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一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片的制作方法

文檔序號(hào):457827閱讀:267來源:國(guó)知局
一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片的制作方法
【專利摘要】一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,由蓋片層和置于蓋片層下的載片組成;蓋片層上開設(shè)有加液區(qū)、和加液區(qū)連通的富集通道以及與富集通道連通的目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)和剩余液體排液區(qū);富集通道的一側(cè)為平直壁面,另一側(cè)帶有向富集通道內(nèi)凸出的尖角結(jié)構(gòu)或其它內(nèi)凸型結(jié)構(gòu),富集通道尾部為二分叉結(jié)構(gòu),用于與目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)和剩余液體排液區(qū)連通;加液區(qū)、目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)和剩余液體排液區(qū)為在蓋片層上開設(shè)的通孔,富集通道為在蓋片層上開設(shè)的盲道,底部和載片表面相通;本發(fā)明的生物芯片可以高效地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的富集與提取,具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,操作方便,低能耗,無污染,成本低,便于攜帶和推廣等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】—種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物芯片,具體涉及一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]微流體生物芯片誕生于20世紀(jì)末,近年來發(fā)展迅速,成為一種有效的檢測(cè)手段,并被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物等領(lǐng)域。它體現(xiàn)了將分析實(shí)驗(yàn)室的功能轉(zhuǎn)移到微型芯片上的思想,具有便攜性和高度集成性。鑒于長(zhǎng)期以來微流體生物芯片相關(guān)技術(shù)富有成就性地發(fā)展,美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)將微流體生物芯片評(píng)選為1998年的十大科技突破之一,認(rèn)為微流體生物芯片技術(shù)將是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠(yuǎn)意義的科學(xué)技術(shù)革命。微流體生物芯片是利用微加工技術(shù),在硅、玻璃、塑料等基片上刻蝕出預(yù)先設(shè)計(jì)的微通道和其它功能單元,然后用蓋片將其封閉,通過不同的通道網(wǎng)絡(luò)、反應(yīng)器、檢測(cè)單元等組成部件的設(shè)計(jì)和布局,以實(shí)現(xiàn)集微量樣品的制備、進(jìn)樣、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等功能于一體的快速、高效、低能耗的微型實(shí)驗(yàn)裝置。微流體生物芯片在高效快速的分離、靈活性的設(shè)計(jì)和多功能單元集成等方面的潛力引人注目,成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)之一。
[0003]最近幾年,大批學(xué)者嘗試?yán)梦⒘黧w生物芯片對(duì)微納米生物分子和細(xì)胞進(jìn)行富集與提取。生物分子(如蛋白質(zhì)、核酸、抗原和抗體)或細(xì)胞的富集與提取在生物醫(yī)學(xué)、食品與環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域有重要作用,如疾病診斷、食品安全檢測(cè)和水質(zhì)監(jiān)測(cè)等。在生物醫(yī)學(xué)的研究中,首先需要將目標(biāo)細(xì)胞從全血中富集并提取出來,以便排除其他細(xì)胞或微粒的干擾。例如對(duì)癌癥的診斷和治療中,需要將惡性腫瘤細(xì)胞(俗稱癌細(xì)胞)從血液中進(jìn)行有效的富集與提取。癌細(xì)胞在發(fā)病晚期會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)移,由初始病灶區(qū)脫離并進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng),而后依附于另一個(gè)器官或組織,形成新的癌癥發(fā)病點(diǎn),但是在癌細(xì)胞擴(kuò)散期,血液中的癌細(xì)胞含量只占到血液細(xì)胞總量的億分之一,相當(dāng)于一毫升血液中最多只有一個(gè)癌細(xì)胞,因此將轉(zhuǎn)移期血液中極低濃度的癌細(xì)胞進(jìn)行有效的富集與提取,對(duì)癌癥的監(jiān)測(cè)治療和病情的預(yù)估有著重要的意義。另一方面,癌細(xì)胞的富集與提取,可以用于對(duì)用藥前后血液中癌細(xì)胞的濃度水平進(jìn)行檢測(cè)和對(duì)比,對(duì)抗癌藥效和治療效果的評(píng)估意義重大。
[0004]傳統(tǒng)的用于細(xì)胞富集與提取的設(shè)備,按照原理不同,主要分為離心力富集、介電力富集、速度沉降富集、固相萃取和聲波表面富集。目前被廣泛采用的是離心力富集,如干細(xì)胞處理系統(tǒng),它是基于不同種類細(xì)胞的密度差異,在離心力的作用下將目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行有效的富集和提取。其細(xì)胞提取物包括造血干細(xì)胞、紅細(xì)胞、血漿、血小板等,為下一步的臨床診斷或科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。介電力細(xì)胞富集,是利用不同細(xì)胞的介電常數(shù)差異,在外加電場(chǎng)作用下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的富集與提取,其結(jié)構(gòu)較離心式細(xì)胞富集提取設(shè)備簡(jiǎn)單,但無法排除極化現(xiàn)象對(duì)細(xì)胞的影響。此外,電場(chǎng)強(qiáng)弱、流體粘度、細(xì)胞尺寸和電特性都會(huì)對(duì)介電力細(xì)胞富集與提取效果產(chǎn)生影響,因而難于廣泛推廣應(yīng)用。速度沉降富集基于細(xì)胞尺寸的差異,使不同細(xì)胞在具有十分平緩的密度梯度的介質(zhì)中以不同的速度沉降而達(dá)到富集與提取的目的。需要指出的是,此種方法富集不同目標(biāo)細(xì)胞時(shí),需要不同密度的沉降介質(zhì)從而保證目標(biāo)細(xì)胞在沉降介質(zhì)中發(fā)生有效沉降。此外,速度沉降細(xì)胞提取十分緩慢,不便應(yīng)用于細(xì)胞快速分析場(chǎng)合。其余諸如固相萃取、表面聲波富集等尚處于理論研究階段,鮮見有實(shí)際應(yīng)用與推廣。由于傳統(tǒng)細(xì)胞提取設(shè)備一般都需要如電機(jī)、流量控制閥、特制的流動(dòng)閉合回路等精密元件,制造難度較大,機(jī)構(gòu)異常復(fù)雜。而且價(jià)格昂貴,不利于醫(yī)療技術(shù)的快速進(jìn)步,有悖于家庭醫(yī)療和個(gè)人保健等先進(jìn)的健康理念。
[0005]傳統(tǒng)的細(xì)胞富集與提取設(shè)備主要存在以下問題:
[0006]I)體積龐大,不便攜帶;
[0007]2 )需要外加動(dòng)力,耗能高;
[0008]3)流量需要精確控制,容易受各種因素影響;
[0009]4)組件多,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,如需要電機(jī)、流量控制裝置等精密元器件,生產(chǎn)制造較為困難; [0010]5)單臺(tái)設(shè)備價(jià)格昂貴,不利于在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)中的推廣和使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011 ] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題,本發(fā)明的目的在于提供一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高效富集與提取,也可用于血漿的萃取,具有操作方便、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低、精度高、便于攜帶等優(yōu)點(diǎn),具有很好的應(yīng)用前景。
[0012]為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0013]一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,所述微流體生物芯片由蓋片層5和置于蓋片層5下的載片6組成;所述蓋片層5上開設(shè)有加液區(qū)1、和加液區(qū)I連通的富集通道2以及與富集通道2連通的目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)4和剩余液體排液區(qū)3 ;所述富集通道2的一側(cè)為平直壁面,另一側(cè)帶有向富集通道2內(nèi)凸出的尖角結(jié)構(gòu)或其它內(nèi)凸型結(jié)構(gòu),所述富集通道2尾部為二分叉結(jié)構(gòu),用于與目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)4和剩余液體排液區(qū)3連通;所述加液區(qū)1、目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)4和剩余液體排液區(qū)3為在蓋片層5上開設(shè)的通孔,所述富集通道2為在蓋片層5上開設(shè)的盲道,底部和載片6表面相通。
[0014]所述蓋片層5和載片6通過等離子不可逆處理結(jié)合在一起。
[0015]所述富集通道2位于蓋片層5和載片6相結(jié)合處的中央位置。
[0016]所述加液區(qū)1、目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)4和剩余液體排液區(qū)3均為圓柱形孔。
[0017]所述富集通道2內(nèi)凸出的尖角結(jié)構(gòu)為80個(gè)。
[0018]還包括用于使細(xì)胞產(chǎn)生流動(dòng)動(dòng)力的手動(dòng)擠壓塞7,所述手動(dòng)擠壓塞7包括和加液區(qū)I形狀相適配的柱體7-1,設(shè)置在柱體7-1 —端的擠壓頭7-2,在所述柱體7-1上和擠壓頭7-2接觸處套有密封圈7-3。
[0019]所述柱體7-1采用PDMS或其它軟質(zhì)材料。
[0020]所述柱體7-1底部為斜面。
[0021]所述蓋片層5的材料為聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS。
[0022]所述載片6的材料為玻璃或硅。
[0023]本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比較,具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0024]I)、體積小,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,便于攜帶,操作方便。采用簡(jiǎn)單的手動(dòng)擠壓或動(dòng)力驅(qū)動(dòng)等方式進(jìn)行樣本加注,方便地進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的采集,適合在中小型醫(yī)療機(jī)構(gòu)與科研院所使用,具有極大的應(yīng)用價(jià)值與市場(chǎng)前景。配置的手動(dòng)擠壓塞,可以高效方便地將生物樣本擠壓進(jìn)入微通道中。
[0025]2)、精度高,適用性廣。本發(fā)明中一系列的尖角結(jié)構(gòu)引發(fā)的慣性離心作用,可以將各類目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行精確地富集與提取。與其他的微流體細(xì)胞富集和提取技術(shù)相比,本發(fā)明的生物芯片中的細(xì)胞富集對(duì)流量不敏感,極大的增加了該通道的適用性。
[0026]3)、不對(duì)目標(biāo)提取物產(chǎn)生污染,本發(fā)明中用于細(xì)胞富集的微通道與外界環(huán)境不直接接觸,避免了富集過程中生物樣本的污染。
[0027]4)、效率高,耗時(shí)少。本發(fā)明便于臨床應(yīng)用,方便快速做出診斷。
[0028]5)、成本低,制作容易。與其他傳統(tǒng)及微流體細(xì)胞富集與提取技術(shù)相比,無需復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和昂貴的輔助設(shè)備,因而本發(fā)明適合于大規(guī)模生產(chǎn)和市場(chǎng)推廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片俯視圖。
[0030]圖2為圖1沿A-A向的剖視圖。
[0031 ] 圖3為圖1沿B-B向的剖視圖。
[0032]圖4為用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片的三維示意圖。
[0033]圖5為手動(dòng)擠壓塞的二維不思圖。
[0034]圖6為本發(fā)明對(duì)顆粒的富集與提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖,其中圖6a為不同流量下通道出口顆粒運(yùn)動(dòng)軌跡,圖6b為不同流量下顆粒位置的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明:
[0036]如圖1至圖4所示,本發(fā)明一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,該生物芯片由標(biāo)準(zhǔn)軟光刻技術(shù)加工,由蓋片層5和置于蓋片層5下的載片6組成;蓋片層5上開設(shè)有加液區(qū)1、和加液區(qū)I連通的富集通道2以及與富集通道2連通的目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)4和剩余液體排液區(qū)3 ;富集通道2的一側(cè)為平直壁面,另一側(cè)帶有向富集通道2內(nèi)凸出的尖角結(jié)構(gòu)或其它內(nèi)凸型結(jié)構(gòu),富集通道2尾部為二分叉結(jié)構(gòu),用于與目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)4和剩余液體排液區(qū)3連通;加液區(qū)1、目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)4和剩余液體排液區(qū)3為在蓋片層5上開設(shè)的通孔,富集通道2為在蓋片層5上開設(shè)的盲道,底部和載片6表面相通。本實(shí)施例加液區(qū)I腔體直徑為10_,高度與蓋片層5高度一致。加液區(qū)1、富集通道2、目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)4和剩余液體排液區(qū)3形成的微通道位于蓋片層5與載片6相結(jié)合的中央位置,寬度為80 u m,深度為50 iim,設(shè)計(jì)總長(zhǎng)約為16.6mm。包括80個(gè)位于通道一側(cè)的尖角結(jié)構(gòu),尖角為45度,尖角結(jié)構(gòu)寬度和長(zhǎng)度約在40-45 u m,相鄰尖角距離約為120 u m。
[0037]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,本發(fā)明中微流體生物芯片使用標(biāo)準(zhǔn)軟光刻技術(shù)加工,所述蓋片層5和載片6通過等離子不可逆處理結(jié)合在一起。也可以使用其他材料或方法加工本發(fā)明的微通道。
[0038]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,所述加液區(qū)1、目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)4和剩余液體排液區(qū)3均為圓柱形孔。則相應(yīng)的,所述手動(dòng)擠壓塞7的柱體7-1也為圓柱體。
[0039]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,所述富集通道2內(nèi)凸出的尖角結(jié)構(gòu)為80個(gè)。[0040]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,如圖5所示,還包括用于使細(xì)胞產(chǎn)生流動(dòng)動(dòng)力的手動(dòng)擠壓塞7,所述手動(dòng)擠壓塞7包括和加液區(qū)I形狀相適配的柱體7-1,設(shè)置在柱體7-1 —端的擠壓頭7-2,在所述柱體7-1上和擠壓頭7-2接觸處套有密封圈7-3。手動(dòng)擠壓塞7于加液腔上方施加,且和加液區(qū)圓柱面內(nèi)部緊密配合,防止配合面存在縫隙而導(dǎo)致的密封問題。手動(dòng)擠壓塞7設(shè)計(jì)高度需保證待測(cè)液體被完全擠壓至微通道中,從而使目標(biāo)細(xì)胞被完全地富集與提取,本實(shí)施例柱體7-1直徑為10mm,塞體上端附有一內(nèi)徑為IOmm的環(huán)形密封圈7-3,該密封圈由彈性極高的材料制備,可以絕對(duì)避免生物樣本在受擠壓過程中發(fā)生外溢。也可通過人力或其他設(shè)備(如注射泵)驅(qū)動(dòng)的注射器注入生物樣本。
[0041]作為本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方式,所述柱體7-1采用PDMS或其它軟質(zhì)材料。
[0042]作為本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方式,所述柱體7-1底部為斜面,使加液時(shí)生物芯片中形成較為平穩(wěn)的流動(dòng),同時(shí)防止樣本液外溢。
[0043]所述柱體7-1采用PDMS或其它軟質(zhì)材料。
[0044]所述柱體7-1底部為斜面。
[0045]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,所述蓋片層5的材料為聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS。
[0046]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,所述載片6的材料為玻璃或娃。
[0047]下面以實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施過程:
[0048]癌細(xì)胞的富集 與提取具體操作如下,首先采集病人血液,而后將待處理血液加注到加液區(qū)I內(nèi),手動(dòng)擠壓塞7置于加液區(qū)I上,且保證密封圈7-3作用,防止血液外溢。按壓擠壓頭7-2從而施壓于加液區(qū)I中的血液,使血液流入富集通道2,當(dāng)血液中的癌細(xì)胞流經(jīng)富集通道2的尖角結(jié)構(gòu)時(shí),會(huì)受到尖角結(jié)構(gòu)引發(fā)的慣性離心力,該力與流量正相關(guān),使細(xì)胞趨向于平直壁面一側(cè)。每經(jīng)過一個(gè)尖角結(jié)構(gòu),癌細(xì)胞會(huì)在遠(yuǎn)離尖角的方向上產(chǎn)生一個(gè)位移,經(jīng)過80個(gè)相同的尖角結(jié)構(gòu)后,由于累積效應(yīng),所有癌細(xì)胞將被擠壓在平直壁面一側(cè),并進(jìn)入細(xì)胞收集區(qū)4。通過移液槍等手段將高濃度的癌細(xì)胞從細(xì)胞收集區(qū)4中提取出來,用于后續(xù)的檢測(cè)和診斷。如癌細(xì)胞一次富集濃度不滿足后續(xù)檢測(cè)的需要,可以使之多次通過本發(fā)明的生物芯片,以不斷地實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的富集,從而提高癌細(xì)胞的富集濃度。另外,也可以使用手動(dòng)或其他驅(qū)動(dòng)設(shè)備(如注射泵)驅(qū)動(dòng)的注射器來將病人的血液注入微通道中,以實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的富集與提取。
[0049]為驗(yàn)證本發(fā)明的富集過程對(duì)流量不敏感,從而證明手動(dòng)擠壓塞使用的可行性,使用本發(fā)明對(duì)直徑為9.94微米的熒光聚苯乙烯顆粒(尺寸與血細(xì)胞相當(dāng))進(jìn)行了富集實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。將顆粒溶于去離子水中,并采用可以精確控制流量的注射泵來注入顆粒液,利用熒光顯微鏡和CCD攝相機(jī)跟蹤拍攝顆粒群軌跡。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明在流量為300微升每分鐘到700微升每分鐘的范圍內(nèi),可以將顆粒完全地富集在平直壁面一側(cè)。圖6中:(a)在不同流量下的顆粒富集現(xiàn)象圖;(b)不同流量下,通道出口處的顆粒的熒光強(qiáng)度分布曲線。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了本發(fā)明在目標(biāo)物富集過程中對(duì)流量不敏感,具有廣泛地適用性。因此手動(dòng)擠壓塞的應(yīng)用完全能夠滿足對(duì)目標(biāo)物富集過程中對(duì)流量的要求。
【權(quán)利要求】
1.一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,其特征在于:由蓋片層(5)和置于蓋片層(5)下的載片(6)組成;所述蓋片層(5)上開設(shè)有加液區(qū)(I)、和加液區(qū)(I)連通的富集通道(2)以及與富集通道(2)連通的目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)(4)和剩余液體排液區(qū)(3);所述富集通道(2)的一側(cè)為平直壁面,另一側(cè)帶有向富集通道(2)內(nèi)凸出的尖角結(jié)構(gòu)或其它內(nèi)凸型結(jié)構(gòu),所述富集通道(2)尾部為二分叉結(jié)構(gòu),用于與目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)(4)和剩余液體排液區(qū)(3)連通;所述加液區(qū)(I)、目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)(4)和剩余液體排液區(qū)(3)為在蓋片層(5)上開設(shè)的通孔,所述富集通道(2)為在蓋片層(5)上開設(shè)的盲道,底部和載片(6)表面相通。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,其特征在于:所述蓋片層(5)和載片(6)通過等離子不可逆處理結(jié)合在一起。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞高效分離的生物芯片,其特征在于:所述富集通道(2)位于蓋片層(5)和載片(6)相結(jié)合處的中央位置。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,其特征在于:所述加液區(qū)(I)、目標(biāo)細(xì)胞收集區(qū)(4)和剩余液體排液區(qū)(3)均為圓柱形孔。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,其特征在于:所述富集通道(2)內(nèi)凸出的尖角結(jié)構(gòu)為80個(gè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,其特征在于:還包括用于使細(xì)胞產(chǎn)生流動(dòng)動(dòng)力的手動(dòng)擠壓塞(7),所述手動(dòng)擠壓塞(7)包括和加液區(qū)(I)形狀相適配的柱體(7-1),設(shè)置在柱體(7-1) —端的擠壓頭(7-2 ),在所述柱體(7-1)上和擠壓頭(7-2)接觸處套有密封圈(7-3)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,其特征在于:所述柱體(7-1)采用PDMS或其它軟質(zhì)材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,其特征在于:所述柱體(7-1)底部為斜面。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,其特征在于:所述蓋片層(5)的材料為聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞富集與提取的微流體生物芯片,其特征在于:所述載片(6)的材料為玻璃或硅。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK103642671SQ201310602808
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】趙亮, 范亮亮, 羅帥帥, 者江 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)
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