原油環(huán)境樣品中石油微生物的dna提取方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及原油中提取DNA【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法；按下述方法進(jìn)行：第一步，在離心管中加入10微升至50微升原油，然后在盛有原油的離心管中加入100微升清洗緩沖液混合均勻得到混合液。本發(fā)明提取的DNA濃度較細(xì)菌DNA提取試劑盒提取的DNA濃度提高了50%，本發(fā)明提取的DNA的亮度明顯高于細(xì)菌DNA提取試劑盒獲得的DNA的亮度、獲得的DNA的條帶清晰、提取的DNA沒(méi)有拖尾，說(shuō)明本發(fā)明較細(xì)菌DNA提取試劑盒更易從原油中提取DNA，提取效率更高，更能準(zhǔn)確全面真實(shí)的反映原油中微生物的種類(lèi)和數(shù)量。
【專(zhuān)利說(shuō)明】原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及原油中提取DNA【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)隨著人們對(duì)石油微生物的重視，尤其是微生物采油以及微生物氣化研究的深入、以及對(duì)石油廢水生物處理認(rèn)識(shí)的提高，人們開(kāi)始研究其中的微生物的組成分布以及規(guī)律，但研究微生物組成及其分布規(guī)律的一個(gè)重要前提是微生物樣本的提取。然而，由于目前對(duì)于純?cè)椭形⑸镆约皻堄椭械奈⑸锏奶崛⌒实拖拢姨崛⌒Ч缓?，不能完全展現(xiàn)油中微生物的本來(lái)的組成和功能，使得從事該項(xiàng)環(huán)境微生物研究者十分頭痛。用于環(huán)境樣本中微生物DNA的提取難度較大，尤其是以高鹽和污水中成分復(fù)雜的環(huán)境樣本DNA的提取更加困難。目前，含油污水和污泥中DNA的制備方法多數(shù)為人工配置藥品，采用溶菌酶，反復(fù)凍融結(jié)合CTAB法(溴化十六烷基三甲銨為主的DNA提取方法)或SDS法(十二烷基硫酸鈉為主要溶液的DNA提取方法)提取樣本中微生物的DNA，或用試劑盒制備，該法費(fèi)用較高而且DNA提取效果不好，多為禰散的條帶，或者得率低，無(wú)法進(jìn)行PCR反應(yīng)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；該法對(duì)于含有特殊的化學(xué)物質(zhì)如油田污水會(huì)更加不容易提取，需要的時(shí)間較長(zhǎng)，效果不好。目前現(xiàn)有的國(guó)內(nèi)專(zhuān)利，并沒(méi)有申請(qǐng)有關(guān)“原油”中微生物群落的微生物DNA的提取方法，同時(shí)對(duì)國(guó)內(nèi)的專(zhuān)業(yè)期刊文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，國(guó)內(nèi)參考文獻(xiàn):“王中華，梁靜兒，楊建強(qiáng)，周君，李成華，李太武.原油微生物群落構(gòu)成及降解菌降解特性的研究”中的原油微生物DNA的提取方法“為常規(guī)的試劑盒提取方法”，并非針對(duì)原油。目前沒(méi)有針對(duì)原油提取方法的具體文獻(xiàn)。這方面的針對(duì)性的“原油”中的微生物DNA的提取還未進(jìn)行報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了一種原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決石油中微生物DNA提取難度較大、DNA得率低、不能全面真實(shí)的反映環(huán)境樣本中微生物的種類(lèi)和數(shù)量的問(wèn)題。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法，按下述方法進(jìn)行:第一步，在離心管中加入10微升至50微升原油，然后在盛有原油的離心管中加入100微升清洗緩沖液混合均勻得到混合液；第二步，將盛有混合液的離心管放置在細(xì)胞破碎儀中破碎40秒至60秒，然后在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘至16000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)中離心10分鐘至15分鐘，去除上清液得到固相；第三步，在固相中加入200微升至300微升萃取清洗液，然后加入30微升至50微升的溶菌酶并混合均勻，在溫度為37°C下水浴5小時(shí)至10小時(shí)；第四步，對(duì)水浴后的溶液用細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，得到原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA。
[0005]下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案之一的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn):
上述清洗緩沖液按下述方法得到，按IOg Na2HPO4配Ig KH2HPO4,50g NaCl和1.5g KCl計(jì)，在Na2HPO4中加入KH2HP04、NaCl和KCl配成溶液，在溶液中加入百分之一的溶液體積的十二烷基硫酸鈉混合均勻得到貯存液，調(diào)節(jié)貯存液的PH為7.5，然后加入貯存液10倍體積的蒸餾水混合均勻，得到清洗緩沖液。[0006]上述萃取清洗液按下述方法得到，將氯仿和異戊醇按體積比為24:1混合在一起，得到萃取清洗液。
[0007]上述離心管為1.5毫升的離心管。
[0008]本發(fā)明提取的DNA濃度較細(xì)菌DNA提取試劑盒提取的DNA濃度提高了 50%，本發(fā)明提取的DNA的亮度明顯高于細(xì)菌DNA提取試劑盒獲得的DNA的亮度、獲得的DNA的條帶清晰、提取的DNA沒(méi)有拖尾，說(shuō)明本發(fā)明較細(xì)菌DNA提取試劑盒更易從原油中提取DNA，提取效率更高，更能準(zhǔn)確全面真實(shí)的反映原油中微生物的種類(lèi)和數(shù)量。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]附圖1為本發(fā)明原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法和細(xì)菌DNA提取試劑盒分別對(duì)原油提取后DNA的對(duì)照電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0010]本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實(shí)際情況來(lái)確定具體的實(shí)施方式。
[0011]實(shí)施例1，該原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法，按下述方法進(jìn)行:第一步，在離心管中加入10微升至50微升原油，然后在盛有原油的離心管中加入100微升清洗緩沖液混合均勻得到混合液；第二步，將盛有混合液的離心管放置在細(xì)胞破碎儀中破碎40秒至60秒，然后在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘至16000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)中離心10分鐘至15分鐘，去除上清液得到固相；第三步，在固相中加入200微升至300微升萃取清洗液，然后加入30微升至50微升的溶菌酶并混合均勻，在溫度為37°C下水浴5小時(shí)至10小時(shí)；第四步，對(duì)水浴后的溶液用細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，得到原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA。細(xì)菌DNA提取試劑盒為現(xiàn)有公知公用的設(shè)備；細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取和分析為現(xiàn)有公知公用的方法。細(xì)菌DNA提取試劑盒按照細(xì)菌基因組提取試劑盒(DP302)的方法操作(天根生化科技(北京)有限公司)進(jìn)行提取和檢測(cè)。
[0012]實(shí)施例2，該原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法，按下述方法進(jìn)行:第一步，在離心管中加入10微升或50微升原油，然后在盛有原油的離心管中加入100微升清洗緩沖液混合均勻得到混合液；第二步，將盛有混合液的離心管放置在細(xì)胞破碎儀中破碎40秒或60秒，然后在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘或16000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)中離心10分鐘或15分鐘，去除上清液得到固相；第三步，在固相中加入200微升或300微升萃取清洗液，然后加入30微升或50微升的溶菌酶并混合均勻，在溫度為37°C下水浴5小時(shí)或10小時(shí)；第四步，對(duì)水浴后的溶液用細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，得到原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA。
[0013]實(shí)施例3，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，實(shí)施例3中清洗緩沖液按下述方法得到，按IOgNa2HPO4 配 Ig KH2HPO4,50g NaCl 和 1.5g KCl 計(jì)，在 Na2HPO4 中加入 KH2HPO4' NaCl 和 KCl 配成溶液，在溶液中加入百分之一的溶液體積的十二烷基硫酸鈉混合均勻得到貯存液，調(diào)節(jié)貯存液的PH為7.5，然后加入貯存液10倍體積的蒸餾水混合均勻，得到清洗緩沖液。[0014]實(shí)施例4，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，實(shí)施例4中萃取清洗液按下述方法得到，將氯仿和異戊醇按體積比為24:1混合在一起，得到萃取清洗液。
[0015]實(shí)施例5，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，實(shí)施例5中離心管為1.5毫升的離心管。
[0016]本發(fā)明實(shí)施例原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法和采用細(xì)菌DNA提取試劑盒的對(duì)比試驗(yàn)如下:
取適量新疆克拉瑪依油田原油分成體積相同的兩份原油樣標(biāo)為樣品A和樣品B，樣品A直接采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取DNA，樣品B用本發(fā)明實(shí)施例原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法提取DNA ;樣品A和樣品B提取后用1%的凝膠電泳檢測(cè)和DNA濃度測(cè)定，平均數(shù)據(jù)如表1所示。
[0017]表1
【權(quán)利要求】
1.一種原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法，其特征在于按下述方法進(jìn)行:第一步，在離心管中加入10微升至50微升原油，然后在盛有原油的離心管中加入100微升清洗緩沖液混合均勻得到混合液；第二步，將盛有混合液的離心管放置在細(xì)胞破碎儀中破碎40秒至60秒，然后在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘至16000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)中離心10分鐘至15分鐘，去除上清液得到固相；第三步，在固相中加入200微升至300微升萃取清洗液，然后加入30微升至50微升的溶菌酶并混合均勻，在溫度為37°C下水浴5小時(shí)至10小時(shí)；第四步，對(duì)水浴后的溶液用細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，得到原油環(huán)境樣品中石油微生物的 DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法，其特征在于清洗緩沖液按下述方法得到，按IOg他2即04配18 KH2HPO4,50g NaCl和1.5g KCl計(jì)，在Na2HPO4中加入KH2HP04、NaCl和KCl配成溶液，在溶液中加入百分之一的溶液體積的十二烷基硫酸鈉混合均勻得到貯存液，調(diào)節(jié)貯存液的PH為7.5，然后加入貯存液10倍體積的蒸餾水混合均勻，得到清洗緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法，其特征在于萃取清洗液按下述方法得到，將氯仿和異戊醇按體積比為24:1混合在一起，得到萃取清洗液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法，其特征在于離心管為1.5毫升的離心管。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的原油環(huán)境樣品中石油微生物的DNA提取方法，其特征在于離心管為1.5毫升的離心管。`
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103667255SQ201310580492
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】聶春梅, 魏利, 陳愛(ài)華, 方新湘, 趙燕, 帕提古麗 申請(qǐng)人:克拉瑪依市金山石油化工有限公司