一種快速鑒定10種海參品種的種特異性pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速鑒定10種海參品種的種特異性PCR方法，屬于分子生物學領(lǐng)域。本發(fā)明以10種海參的線粒體16SrRNA基因為靶基因，通過序列比對，分別設計出這10種海參的種特異性引物，提取海參線粒體基因，進行特異性PCR擴增檢測，根據(jù)PCR擴增條帶的有無即可判斷海參種類；Actinopygamauritiana，Stichopusnaso，Cucumariafrondosa，Holothuriaedulis，Holothuriaatra，Holothuriaflavomaculata，Holothuriamammata，Holothuriabacilla，Holothurianotabilis和Holothuriamoebii，經(jīng)過種特異性PCR擴增，分別得到一條274bp、276bp、264bp、275bp、270bp、273bp、274bp、276bp、276bp和270bp的特異性片段。
【專利說明】—種快速鑒定10種海參品種的種特異性PCR方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分子生物學中鑒定海參品種的方法，特別是涉及一種快速鑒定10種海參品種的種特異性PCR方法，屬于分子生物學【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]海參，屬海參綱(Holothurioidea)，是生活在海邊至8000米的海洋軟體動物，據(jù)今已有六億多年的歷史，海參以海底藻類和浮游生物為食。海參全身長滿肉刺，廣布于世界各海洋中。我國南海沿岸種類較多，約有二十余種海參可供食用，海參同人參、燕窩、魚翅齊名，是世界八大珍品之一。海參不僅是珍貴的食品，也是名貴的藥材。據(jù)《本草綱目拾遺》中記載:海參，味甘咸，補腎，益精髓，攝小便，壯陽療痿，其性溫補，足敵人參，故名海參。現(xiàn)代研究表明，海參具有提高記憶力、延緩性腺衰老，防止動脈硬化、糖尿病以及抗腫瘤等作用。
[0003]千年來海參已經(jīng)被亞洲人民視為美味和保健品。海參營養(yǎng)價值高，高蛋白、低脂肪，富含氨基酸、脂肪酸和微量元素。全球捕撈各種海參運往亞洲，據(jù)統(tǒng)計，亞太地區(qū)海參捕撈量最大，約為每年20000-40000噸，北半球溫帶地區(qū)約為9000噸/年，非洲及印度洋地區(qū)約為2000-2500噸/年，加勒比及拉美地區(qū)小于1000噸/年。不同海參品種價格差異較大，然而，許多海參經(jīng)濟種類在貿(mào)易過程中缺乏清晰的種類鑒定。一般海參加工過程會經(jīng)過剝?nèi)?nèi)臟、煮，然后烘干制成干品，這一過程使得鮮活海參原有的形態(tài)學特征被嚴重破壞，因此，運用傳統(tǒng)的形態(tài)學方法來鑒定海參品種變得非常困難，急需建立其他行之有效的方法來對市場海參品種進行快速鑒定。
[0004]相對于蛋白質(zhì)，DNA具有更加優(yōu)越的熱穩(wěn)定性，特別是線粒體DNA。平均每個動物細胞中含有1600-6000個線粒體DNA，數(shù)量上的優(yōu)勢能夠彌補食品熱加工過程中造成的DNA降解，因此非常適合作為PCR擴增的模板。此外，線粒體16S rRNA基因在種內(nèi)非常保守，非常適合作為物種鑒定的分子標記。已有運用PCR-RFLP、BLAST、FINS、DNA-條形碼、多重PCR和實時定量PCR等DNA方法鑒定物種的報道。但是，PCR-RFLP、BLAST、FINS和DNA-條形碼等方法步驟較多，需要酶切或測序分析，耗時耗力，成本也較高。多重PCR方法由于一次性PCR過程中加入引物較多，使得假陽性或假陰性幾率增大，而且一般只適用于少數(shù)種類的鑒定，比如3~4種。實時定量PCR方法雖然較快，但是成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于建立一種快速、準確、成本低廉的鑒定10種海參品種的種特異性PCR方法，它能克服上述其他方法的缺點，實現(xiàn)海參品種的快速有效鑒定。
[0006]一種快速鑒定10種海參品種的種特異性PCR方法，先對海參干品進行DNA模板的提取，然后對海參線粒體16S rRNA基因的特異性片段進行PCR擴增，最后對PCR擴增結(jié)果進行電泳檢測，有種特異性目的條帶的即為對應海參品種，種特異性目的條帶大小分為274bp,276 bp,264 bp,275 bp,270 bp,273 bp,274 bp,276 bp,276 bp和 270 bp，具體包括如下步驟:
(1)DNA模板的提取:①剪取10mg左右的海參肌肉，蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干級使用天根生化科技(北京)有限公司的海洋動物基因組DNA提取試劑盒，提取DNA作為模板，置于-20 °C備用；
(2)用種特異性PCR擴增16SrRNA基因的特異性片段；
(3)PCR產(chǎn)物電泳檢測鑒定:①以IXTBE配置1.2%的瓊脂糖凝膠溶液，加熱完全溶解,冷卻至50-60 °C ,加入I μ I GoldView核酸染料,混勻，倒入膠槽中，插入梳子,待凝膠完全凝固后，拔去梳子，將凝膠沒入含I X TBE的電泳緩沖液中，將5 μ I PCR產(chǎn)物和Iμ I 6X loding buffer混勻，依次加入加樣孔內(nèi)，將5 μ I DL2000 bp Marker加入空白加樣孔內(nèi)，電壓160 V，電泳30 min;②取出凝膠，置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，根據(jù)PCR擴增條帶的有無即可判斷海參種類,對應海參品種分別為JciiflOATga mauri tiana,Stichopus naso,Cucumaria frondosa,Holothuria edulis,Holothuria atra,Holothuriafl a vomacula ta, Holothuria mamma ta, Holothuria bacilla, Holothuria no tabi Ii s 和Holothuria moebii ； 10 X Ex Taq buffer>Ex Taq DNA聚合酶、6X loding buffer、DL2000bp Marker (寶生物工程(大連)有限公司)，引物、dNTP (生工生物工程(上海)股份有限公司)；
上述的40個循環(huán)是指在溫度95 °C條件下進行30 S，在50 V下進行I min，在72 V進行I min ；
種特異性PCR擴增反應總體系為50 μ 1，包括:38.5 μ I水；5 μ I 10 XEx Taq buffer，含 20 mM Mg2+ ；1 μ I 10 mM 的 dNTP ; 2 μ I 10 μΜ的正向引物16Sar ；2 μ I 10 μΜ反向引物；I μ I DNA 模板；0.5 μ I Ex Taq DNA 聚合酶；使用的正向引物16Sar:5，-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’ ；種特異性反向引物分別為:Actinopyga mauritiana 反向引物 16Smau_t:5， -CGAGTTAGGTTAGAAAATTTCC-3，，Stichopus naso 反向引物 16Snas_t:5， -GGGTATACTTAGTTTTCAGG-3，， 應ariafrondosa 反向引物 16Sfro_t:5，-GTCTTATGTTCTTTAGGAAGT-3，，所edulis 反向引物 16Sedu-t:5’ -ATCTAGTAAATGGGGGTGT-3’，atra 反向引物 16Satr-t:5，-AATGGGTAATATTATTCAC-3 WohiAuria fIavomaculata 反向引物 16Sfla-t:5，-GACTGCGAGGTAGTTTGTT-3，，所mammata 反向引物 16Smam-t:5，-TGCCTGAAAGGGTAAGGCC-3，，bacilla 反向引物 16Sbac-t:5’ -TTAGAGAAAGGTAAGTAA-3’，價notabilis 反向引物16Snot-t:5’ -TGGGGTTAGTTTTCTAGGT-3’，"ohiAtfria反向引物 16Smoe_t:
5， -AAAAAGGAGGAAGCTCACC-3，；
PCR反應參數(shù)為:溫度95 V，時間30 s ;然后經(jīng)40個循環(huán)，最后72 V 4 min。
[0007]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
(O種特異性PCR鑒定海參品種，解決了傳統(tǒng)形態(tài)學方法對于加工海參產(chǎn)品品種鑒定困難的局面；
(2)本發(fā)明方法只需進行常規(guī)PCR和電泳步驟，無需進一步進行酶切、測序等步驟，具有快速省時、成本低廉的特點；
(3)本發(fā)明方法具有較高的特異性、準確性和重復性，只會對相應特異性品種擴增出一條特異性PCR條帶，在其余20種海參中不會出現(xiàn)條帶；
(4)本發(fā)明方法可用于10種海參的鑒定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為特異性PCR鑒定10種海參的特異性實驗結(jié)果:a為16Sar /16Smau_t引物對；b 為 16Sar /16Snas_t 引物對；c 為 16Sar /16Sfro_t 引物對；d 為 16Sar /16Sedu_t 引物對；e 為 16Sar /16Satr_t 引物對；f 為 16Sar /16Sfla_t 引物對；g 為 16Sar /16Smam_t引物對；h 為 16Sar /16Sbac_t 引物對；i 為 16Sar /16Snot_t 引物對；j 為 16Sar /16Smoe_t引物對；M 為 TAKARA DL2000 bp Marker ； I 為 Actinopyga mauri tiana ；2 為 Stichopusnaso ；3 為 Cucumaria frondosa ；4 為 Holothuria edulis ；5 為 Holothuria atra ；6 為Holothuria flavomaculata ；7 為 Holothuria mamma ta ；8 為 Holothuria bacilla ；9 為Holothuria notabilis ；10 為 Holothuria moebii ；11 為 Apostichopus japonicus ；12為 Stichopus hermanni ； 13 為 Stichopus chloronotus ； 14 為 Thelenota ananas ； 15為 Thelenota anax ；16 為 Isostichopus badionotus ； 17 為 Bohadschia argus ；18 為Holothuria fuscopunctata ； 19 % Holothuria leucospilota ；20 % Holothuria scabra ；21 % Actinopyga echinites ；N ；
圖2為特異性PCR鑒定10種海參的重復性實驗結(jié)果:a為16Sar /16Smau_t引物對，1-10 為 Actinopyga mauri tiana ；b 為 16Sar /16Snas_t 引物對，1-10 為 Stichopus naso ；c 為 16Sar /16Sfro_t 引物對，1-10 為 Cucumaria frondosa ；d 為 16Sar /16Sedu_t 引物對，1-10 % Holothuria edulis ；e 為 16Sar /16Satr_t 引物對，1-10 % Holothuria atra ;f 為 16Sar /16Sfla-t 引物對，1-10 % Holothuria flavomaculata ；g 為 16Sar /16Smam_t引物對，1-1O % Holothuria mamma,ta, ；h 為 16Sar /16Sbac_t 引物對，1-10 % Holothuriabacilla ；i 為 16Sar /16Snot_t 引物對，1-10 為 Holothuria notabilis ；j 為 16Sar/16Smoe-t 引物對，1-10 % Holothuria moebii ;M 為 TAKARA DL2000 bp Marker ；N 為水。
【具體實施方式】
[0009]下面通過實例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例
[0010]干海參品種的鑒定
(1)DNA模板的提取:①剪取10 mg左右的海參肌肉，蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干。②使用天根生化科技(北京)有限公司的海洋動物基因組DNA提取試劑盒，按說明書步驟提取DNA作為模板,置于-20 °C備用。
[0011](2)種特異性PCR擴增16S rRNA基因的特異性片段:①反應總體系為50 μ 1，包括:38.5 μ I 水；5 μ I 10 X Ex Taq buffer (含 20 mM Mg2+) ；1 μ I dNTP (10 mM)；2 μ I 正向引物 16Sar (10 μΜ)；2 μ I 反向引物(10 μΜ)；1 μ I DNA 模板；0.5 μ I ExTaq DNA聚合酶；使用的正向引物16Sar:5’ -CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’ ；種特異性反向引物分別為-Actinopyga mauri tiana 反向引物 16Smau_t: 5 ’-CGAGTTAGGTTAGAAAAITTCC-3 ’，Stichopus naso 反向引物 16Snas_t:5， -GGGTATACTTAGTTTTCAGG-3，， 應ariafrondosa 反向引物 16Sfro_t:5，-GTCTTATGTTCTTTAGGAAGT-3，，所edulis 反向引物 16Sedu-t:5’ -ATCTAGTAAATGGGGGTGT-3’，atra 反向引物 16Satr-t:5，-AATGGGTAATATTATTCAC-3 WohiAuria flavomaculata 反向引物 16Sfla-t:5，-GACTGCGAGGTAGTTTGTT-3，，所mammata 反向引物 16Smam-t:5，-TGCCTGAAAGGGTAAGGCC-3，，bacilla 反向引物 16Sbac-t:5’ -TTAGAGAAAGGTAAGTAA-3’，價notabilis 反向引物16Snot-t:5’ -TGGGGTTAGTTTTCTAGGT-3’，"ohiAtfria反向引物 16Smoe_t:
5，-AAAAAGGAGGAAGCTCACC-3，。② PCR 反應參數(shù)為:先 95 V 30 s ;然后經(jīng) 40 個循環(huán)(950C 30 S，50 0C I min, 72 °C I min);最后 72 °C 4 min。
[0012](3) PCR產(chǎn)物電泳檢測鑒定:①以IXTBE配置1.2%的瓊脂糖凝膠溶液，加熱完全溶解，冷卻至50-60 °C,加入I μ I GoldView核酸染料,混勻,倒入膠槽中，插入梳子,待凝膠完全凝固后，拔去梳子，將凝膠沒入含I X TBE的電泳緩沖液中，將5 μ I PCR產(chǎn)物和Iμ I 6Χ loding buffer混勻，依次加入加樣孔內(nèi)，將5 μ I DL2000 bp Marker加入空白加樣孔內(nèi)，電壓160 V，電泳30 min。②取出凝膠，置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，根據(jù)PCR擴增條帶的有無即可判斷海參種類。mauri tiana, Stichopus naso, Cucumariafrondosa, Holo thuri a edulis ,Holothuria a tra ,Holo thuri a fl a vomacula t a, Ho 1 thuri amamma ta, Holo thuri a bacilla, Holothuria notabilis 取 Holothuria經(jīng)過種特異性 PCR 擴增，分別得到一條 274 bp,276 bp,264 bp,275 bp,270 bp,273 bp,274 bp,276bp、276 bp和270 bp的特異性片段。
[0013]本發(fā)明所涉及的海參購于市場，經(jīng)BLAST測序比對方法鑒定，確定其種類分別為:Actinopyga mauri tiana, Sti chopus naso, Cucumaria frondosa, Holothuria edulis,Holothuria atra, Holothuria flavomaculata, Holothuria mamma ta, Holo thuri abacilla, Holothuria notabilis 矛口 Holothuria moebii。
`[0014]本發(fā)明所用的主要試劑為:海洋動物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，10 X Ex Taq buffer、Ex Taq DNA 聚合酶、6 X loding buffer、DL2000 bpMarker (寶生物工程(大連)有限公司)，引物、dNTP (生工生物工程(上海)股份有限公司)，瓊脂糖(Biowest)。
[0015]本發(fā)明所用的主要儀器為:5424離心機(Eppendorf), T-100 PCR儀(Bio-Rad),EPS-300電泳儀(上海天能科技有限公司)，ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。
[0016]本發(fā)明根據(jù)10種海參16S rRNA基因的特異性，分別設計合成了 10個特異性反向引物，引物信息見表1。
[0017]表1特異性引物信息
海參種類I引物名稱 I引物序列(5’ 一 3’)I擴增產(chǎn)物大小—

16Sar CGCCTGTTTATCAAAAACATActinopygaauritiana16Smau-t CGAGTTAGGTTAGAAAATTTCC274bp
Stichopusnaso16Snas-t GGGTATACTTAGTTTTCAGG276bp
Cucumariafrondosa16Sfro-t GTCTTATGTTCTTTAGGAAGT264bp
Holothuriaedulis16Sedu-t ATCTAGTAAATGGGGGTGT275bp
Holothuriaatra16Satr-t AATGGGTAATATTATTCAC270bp
Holothuriaflavomaculata|l6Sfla-t |GACTGCGAGGTAGTTTGTT|273bp種特異性PCR鑒定10種海參的特異性實驗
對21種海參進行10個PCR擴增，驗證10對引物的特異性。每個反應總體系為50 μ 1，包括:38.5 μ I 水；5 μ I 10 X Ex Taq buffer (含 20 mM Mg2+) ；1 μ I dNTP (10 mM)；2 μ I 正向引物 16Sar (10 μΜ)；2 μ I 反向引物(10 μΜ)；1 μ I DNA 模板；0.5 μ I ExTaq DNA聚合酶。PCR反應參數(shù)為:先95 V 30 s ;然后經(jīng)40個循環(huán)(95 V 30 s，50 V Imin, 72 V I min);最后72 V 4 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳30 min，電壓160 V。置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照。實驗結(jié)果如圖1，結(jié)果表明:設計的10對特異性引物均能對目的海參擴增出一條相應長度的特異性片段，而對其他海參均無非特異性擴增(假陽性)，說明該發(fā)明方法的特異性較好。
[0018]種特異性PCR鑒定10種海參的重復性實驗
每種海參隨機選取10個個體，分別采用種特異性PCR進行擴增，PCR反應體系何反應參數(shù)如實驗例1，驗證種特異性PCR的重復性。實驗結(jié)果如圖2，結(jié)果表明:設計的10對特異性引物均能對目的海參擴增出一條相應長度的特異性片段，10個海參個體的擴增結(jié)果沒有明顯區(qū)別，無特異性擴增不出的現(xiàn)象(假陰性)，說明該發(fā)明方法的重復性較好。
【權(quán)利要求】
1.一種快速鑒定10種海參品種的種特異性PCR方法，其特征在于:先對海參干品進行DNA模板的提取，然后對海參的線粒體16S rRNA基因的特異性片段進行PCR擴增，最后對PCR擴增結(jié)果進行電泳檢測，有種特異性目的條帶的即為對應海參品種，種特異性目的條帶大小分為 274 bp,276 bp,264 bp,275 bp,270 bp,273 bp,274 bp,276 bp,276 bp 和 270 bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒定10種海參品種的種特異性PCR方法，其特征在于:具體包括如下步驟: (1)DNA模板的提取:①剪取8-10mg的海參肌肉，蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干；②使用海洋動物基因組DNA提取試劑盒，提取DNA作為模板，置于-20 °C備用； (2)用種特異性PCR擴增海參的線粒體16SrRNA基因的特異性片段； (3)PCR產(chǎn)物電泳檢測鑒定:①以IXTBE配置1.2%的瓊脂糖凝膠溶液，加熱完全溶解,冷卻至50-60 °C ,加入I μ I GoldView核酸染料,混勻，倒入膠槽中，插入梳子,待凝膠完全凝固后，拔去梳子，將凝膠沒入含IXTBE的電泳緩沖液中，將5 μ I PCR產(chǎn)物和Iμ I 6X loding buffer混勻，依次加入加樣孔內(nèi)，將5 μ I DL2000 bp Marker加入空白加樣孔內(nèi)，電壓160 V，電泳30 min;②取出凝膠，置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，根據(jù)PCR擴增條帶的有無即可判斷海參種類,對應海參品種分別為JciiflOATga mauritiana,Stichopus naso, Cucumaria frondosa,Holothuria edulis，Holothuria atra，Holothuriafl a vomacula ta，Holo thuri a mamma ta，Holo thuri a bad Ila，Holo thuri a no tabi Ii s 矛口Holothuria moebiL.3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種快速鑒定10種海參品種的種特異性PCR方法，其特征在于:所述的PCR反應參數(shù)為:溫度95 V，時間30 s ;然后經(jīng)40個循環(huán)，最后72 V 4min。]
3.
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種快速鑒定10種海參品種的種特異性PCR方法，其特征在于:種特異性 PCR擴增反應總體系為50 μ 1，包括:38.5 μ I水；5 μ I10 X Ex Taq buffer， 含 20 mM Mg2+ ；I μ I 10 mM 的 dNTP ;2 μ I 10 μΜ 的正向引物 16Sar ；2 μ I 10 μ M 反向引物；I μ I DNA 模板；0.5 μ I Ex Taq DNA 聚合酶；使用的正向引物16Sar:5，-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’ ；種特異性反向引物分別% -Actinopyga mauritiana 反向弓丨物 16Smau_t:5’-CGAGTTAGGTTAGAAAATTTCC-3’，Stichopus rrnso 反向引物 16Snas_t:5， -GGGTATACTTAGTTTTCAGG-3，， 應ariafrondosa 反向引物 16Sfro_t:5，-GTCTTATGTTCTTTAGGAAGT-3，，所edulis 反向引物 16Sedu-t:5’ -ATCTAGTAAATGGGGGTGT-3’，atra 反向引物 16Satr-t:5，-AATGGGTAATATTATTCAC-3 WohiAuria fIavomaculata 反向引物 16Sfla-t:5，-GACTGCGAGGTAGTTTGTT-3，，所mammata 反向引物 16Smam-t:5，-TGCCTGAAAGGGTAAGGCC-3，，bacilla 反向引物 16Sbac-t:5’ -TTAGAGAAAGGTAAGTAA-3’，價notabilis 反向引物16Snot-t:5’ -TGGGGTTAGTTTTCTAGGT-3’，"ohiAtfria反向引物 16Smoe_t:5， -AAAAAGGAGGAAGCTCACC-3，。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3任意一項所述的一種快速鑒定10種海參品種的種特異性PCR方法，其特征在于:所述的40個循環(huán)是指在溫度95 °C條件下進行30 S，在50 V下進行Imin,在 72 °C 進行 I min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484553SQ201310473375
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】文菁, 曾玲 申請人:湛江師范學院