一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法。通過設計特異的擴增引物，PCR反應成功擴增到了該基因的cDNA序列，其核苷酸序列具有1425bp，編碼的氨基酸序列具有474個氨基酸殘基。誘導多巴脫羧酶基因在淡水小龍蝦體內過量表達可以提高淡水小龍蝦先天免疫系統中多巴轉化為多巴胺的能力，從而可以提高淡水小龍蝦的抗菌能力。
【專利說明】—種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法，屬于分子生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]無脊椎動物在進化方面的地位要比脊椎動物低，其免疫系統不如脊椎動物發(fā)達，但是也具有比較全面的免疫類型和相關的信號途徑網絡結構。無脊椎動物的免疫系統在低等的甲殼類動物中研究的較為清楚，目前統一稱為先天免疫系統。在以甲殼類動物為代表的無脊椎動物體內，先天免疫系統主要包括物理屏障、細胞免疫和體液免疫三種形式。這個先天免疫系統發(fā)揮著防御細菌與病毒等病原微生物的侵染，物理屏障是防御病原微生物入侵的第一道天然屏障，主要包括甲殼類動物的體表和腸道，細胞免疫主要包括免疫細胞的吞噬作用、結節(jié)的形成和包囊作用，體液免疫主要是指酚氧化酶原活化系統介導的黑化作用和相關信號途徑介導的抗菌肽類物質的表達。
[0003]酚氧化酶原活化系統介導的黑化作用在發(fā)揮功能的過程中，需要借助于絲氨酸蛋白酶水解級聯反應來將酚氧化酶原激活為酚氧化酶，活化后的酚氧化酶可以將多巴胺轉化為醌類物質，形成包囊來進一步發(fā)揮黑化作用。其中，作為酚氧化酶底物的多巴胺是由多巴脫羧酶催化多巴進行脫羧反應生成的，因此，多巴脫羧酶活性的高低可以影響多巴胺的濃度，從而影響黑化反應的進展，從而反應了多巴脫羧酶的重要地位。一般情況下，當發(fā)生病原微生物入侵之后，多巴脫羧酶的基因表達量就會被上調表達，從而蛋白質表達量也會被上調，從而促進了多巴 轉化為多巴胺的反應進行，使黑化作用進一步加強，促進宿主對于病原微生物的清除。在中國對蝦、凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、日本對蝦中，相關研究結果表明，細菌或者白斑病毒的入侵都會引起多巴脫羧酶基因的上調表達，進一步顯示了多巴脫羧酶通過參與黑化反應的信號途徑從而發(fā)揮免疫防衛(wèi)作用，也就是說甲殼類動物的多巴脫羧酶基因是一個先天免疫防御相關的基因。
[0004]淡水小龍蝦是一種重要的甲殼類動物，具有較高的經濟養(yǎng)殖價值，一直是我國比較重要的水產養(yǎng)殖動物。同時，伴隨著淡水小龍蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，細菌入侵和病毒感染造成的蝦類疾病也在頻繁發(fā)生，困擾著淡水小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。開展淡水小龍蝦先天免疫相關基因的研究工作，可以不斷完善先天免疫系統的基礎理論，同時，多巴脫羧酶基因的研究工作將會進一步豐富先天免疫系統相關的免疫防御基因的種類與數量。更重要的是，開展淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因的研究工作將會為淡水小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)中病害的防治提供一定的理論基礎與技術支持。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC的核苷酸序列，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，具有1425bp。[0006]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼的氨基酸序列，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2，具有474個氨基酸殘基。
[0007]同時，本發(fā)明還提供該淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆方法。
[0008]本發(fā)明所提供的多巴脫羧酶基因Pc-DDC來源于淡水小龍奸(Procambarusclarkii)，命名為Pc-DDC基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，具有1425bp。
[0009]上述多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼的蛋白質來源于淡水小龍奸(Procambarusclarkii)，命名為Pc-DDC蛋白質，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2，具有474個氨基酸殘基。
[0010]上述淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆方法，包括如下步驟:
[0011](1)選用淡水小龍蝦作為實驗材料，利用動物總RNA提取試劑盒提取各組織總RNA,獲得淡水小龍蝦各個組織的總RNA樣品；
[0012](2)以步驟(1)獲得的總RNA樣品作為模板，利用一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得淡水小龍蝦各個組織的cDNA樣品；
[0013](3)設計擴增淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼區(qū)的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0014]Pc-DDC-F: 5' -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
[0015]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0016]以步驟(2)中的淡水小龍蝦各個組織的cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0017](4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切，并且與經過EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進行序列測定，獲得淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0018](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0020]本發(fā)明涉及一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法。該基因在淡水小龍蝦體內過量表達可以提高淡水小龍蝦先天免疫系統中多巴轉化為多巴胺的能力，從而可以提高淡水小龍蝦的抗菌能力。
【具體實施方式】
[0021]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述
[0022]實施例1淡水小龍蝦肝胰腺組織中多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆
[0023](1)選用淡水小龍蝦肝胰腺組織作為實驗材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行總RNA的提取,獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織的總RNA樣品；
[0024](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦肝胰腺組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織的cDNA樣品；[0025](3)設計擴增淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼區(qū)的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0026]Pc-DDC-F:5/ -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
[0027]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0028]以步驟(2)中的淡水小龍蝦肝胰腺組織的cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0029](4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切，并且與經過EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送上海生工生物工程有限公司進行序列測定，獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織多巴脫羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0030](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
[0031]實施例2淡水小龍蝦血淋巴組織多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆
[0032]( I)選用淡水小龍蝦作為實驗材料，利用淡水小龍蝦血淋巴抗凝劑作為佐劑，使用醫(yī)用注射器從淡水小龍蝦腹節(jié)中部抽取血淋巴組織液，之后，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行總RNA的提取，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織的總RNA樣品；
[0033](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦血淋巴組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織的cDNA樣品；`
[0034](3)設計擴增淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼區(qū)的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0035]Pc-DDC-F:5/ -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
[0036]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0037]以步驟(2)中的淡水小龍蝦血淋巴組織的cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0038](4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切，并且與經過EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送上海生工生物工程有限公司進行序列測定，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織多巴脫羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0039](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
`[0040]實施例3淡水小龍蝦腮組織中多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆
[0041](I)選用淡水小龍蝦腮組織作為實驗材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的TotalRNA Extractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行總RNA的提取，獲得淡水小龍蝦腮組織的總RNA樣品；
[0042](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦腮組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得淡水小龍蝦腮組織的cDNA樣品；
[0043](3)設計擴增淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼區(qū)的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0044]Pc-DDC-F:5/ -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3' [0045]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0046]以步驟(2)中的淡水小龍蝦腮組織的cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0047](4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切，并且與經過EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送上海生工生物工程有限公司進行序列測定，獲得淡水小龍蝦腮組織多巴脫羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0048](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
【權利要求】
1.一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC，其特征在于，其核苷酸序列為SEQ IDN0.1。
2.根據權利要求1所述的淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC，其特征在于，淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼的蛋白質的氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
3.一種淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)選用淡水小龍蝦作為實驗材料，利用動物總RNA提取試劑盒提取各組織總RNA，獲得淡水小龍蝦各個組織的總RNA樣品； (2)以步驟(1)獲得的總RNA樣品作為模板，利用一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得淡水小龍蝦各個組織的cDNA樣品； (3)設計擴增淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC編碼區(qū)的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
Pc-DDC-F: 5' -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
Pc-DDC-R:5/ -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3/ 以步驟(2)中的淡水 小龍蝦各個組織的cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物； (4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoRI和Xho I核酸內切酶雙酶切，并且與經過EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進行序列測定，獲得淡水小龍蝦多巴脫羧酶基因Pc-DDC基因序列。 (5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
【文檔編號】C12N9/88GK103667324SQ201310534689
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權日:2013年11月4日
【發(fā)明者】杜志強, 任乾, 李新蒼 申請人:內蒙古科技大學