一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒，包括96微孔板和顯色劑，96微孔板的孔中設(shè)置有原油和NaCl晶體，原油的量為1～10mg/孔，NaCl晶體在每孔中的質(zhì)量不同，NaCl晶體的質(zhì)量在微孔中在1mg-51mg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置，或在10mg-100mg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置，顯色劑是質(zhì)量百分濃度為0.1%～1%的碘硝基四氮唑水溶液。操作過程簡單，僅需稀釋石油烴降解菌等操作；試劑消耗量少，檢測一個(gè)樣品僅需幾毫升試劑；占用設(shè)備空間小，檢測一個(gè)樣品僅占用約0.1L的培養(yǎng)箱體積；試廢液少，檢測一個(gè)樣品僅產(chǎn)生幾毫升廢液；通量高，可同時(shí)測定數(shù)十組石油烴降解菌。
【專利說明】一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒。
技術(shù)背景
[0002]大多數(shù)石油污染通常發(fā)生在高鹽環(huán)境中，例如石油污染鹽潰化土壤、石油污染海水和石油污染高鹽廢水等。目前，石油污染高鹽環(huán)境的治理已經(jīng)引起人們的重視，特別是采用添加石油烴降解菌的生物方法是一種治理石油污染高鹽環(huán)境的有效策略。其中，石油烴降解菌的耐鹽特性是影響治理效果的關(guān)鍵。只有耐鹽性較好的石油烴降解菌才能在高鹽環(huán)境中生存，從而進(jìn)一步降解石油烴，消除石油污染。因此，石油烴降解菌的耐鹽特性是考察其是否能應(yīng)用于石油污染高鹽環(huán)境治理的重要特征。
[0003]目前用于檢測石油烴降解菌耐鹽特性的方法主要是搖瓶檢測法。通常需要配制10~100ml含有不同濃度NaCl的液體培養(yǎng)基，接入待測的石油烴降解菌，經(jīng)過一定時(shí)間的培養(yǎng)，通過測定菌體濃度的變化來判斷石油烴降解菌的耐鹽特性。該方法操作過程較為繁瑣、試劑消耗量大、占用設(shè)備空間大，產(chǎn)生的測試廢液較多，并且通量較低。采用高通量的微量化測定試劑盒是解決這一問題的有效途徑。目前，微量化測定試劑盒已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種指標(biāo)的測定。例如:中國專利(201020629009)公布了一種采用微孔板檢測飼用植酸酶活性試劑盒，以微孔板為反應(yīng)載體，結(jié)構(gòu)簡便、使用方便，大大了提高工作效率，實(shí)現(xiàn)了大量樣品的同時(shí)測定；中 國專利(201220134074)公布了一種羥基維生素D檢測試劑盒，微孔內(nèi)包被有高特異性鼠羥基維生素D單克隆抗體層，提高了測定的線性范圍；美國專利(US6428974B1)公布了一種用于抗菌藥品測試的微孔板，具有操作簡單、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)；歐洲專利(EP1865074B1)公布了一種用于反轉(zhuǎn)錄PCR的微孔板，大大簡化了反轉(zhuǎn)錄PCR的操作。因此，采用微量化測定試劑盒檢測石油烴降解菌的耐鹽特性具有較強(qiáng)的技術(shù)可行性。然而，目前國內(nèi)外并沒有石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒的相關(guān)專利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)石油烴降解菌耐鹽特性傳統(tǒng)檢測方法操作過程較為繁瑣等缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種操作過程簡單、試劑消耗量少、占用設(shè)備空間小、測試廢液少和通量高的石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0006]一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒，包括96微孔板和顯色劑，所述96微孔板的孔中設(shè)置有原油和NaCl晶體，所述原油的量為I~IOmg/孔，所述NaCl晶體在每孔中的質(zhì)量不同，NaCl晶體的質(zhì)量在微孔中在lmg-51mg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置，或在IOmg-1OOmg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置，所述顯色劑是質(zhì)量百分濃度為0.1%~1%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0007]所述原油的量優(yōu)選為5mg/孔。[0008]優(yōu)選的是:NaCl晶體的質(zhì)量在微孔中在lmg_51mg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置為lmg、6mg、llmg、16mg、21mg、26mg、31mg、36mg、41mg、46mg 和 51mg 或 lmg、llmg、21mg、31mg、4 lmg 和 5 lmg o
[0009]優(yōu)選的是:NaCl晶體的質(zhì)量在微孔中在IOmg-1OOmg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置為 10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg 和 100mg 或 10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg 和IOOmg0
[0010]優(yōu)選的是:顯色劑是質(zhì)量百分濃度為0.5%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0012]①操作過程簡單，僅需要稀釋石油烴降解菌等操作；
[0013]②試劑消耗量少，檢測一個(gè)樣品僅需幾毫升試劑；
[0014]③占用設(shè)備空間小，檢測一個(gè)樣品僅占用約0.1L的培養(yǎng)箱體積；
[0015]④試廢液少，檢測一個(gè)樣品僅產(chǎn)生幾毫升廢液；
[0016]⑤通量高，可同時(shí)測定數(shù)十組石油烴降解菌。
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明提供一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒原理為:將石油烴降解菌用BH培養(yǎng)基等無機(jī)鹽培養(yǎng)基稀釋，加入到本發(fā)明試劑盒的96微孔板的微孔中。由于96微孔板的不同的孔中設(shè)置有原油和不同重量的NaCl晶體，因此形成了不同鹽濃度的培養(yǎng)基。石油烴降解菌培養(yǎng)過程中僅在合適的鹽濃度下生長，其生長情況可以通過添加顯色劑碘硝基四氮唑后觀察其顏色變化來測定。
[0018]BH培養(yǎng)基的配方為:磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，硝酸銨lg，硫酸鎂0.2g，氯化鐵0.05g,氯化鈣0.02g,加水至1000ml。
[0019]本發(fā)明以環(huán)境微生物學(xué)為理論依據(jù)，綜合極端微生物學(xué)和高通量檢測技術(shù)的相關(guān)理論知識(shí)，針對(duì)石油烴降解菌耐鹽特性傳統(tǒng)檢測方法的諸多缺陷，設(shè)計(jì)本檢測試劑盒，采用固定化原油和不同重量NaCl晶體的96微孔板結(jié)合碘硝基四氮唑顯色劑檢測石油烴降解菌耐鹽特性。
[0020]下面通過具體實(shí)施例闡述本發(fā)明，目的在于使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)，但不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
[0021]本發(fā)明實(shí)施例所使用的兩個(gè)菌:食燒烴戈登氏菌(Gordonia alkanivorans)CGMCCN0.6845 和克伯村鳥氨酸微菌(Ornithinimicrobium kibberense) CGMCC N0.6844 是驗(yàn)證本發(fā)明的試劑盒的有效性的，并不對(duì)本發(fā)明的試劑盒的保護(hù)范圍進(jìn)行限制。
[0022]食燒烴戈登氏菌(Gordonia alkanivorans)由本申請(qǐng)的發(fā)明人從石油污染鹽潰化土壤中分離篩選得到，具有石油烴高效降解特征和耐鹽特征。菌株于2012年11月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心并已存活，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101，電話:010-64807355，其微生物保藏編號(hào)為 CGMCC N0.6845。
[0023]克伯村鳥氨酸微菌(Ornithinimicrobium kibberense)由發(fā)明人從石油污染鹽潰化土壤中分離篩選得到，具有石油烴高效降解特征和耐鹽特征。菌株于2012年11月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心并已存活，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101，電話:010-64807355，其微生物保藏編號(hào)為 CGMCC N0.6844。
[0024]實(shí)施例1
[0025]一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒，包括96微孔板和顯色劑，96微孔板的孔中設(shè)置有原油和NaCl晶體，原油的量為5mg/孔，NaCl晶體在每孔中的質(zhì)量不同，NaCl晶體的質(zhì)量在微孔中在lmg-51mg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置為lmg、6mg、llmg、16mg、21mg、26mg、31mg、36mg、41mg、46mg和51mg,顯色劑是質(zhì)量百分濃度為0.1%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0026]本實(shí)施例試劑盒的使用:
[0027]將食烷烴戈登氏菌(Gordonia alkanivorans) CGMCC N0.6845用BH培養(yǎng)基稀釋10倍，加入到本發(fā)明的試劑盒中的96微孔板的設(shè)置有原油和NaCl晶體的孔中，每孔加入200ul，培養(yǎng)7天，每孔加入50ul顯色劑，測得該菌株可在21mg的NaCl中生長，即可耐受濃度為10.5%的NaCl。檢測操作共耗時(shí)lOmin，共消耗試劑3ml。
[0028]實(shí)施例2
[0029]一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒，包括96微孔板和顯色劑，96微孔板的孔中設(shè)置有原油和NaCl晶體，原油的量為IOmg/孔，NaCl晶體在每孔中的質(zhì)量不同，NaCl晶體的質(zhì)量在微孔中在lmg-51mg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置為lmg、llmg、21mg、31mg、4Img和51mg，顯色劑是質(zhì)量百分濃度為0.1%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0030]本實(shí)施例試劑盒的使用:`[0031]將食烷烴戈登氏菌(Gordonia alkanivorans) CGMCC N0.6845用BH培養(yǎng)基稀釋10倍，加入到本發(fā)明的試劑盒中的96微孔板的設(shè)置有原油和NaCl晶體的孔中，每孔加入200ul，培養(yǎng)7天，每孔加入30ul顯色劑，測得該菌株可在21mg的NaCl中生長，即可耐受濃度為10.5%的NaCl。檢測操作共耗時(shí)lOmin，共消耗試劑2.5ml。
[0032]實(shí)施例3
[0033]一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒，包括96微孔板和顯色劑，96微孔板的孔中設(shè)置有原油和NaCl晶體，原油的量為Img/孔，NaCl晶體在每孔中的質(zhì)量不同，NaCl晶體的質(zhì)量在微孔中在IOmg-1OOmg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置為10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg和IOOmg,顯色劑是質(zhì)量百分濃度為1%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0034]本實(shí)施例試劑盒的使用:
[0035]將食烷烴戈登氏菌(Gordonia alkanivorans) CGMCC N0.6845用BH培養(yǎng)基稀釋10倍，加入到本發(fā)明的試劑盒中的96微孔板的設(shè)置有原油和NaCl晶體的孔中，每孔加入200ul，培養(yǎng)7天，每孔加入30ul顯色劑，測得該菌株可以在20mg的NaCl中生長，即可耐受濃度為10%的NaCl。檢測操作共耗時(shí)lOmin，共消耗試劑2.5ml。
[0036]實(shí)施例4
[0037]一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒，包括96微孔板和顯色劑，96微孔板的孔中設(shè)置有原油和NaCl晶體，原油的量為2mg/孔，NaCl晶體在每孔中的質(zhì)量不同，NaCl晶體的質(zhì)量在微孔中在IOmg-1OOmg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置為10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg 和lOOmg，所述顯色劑是質(zhì)量百分濃度為5%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0038]本實(shí)施例試劑盒的使用:[0039]將克伯村鳥氨酸微菌(Ornithinimicrobiumkibberense)CGMCC N0.6844 用 BH 培養(yǎng)基稀釋10倍，加入到本發(fā)明的試劑盒中的96微孔板的設(shè)置有原油和NaCl晶體的孔中，每孔加入200ul，培養(yǎng)7天，每孔加入30ul顯色劑，測得該菌株可以在20mg的NaCl中生長，即可耐受濃度為10%的NaCl。檢測操作共耗時(shí)lOmin，共消耗試劑2.5ml。
【權(quán)利要求】
1.一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒，其特征在于包括96微孔板和顯色劑，所述96微孔板的孔中設(shè)置有原油和NaCl晶體，所述原油的量為I~IOmg/孔，所述NaCl晶體在每孔中的質(zhì)量不同，NaCl晶體的質(zhì)量在微孔中在lmg-51mg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置，或在IOmg-1OOmg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置，所述顯色劑是質(zhì)量百分濃度為0.1%~1%的碘硝基四氮唑水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒，其特征在于所述原油的量為5mg/孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒，其特征在于所述NaCl晶體的質(zhì)量在微孔中在lmg-51mg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置為lmg、6mg、llmg、16mg、21mg、26mg、31mg、36mg、41mg、46mg和 51mg 或 lmg、llmg、21mg、31mg、41mg 和 51mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒，其特征在于所述NaCl晶體的質(zhì)量在微孔中在IOmg-1OOmg范圍呈質(zhì)量梯度遞增設(shè)置為10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg 和 IOOmg 或 10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、7Omg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg 和 IOOmg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種石油烴降解菌耐鹽特性微量化檢測試劑盒，其特征在于所述顯色劑是質(zhì)量百 分濃度為0.5%的碘硝基四氮唑水溶液。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103589774SQ201310305544
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月19日
【發(fā)明者】王新新, 吳亮, 譚耀模, 楊勇, 亓俊良, 安偉, 牛志剛, 陳宇 申請(qǐng)人:中國海洋石油總公司, 中海油能源發(fā)展股份有限公司, 中海石油環(huán)保服務(wù)（天津）有限公司