一種用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法，是將微載體處理后，以胰蛋白酶將微載體和細(xì)胞進(jìn)行消化，再將細(xì)胞逐步進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的一種用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法，其采用反應(yīng)器和國產(chǎn)的膠原微載體擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞的工藝，培養(yǎng)規(guī)模從方瓶→（0.25-2L懸浮培養(yǎng)瓶）→（5-7.5L反應(yīng)器）→（50-120L反應(yīng)器）→250L反應(yīng)器→線性放大,從根本上解決了微載體培養(yǎng)細(xì)胞規(guī)模線性放大的技術(shù)工藝，該工藝操作簡單，將對現(xiàn)有疫苗工藝進(jìn)行技術(shù)升級的同時(shí)，降低了疫苗的生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量，在實(shí)際生產(chǎn)中具有應(yīng)用前景。
【專利說明】一種用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，我國大多數(shù)疫苗仍采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的工藝生產(chǎn)，如獸用的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗(藍(lán)耳病疫苗)、豬圓環(huán)病毒疫苗、豬細(xì)小病毒疫疫苗、豬瘟病毒疫苗和羊痘疫苗等，人用的有乙腦疫苗、甲肝疫苗和水痘疫苗等。傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的疫苗存在批間差大、批量小,建設(shè)廠方面積大,生產(chǎn)過程人力物力投入大,總體來說生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。近幾年有些品種的疫苗采用了反應(yīng)器培養(yǎng)的工藝，如豬瘟疫苗采用了反應(yīng)器紙片載體培養(yǎng)細(xì)胞的工藝，狂犬病疫苗采用了反應(yīng)器微載體培養(yǎng)工藝，但最大的培養(yǎng)體積只有35L。這些工藝由于解決不了細(xì)胞線擴(kuò)大培養(yǎng)工藝難題而使規(guī)模不能線性放大，并且這些工藝中所用的培養(yǎng)載體(如紙片載體和微載體)都是進(jìn)口的，生產(chǎn)成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種操作簡單，成本低廉的用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
1)微載體處理: 將微載體以含有吐溫-80的純化水浸泡，再以PBS平衡鹽溶液清洗后，轉(zhuǎn)入至反應(yīng)器或懸浮培養(yǎng)瓶中，高壓滅菌，冷卻靜置，以含新生小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液清洗后加入相同體積的含新生小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液備用；
2)胰蛋白酶消化微載體和細(xì)胞:
消化Ig長滿細(xì)胞的膠原微載體用質(zhì)量百分比濃度為0.25%的胰蛋白酶25-50ml的比例使用胰蛋白酶；
3)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng):
從方瓶一0.25-2L懸浮培養(yǎng)瓶一5-7.5L反應(yīng)器一50-120L反應(yīng)器一250L反應(yīng)器—線性放大。
[0005]進(jìn)一步的，上述的一種用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法，所述步驟I)中的微載體處理，是按照以下步驟進(jìn)行的:
a)所述膠原微載體為GF-240型微載體，將GF-240型微載體用含體積百分含量為萬分之一的吐溫-80的純化水浸泡3-12h，期間攪拌一次使之充分浸泡，純化水的用量為每Ig微載體浸泡需20-1OOml含吐溫的純化水；
b)將步驟a)處理的微載體棄純化水，用無Ca2+、Mg2+的PBS平衡鹽溶液洗2次，每次清洗Ig微載體需要20-100mlPBS 平衡鹽溶液，所述PBS平衡鹽溶液的pH值為7.2±0.1，滲透壓在290-320mmol/kg之間；
c)將步驟b)處理的微載體棄PBS平衡鹽沉溶液，用PBS平衡鹽溶液制成2-20g/L的濃度后轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器或懸浮培養(yǎng)瓶中，連同反應(yīng)器或懸浮培養(yǎng)瓶以121°C高壓蒸汽滅菌30min,自然冷卻或向其中通空氣加速冷卻至室溫后靜置30min以上，所述PBS平衡鹽溶液的pH值為7.2±0.I,滲透壓在290-320mmol/kg之間；
d)將步驟c)處理的微載體棄PBS平衡鹽溶液，用含體積百分含量10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液洗I遍后再加相同體積的含體積百分含量2%-10%的新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液備用；洗Ig微載體需要20-50ml含體積百分含量10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0006]所述的細(xì)胞培養(yǎng)液是指將市售的MEM、DMEM和DMEM/F12等成品干粉培養(yǎng)基，按說明書配成液體，使用時(shí)加入相應(yīng)比例的NBCS后用于培養(yǎng)動物細(xì)胞。
[0007]進(jìn)一步的，上述的一種用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的過程包括以下步驟:
A)細(xì)胞復(fù)蘇與擴(kuò)增培養(yǎng):按常規(guī)方法復(fù)蘇細(xì)胞，在含體積百分含量8%_10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至單層，按常規(guī)方法用質(zhì)量百分比濃度為0.25%-1%胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞至總量達(dá)下述B)所需的量；
B)懸浮細(xì)胞瓶微載體培養(yǎng)細(xì)胞:將上述步驟A)的細(xì)胞按常規(guī)方法消化，按每個載體上10-50個細(xì)胞的比例接種到微載體添加量為2-20g/L的懸浮培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加含體積百分含量8-10%新生小 牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至終培養(yǎng)體積的40-100%，培養(yǎng)溫度為37土1°C，培養(yǎng)前3-12h采用間歇攪拌的方式，其后采用20-50rpm固定轉(zhuǎn)速攪拌，培養(yǎng)12h后加含體積百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至終培養(yǎng)體積100%，從培養(yǎng)時(shí)起每隔12_24h取樣觀察細(xì)胞生長情況、計(jì)數(shù)細(xì)胞密度和檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的剩余量，并根據(jù)培養(yǎng)液葡萄糖的含量換加含體積百分含量8%-10%NBCS的DMEM培養(yǎng)液，以保證反應(yīng)器中培養(yǎng)液的葡萄糖含量> lg/L(因DMEM培養(yǎng)液中的葡萄糖含量為4.5g/L，細(xì)胞生長需要消耗培養(yǎng)液中的葡萄糖，取出部分已培養(yǎng)了細(xì)胞的培養(yǎng)液，換加沒有培養(yǎng)細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液可提高培養(yǎng)液中的葡萄糖)，至80%以上的微載體上細(xì)胞長成致密單層；所述間歇攪拌是攪拌3-5min,停止20_60min，再攪拌3_5min的反復(fù)攪停過程,其中攪拌轉(zhuǎn)速為20_50rpm ；
C)懸浮細(xì)胞瓶微載體擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞:將上述步驟B)的細(xì)胞，以步驟I)中步驟b)的方法以25-38°C預(yù)熱的PBS平衡鹽溶液洗兩次，按每克載體用10-50ml質(zhì)量百分比濃度為
0.25%-1%胰蛋白酶酶解消化至膠原載體全部消失和細(xì)胞完全分散的狀態(tài)，加入新生小牛血清NBCS中和l_3min，用備好的原微載體2-8倍的量的微載體進(jìn)行再培養(yǎng)，培養(yǎng)方法按上述步驟B)進(jìn)行，至80%以上的微載體上細(xì)胞長成致密單層；其中，中和胰蛋白酶用新生小牛血清NBCS的量是以酶解消化用胰蛋白酶按質(zhì)量百分比濃度0.25%計(jì)算的量的40%-60% ；
D)5-7.5L反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞:將上述步驟C)處理得到的細(xì)胞懸液，同備好的原微載體2-6倍的量的微載體接種5-7.5L反應(yīng)器中培養(yǎng)，加含體積百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至終培養(yǎng)體積的40-60%，反應(yīng)器的參數(shù)設(shè)置為:溫度37°C、pH7.1-7.3、溶氧20-80%，轉(zhuǎn)速20_100rpm (轉(zhuǎn)速以微載體能完全攪成懸浮狀的最低轉(zhuǎn)速為最好)，培養(yǎng)前3-12h采用間歇攪拌的方式，其后采用20-100rpm固定轉(zhuǎn)速攪拌，培養(yǎng)12h后加含體積百分含量8-10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至培養(yǎng)終體積的100%，從培養(yǎng)時(shí)起每隔12-24h取樣觀察細(xì)胞生長情況、計(jì)數(shù)細(xì)胞密度和檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的剩余量，并根據(jù)培養(yǎng)液葡萄糖的含量換加含體積百分含量8%_10%新生小牛血清NBCS的DMEM培養(yǎng)液，以保證反應(yīng)器中細(xì)胞液的葡萄糖含量> lg/L，至80%以上的微載體上細(xì)胞長成致密單層為止;
E)50L及以上反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞:用上述步驟D)培養(yǎng)得到的細(xì)胞，將5-7.5L反應(yīng)器的細(xì)胞按步驟D)逐級擴(kuò)大培養(yǎng)至50-120L反應(yīng)器一250 L反應(yīng)器一線性放大。
[0008]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供的一種用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法，其采用反應(yīng)器和國產(chǎn)的膠原微載體擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞的工藝，培養(yǎng)規(guī)模從方瓶一(0.25-2L懸浮培養(yǎng)瓶)一(5-7.5L反應(yīng)器)一(50-120L反應(yīng)器)一250L反應(yīng)器一線性放大，從根本上解決了微載體培養(yǎng)細(xì)胞規(guī)模線性放大的技術(shù)工藝，該工藝操作簡單，將對現(xiàn)有疫苗工藝進(jìn)行技術(shù)升級的同時(shí)，降低了疫苗的生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量，在實(shí)際生產(chǎn)中具有應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】 [0009]實(shí)施例1:
1、材料:
1)細(xì)胞株，Marc-145細(xì)胞，從CCTCC引進(jìn)；
2)DMEM 培養(yǎng)液，Invitrigen Corporation,貨號:02_5062EJ,按說明書配制；
3)胰蛋白酶,InvitrigenCorporation,貨號:27250,使用時(shí)按常規(guī)方法配成質(zhì)量百分比濃度為0.25% ；
4)GF-240,蘭州百靈，批號=20121218,每克含3.1 X IO6個載體；
5)新生牛血清(NBCS)，蘭州民海，批號=20120716；
2、儀器設(shè)備:
O培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific Corporation, 3111 ；
2)相差倒置顯微鏡，OLYMPUS，CKX41；
3)反應(yīng)器
(1)NewBrunswick, Celligen 310，培養(yǎng)罐總體積7.5L,終有效培養(yǎng)體積5L ；
(2)江蘇綠揚(yáng)，YB-50QXF,培養(yǎng)罐總體積75L，終有效培養(yǎng)體積50L；
(3)江蘇綠揚(yáng)，YB-200QXF,培養(yǎng)罐總體積250L，終有效培養(yǎng)體積200L；
4)懸浮培養(yǎng)瓶，蘭州百靈，終有效培養(yǎng)體積1L。
[0010]5)磁力攪拌器，TECHEN, MSC-104S。
[0011]3、其它:
凱氏細(xì)胞培養(yǎng)方瓶:T-75、T-150。
[0012]4、方法:
I)各培養(yǎng)階段按有效培養(yǎng)體積計(jì)算所加的微載體的量如下:
(1)IL懸浮細(xì)胞瓶，6g，
(2)7.5L 反應(yīng)器，9g，
(3)75L 反應(yīng)器，3.6g，
(4)250L 反應(yīng)器，4g。[0013]2)微載體處理:
(I)按上述步驟4第I)條所示的微載體量，在每個培養(yǎng)階段的接種細(xì)胞前48h完成微載體的浸泡、PBS清洗、滅菌及培養(yǎng)液清洗過程。
[0014](2)浸泡:稱取所需量的GF-240型微載體，含體積百分含量萬分之一吐溫_80的純化水浸泡5h，期間攪拌一次使之充分浸泡，Ig微載體浸泡用30ml含吐溫-80的純化水。
[0015](3)清洗:將步驟(2)處理的微載體棄純化水，用pH值為7.21、滲透壓為295mmol/kg且無Ca2+、Mg2+的PBS平衡鹽溶液洗2次，每次清洗Ig微載體需要30mlPBS平衡鹽溶液。
[0016](4)滅菌:將步驟(3)處理的微載體棄PBS平衡鹽沉 溶液，用PBS平衡鹽溶液制成2-20g/L的濃度后轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器(或懸浮培養(yǎng)瓶)，以121°C高壓蒸汽滅菌30min，自然冷卻至溫室后靜置lh。
[0017](5)培養(yǎng)液清洗:將步驟(4)處理的微載體棄PBS平衡鹽溶液，用含體積百分含量10%NBCS的DMEM培養(yǎng)液洗I遍后再加相同體積的含體積百分含量10%NBCS的DMEM培養(yǎng)液備用。洗Ig微載體用30ml含體積百分含量10%NBCS的DMEM培養(yǎng)液。
[0018]3)細(xì)胞復(fù)蘇與擴(kuò)增培養(yǎng):按常規(guī)方法復(fù)蘇細(xì)胞至T-75的方瓶中，在含體積百分含量10%NBCS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)至單層，按常規(guī)方法用質(zhì)量百分比濃度為0.25%胰蛋白酶消化消化傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)擴(kuò)大方式為I個T-75 — I個T-150 — 4個T-150 — 16個T-150 — 48個T-150，消化I個T-75和T-150的細(xì)胞各需胰蛋白酶液5ml和10ml，消化作用時(shí)間3_5min。
[0019]4)1L懸浮細(xì)胞瓶微載體培養(yǎng)細(xì)胞:將上述步驟3)獲得的細(xì)胞按常規(guī)方法消化，按每個載體上28個細(xì)胞的比例接種到微載體加量為6g/L的IL懸浮培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加含體積百分含量10%NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至500ml，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)前6h采用間歇攪拌的方式，其后采用30rpm固定轉(zhuǎn)速攪拌。培養(yǎng)12h后加含體積百分含量10%NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至1L，從培養(yǎng)時(shí)起每24h取樣觀察細(xì)胞生長情況、計(jì)數(shù)細(xì)胞密度和檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的剩余量，并根據(jù)培養(yǎng)液葡萄糖的含量換加含體積百分含量10%NBCS的DMEM培養(yǎng)液，使反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中葡萄糖含量保持在lg/L以上，至到80%以上的微載體上細(xì)胞長成致密單層。所述間歇攪拌是攪拌3min,停止30min,再攪拌3min的反復(fù)攪停過程,其中攪拌轉(zhuǎn)速為30rpm。
[0020]5)IL懸浮細(xì)胞瓶微載體擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞:將上述步驟4)的細(xì)胞，用37°C預(yù)熱的PBS液洗兩次，每次用200ml的PBS液，用180ml質(zhì)量百分比濃度為0.25%胰蛋白酶酶解消化至膠原載體全部消失和細(xì)胞完全分散的狀態(tài)，加入90ml的NBCS中和3min后加入18g已處理備用的載體，平均分到三個IL懸浮細(xì)胞瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶加含體積百分含量10%NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至500ml繼續(xù)培養(yǎng)至到80%以上的微載體上細(xì)胞長成致密單層，培養(yǎng)方法同步驟4)。
[0021]6)7.5L反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞:將上述步驟5)所獲的細(xì)胞，棄上清后將微載體和細(xì)胞收集到一個IL懸浮細(xì)胞瓶中，用37°C預(yù)熱的PBS液洗兩次，每次用500ml的PBS液，用500ml質(zhì)量百分比濃度為0.25%胰蛋白酶酶解消化至膠原載體全部消失和細(xì)胞完全分散的狀態(tài)，加入250ml的NBCS中和3min后移到已處理備好50g微載體的7.5L反應(yīng)器，加含體積百分含量10%NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至2.5L繼續(xù)培養(yǎng)。反應(yīng)器的參數(shù)設(shè)置為:溫度37°C、pH7.2、溶氧60%，培養(yǎng)前3h采用間歇攪拌的方式，其后采用30rpm固定轉(zhuǎn)速攪拌。培養(yǎng)12h后加含體積百分含量10%NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至5L。從培養(yǎng)時(shí)起每24h取樣觀察細(xì)胞生長情況、計(jì)數(shù)細(xì)胞密度和檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的剩余量，并根據(jù)培養(yǎng)液葡萄糖的含量換加含體積百分含量10%NBCS的DMEM培養(yǎng)液，以保證反應(yīng)器中細(xì)胞液的葡萄糖含量≥lg/L，至到80%以上的微載體上細(xì)胞長成致密單層。所述間歇攪拌是攪拌3min，停止30min，再攪拌3min的反復(fù)攪停過程,其中攪拌轉(zhuǎn)速為30rpm。
[0022]7) 75L反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞:將上述步驟6)所獲的細(xì)胞，按步驟5)所述的方法和程序擴(kuò)大培養(yǎng)至備好200g微載體的75L反應(yīng)器繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至到80%以上的微載體上細(xì)胞長成致密單層。其中，清洗過程每次用PBS液2L，消化細(xì)胞用酶液1.5L，中和用NBCS750ml，前12小時(shí)采用間歇攪拌的方式。反應(yīng)器的參數(shù)設(shè)置為:溫度37°C、pH7.2、溶氧60%，培養(yǎng)前3h采用間歇攪拌的方式，其后采用60rpm固定轉(zhuǎn)速攪拌。培養(yǎng)前12h內(nèi)用23L含體積百分含量10%NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)12h后加含體積百分含量10%NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至50L。所述間歇攪拌是攪拌3min,停止30min,再攪拌3min的反復(fù)攪停過程,其中攪拌轉(zhuǎn)速為60rpm。
[0023]8) 250L反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞:將上述步驟7)所獲的細(xì)胞，按步驟7)所述的方法和程序擴(kuò)大培養(yǎng)至備好1000g微載體的250L反應(yīng)器繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至到80%以上的微載體上細(xì)胞長成致密單層。其中，清洗過程每次用PBS液10L，消化細(xì)胞用酶液5L，中和用NBCS2.5L。培養(yǎng)前12h內(nèi)用120L含體積百分含量10%NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)培養(yǎng)12h后加含體積百分含量10%NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至200L。反應(yīng)器的參數(shù)設(shè)置和培養(yǎng)過程同步驟7)。
[0024]表1為Marc-145細(xì)胞放大培養(yǎng)各階段的細(xì)胞密度。
[0025]表1:
【權(quán)利要求】
1.一種用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟: .1)微載體處理: 將微載體以含有吐溫-80的純化水浸泡，再以PBS平衡鹽溶液清洗后，轉(zhuǎn)入至反應(yīng)器或懸浮培養(yǎng)瓶中，高壓滅菌，冷卻靜置，以含新生小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液清洗后加入相同體積的含新生小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液備用； .2)胰蛋白酶消化微載體和細(xì)胞: 消化Ig長滿細(xì)胞的膠原微載體用質(zhì)量百分比濃度為0.25%的胰蛋白酶25-50ml的比例使用胰蛋白酶； . 3)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng):
從方瓶一0.25-2L懸浮培養(yǎng)瓶一5-7.5L反應(yīng)器一50-120L反應(yīng)器一250L反應(yīng)器—線性放大。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟I)中的微載體處理，是按照以下步驟進(jìn)行的: a)所述膠原微載體為GF-240型微載體，將GF-240型微載體用含體積百分含量為萬分之一的吐溫-80的純化水浸泡3-12h，期間攪拌一次使之充分浸泡，純化水的用量為每Ig微載體浸泡需20-1OOml含吐溫的純化水； b)將步驟a)處理的微載體棄純化水，用PBS平衡鹽溶液洗2次，每次清洗Ig微載體需要20-100mlPBS平衡鹽溶液，所述PBS平衡鹽溶液的pH值為7.2±0.1,滲透壓在.290-320mmol/kg 之間； c)將步驟b)處理的微載體棄PBS平衡鹽沉溶液，用PBS平衡鹽溶液制成2-20g/L的濃度后轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器或懸浮培養(yǎng)瓶中，連同反應(yīng)器或懸浮培養(yǎng)瓶以121°C高壓蒸汽滅菌30min,自然冷卻或向其中通空氣加速冷卻至室溫后靜置30min以上，所述PBS平衡鹽溶液的PH值為7.2±0.1，滲透壓在290-320mmol/kg之間； d)將步驟c)處理的微載體棄PBS平衡鹽溶液，用含體積百分含量10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液洗I遍后再加相同體積的含體積百分含量2%-10%的新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液備用；洗Ig微載體需要20-50ml含體積百分含量10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用膠原微載體在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法，其特征在于，所述細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的過程包括以下步驟: A)細(xì)胞復(fù)蘇與擴(kuò)增培養(yǎng):按常規(guī)方法復(fù)蘇細(xì)胞，在含體積百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至單層，按常規(guī)方法用質(zhì)量百分比濃度為0.25%-1%胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞至總量達(dá)下述B)所需的量； B)懸浮細(xì)胞瓶微載體培養(yǎng)細(xì)胞:將上述步驟A)的細(xì)胞按常規(guī)方法消化，按每個載體上10-50個細(xì)胞的比例接種到微載體添加量為2-20g/L的懸浮培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加含體積百分含量8-10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至終培養(yǎng)體積的40-100%，培養(yǎng)溫度為.37 土 1°C，培養(yǎng)前3-12h采用間歇攪拌的方式，其后采用20-50rpm固定轉(zhuǎn)速攪拌，培養(yǎng)12h后加含體積百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至終培養(yǎng)體積100%，從培養(yǎng)時(shí)起每隔12_24h取樣觀察細(xì)胞生長情況、 計(jì)數(shù)細(xì)胞密度和檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的剩余量，并根據(jù)培養(yǎng)液葡萄糖的含量換加含體積百分含量8%-10%NBCS的DMEM培養(yǎng)液，以保證反應(yīng)器中培養(yǎng)液的葡萄糖含量> lg/L，至80%以上的微載體上細(xì)胞長成致密單層；所述間歇攪拌是攪拌3-5min，停止20_60min，再攪拌3_5min的反復(fù)攪停過程，其中攪拌轉(zhuǎn)速為20-50rpm ； C)懸浮細(xì)胞瓶微載體擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞:將上述步驟B)的細(xì)胞，以步驟I)中步驟b)的方法以25-38°C預(yù)熱的PBS平衡鹽溶液洗兩次，按每克載體用10-50ml質(zhì)量百分比濃度為.0.25%-1%胰蛋白酶酶解消化至膠原載體全部消失和細(xì)胞完全分散的狀態(tài)，加入新生小牛血清NBCS中和l_3min，用備好的原微載體2_8倍的量的微載體進(jìn)行再培養(yǎng)，培養(yǎng)方法按上述步驟B)進(jìn)行，至80%以上的微載體上細(xì)胞長成致密單層；其中，中和胰蛋白酶用新生小牛血清NBCS的量是以酶解消化用胰蛋白酶按質(zhì)量百分比濃度0.25%計(jì)算的量的40%-60% ； D)5-7.5L反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞:將上述步驟C)處理得到的細(xì)胞懸液，同備好的原微載體2-6倍的量的微載體接種5-7.5L反應(yīng)器中培養(yǎng)，加含體積百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至終培養(yǎng)體積的40-60%，反應(yīng)器的參數(shù)設(shè)置為:溫度37°C、pH7.1-7.3、溶氧20-80%，轉(zhuǎn)速20_100rpm，培養(yǎng)前3_12h采用間歇攪拌的方式，其后采用20-100rpm固定轉(zhuǎn)速攪拌，培養(yǎng)12h后加含體積百分含量8-10%新生小牛血清NBCS的細(xì)胞培養(yǎng)液至培養(yǎng)終體積的100%，從培養(yǎng)時(shí)起每隔12-24h取樣觀察細(xì)胞生長情況、計(jì)數(shù)細(xì)胞密度和檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的剩余量，并根據(jù)培養(yǎng)液葡萄糖的含量換加含體積百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的DMEM培養(yǎng)液，以保證反應(yīng)器中細(xì)胞液的葡萄糖含量≥lg/L,至80%以上的微載體上細(xì)胞長成致密單層為止； E)50L及以上反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞:用上述步驟D)培養(yǎng)得到的細(xì)胞，將5-7.5L反應(yīng)器的細(xì)胞按步驟D)逐級擴(kuò)大培養(yǎng)至50-120L反應(yīng)器一250 L反應(yīng)器一線性放大。
【文檔編號】C12N5/07GK103614333SQ201310568972
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】馮玉萍, 喬自林, 令世鑫, 李明生, 馮若飛, 王家敏, 馬忠仁 申請人:喬自林, 馬忠仁, 令世鑫, 馮玉萍, 馮若飛, 李明生, 王家敏