在斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)50h，然后接種于液體培養(yǎng)基中，在30°C的搖床中培養(yǎng)50h，即得所述的鏈霉菌種子液； 接種:將步驟a中得到 的種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1% ； 發(fā)酵培養(yǎng):將步驟b中得到的接種后的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28~30 0C ； 補(bǔ)加哌啶酸:當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)120h以后，于每升發(fā)酵液中以0.1~lml//h的流速往發(fā)酵罐中補(bǔ)料流加1.0%的哌啶酸溶液； e.發(fā)酵結(jié)束并分離:當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)140~192h以后，結(jié)束發(fā)酵，將得到的發(fā)酵液進(jìn)行提取分離，即得所述的他克莫司。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，其特征在于步驟a中所述的斜面培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組份:葡萄糖10%，麥芽粉20%，酵母粉5%，氯化鈉1.5%，瓊脂15%,余量為去尚子水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，其特征在于步驟a中所述的液體培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組份:葡萄糖10%，玉米粉20%，酵母粉5%，可溶性淀粉20%，甘油15%，碳酸鈣2%，余量為去離子水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，其特征在于步驟a中所述的搖床的轉(zhuǎn)速為10(T300rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，其特征在于步驟b中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組份:酵母粉1.5%，可溶性淀粉40%，玉米漿30%，甘油20%，磷酸氫二鉀1.5%，碳酸鈣2%，余量為去離子水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的方法，其特征在于步驟c中所述的發(fā)酵培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為15(T200rpm。
【文檔編號(hào)】C12P17/18GK103695496SQ201310644714
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】朱輝, 莫洪 申請(qǐng)人:成都雅途生物技術(shù)有限公司