一種芘高效降解菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種芘高效降解菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的芘高效降解菌為無色桿菌（Achromobactersp.），其保藏號為CGMCC?No.7741。本發(fā)明中，無色桿菌（Achromobactersp.）的篩選分離方法簡單，能有效降解芘，有利于芘污染土壤的修復(fù)。搖瓶中，降解芘的最佳條件是溫度25℃，pH6.0，初始接種量1wt%，添加菲可以顯著促進芘的降解率。在種植南瓜和添加葡萄糖時能提高菌株對土壤芘的降解效率。
【專利說明】一種芘高效降解菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種芘高效降解菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]多環(huán)芳經(jīng)(PolycyclicAromatic Hydrocarbons,PAHs)是一類廣泛存在于土壤環(huán)境中的有機污染物，也是最早被發(fā)現(xiàn)且數(shù)量最多的致癌物，目前發(fā)現(xiàn)的致癌性PAHs及其衍生物已超過400種。由于PAHs具有生物毒性、生物蓄積性和半揮發(fā)性并能在環(huán)境中持久存在等特點，已被劃分為持久性有機污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs),受到各國政府和科學(xué)界的廣泛關(guān)注。1976年美國環(huán)保局(USEPA)提出的129種“優(yōu)先控制污染物”中，PAHs類化合物就有16種；1990年我國國家環(huán)?？偩忠矊?種致癌性PAHs列入中國環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單。
[0003]微生物對PAHs的降解方式主要有兩種:(I)以PAHs為唯一碳源和能源；(2)PAHs與其他有機物質(zhì)進行共代謝。低分子量PAHs (萘、菲、蒽、芴等)可以作為唯一碳源和能量被微生物利用而降解，而多于4環(huán)的PAHs其生物降解則更依賴于共代謝過程。目前已分離到的能以PAHs為唯一碳源的微生物有假單胞菌屬、黃桿菌屬、諾卡氏菌屬、弧菌屬、解環(huán)菌屬等；白腐菌、煙管菌等則可以通過共代謝方式對4環(huán)以上PAHs加以降解。但是，目前已報道的菌株對于四環(huán)以上的PAHs降解效率還是不能滿足實際污染控制的需要，因此仍需篩選更加高效的專性降解菌，并研究其實際的土壤修復(fù)效應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種芘高效降解菌及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供的一種花高效降解菌，該株細菌為無色桿菌屬)PY1，且與木糖氧化無色桿菌dAroffioAacier xylosoxidan )相似度為99%,其從江蘇省無錫市安鎮(zhèn)加油站附近的污染農(nóng)田`里土壤分離得到。
[0006]本發(fā)明提供的無色桿菌PU菌株,其分類命名為:木糖氧化無色於舊QAchromobacter xylosoxidan ), 已于2013年6月17 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱為=CGMCC ;地址為:北京市朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所；保藏編號為=CGMCC N0.7741。
本發(fā)明提供的無色桿菌屬PYl的形態(tài)特征如下:菌株在LB平板上25°C恒溫培養(yǎng)3天后，菌落呈淡黃色、圓形、微凸、邊緣整齊、濕潤、不透明。革蘭氏染色陰性。顯微鏡下觀察，細菌為直或稍彎的短桿菌(0.4、.6 ymX2.0^5.0 μ m)，細胞單個或不規(guī)則群狀出現(xiàn)。
[0007]本發(fā)明提供的無色桿菌屬PYl主要的生理生化特征如下:非發(fā)酵、不形成芽胞、有動力、氧化酶和接觸酶陽性、氧化木糖產(chǎn)酸。
[0008]本發(fā)明的有益效果在于:無色桿菌) PYl的篩選分離方法簡單，分離出的無色桿菌(AchromobactersY).)Ρ^?I能有效降解花,有利于花污染土壤的修復(fù)。【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是無色桿菌屬dAroffioAaciersp.) PYl的生長曲線。
[0010]圖2是無色桿菌屬dAroffioAaciersp.) PYl的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0011]圖3是無色桿菌屬dAroffioAaciersp.)PY1在花-無機鹽培養(yǎng)基中的生長趨勢及芘降解效率圖。
[0012]圖4是不同培養(yǎng)溫度對無色桿菌屬iAchromobacters^.)PY1生長及花降解率的影響圖。
[0013]圖5是不同培養(yǎng)pH值對無色桿菌屬iAchromobacters^.) PYl生長及花降解率的影響圖。
[0014]圖6是不同初始接種量對芘降解率的影響圖。
[0015]圖7是不同菲濃度對芘降解率的影響圖。
[0016]圖8是接種降解菌對土壤芘降解率的影響圖。
【具體實施方式】
[0017]實施例1芘高效降解菌的篩選
采集無錫市安鎮(zhèn)加油站附近的污染土壤，取I g新鮮土樣加入到以100 mg L—1芘為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基(花-無機鹽液體培養(yǎng)基)中，在溫度為25 °C、轉(zhuǎn)速為120 rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)，一周后按lwt%的接種量轉(zhuǎn)接到新的100 mg L-1芘無機鹽液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)I周。如此重復(fù)5次后，取富集液進行梯度稀釋，涂布于芘-無機鹽雙層平板上。培養(yǎng)一周后，在平板上挑取能產(chǎn)生水解圈的單菌落，在LB平板上劃線分離純化，直至得到純的單菌落。將菌株經(jīng)培養(yǎng)后，再單獨接種到芘-無機鹽液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，選取生長速度較快的菌株作為研究對象。
[0018]其中:
無機鹽液體培養(yǎng)基的成份及含量:(NH4)2SO4 1.5 g，NaCl 0.5 g，KH2PO4 1.5 g，K2HPO40.5 g, MgSO4.7H20 0.2 g, I 000 mL H2O, pH 7.0。
[0019]100 mg L—1花-無機鹽液體培養(yǎng)基的配制方法:花先配制成I g L—1的丙酮濃縮液，從中取I mL加入100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，121 °C滅菌30 min。
[0020]菌株的鑒定:
將分離的菌種提取總DNA，總DNA經(jīng)PCR擴增后，得到大小約1.4 kb的16S rDNA產(chǎn)物，由上海申能博彩生物科技有限公司純化并測序。該菌株的16S rDNA基因序列如序列表SEQID N0.1 所示。
[0021]將分離菌株16S rDNA序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖2所示。
[0022]同時參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行生理生化鑒定，最終鑒定菌株到屬。結(jié)果表明:該株細菌為無色桿菌屬(Jchromobaciersp.)，且與Jchromobacter xylosoxidan(木糖氧化無色桿菌)相似度為99%。
[0023]本發(fā) 明中，將得到的菌株命名為無色桿菌屬) PYl0
[0024]菌株在LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線如圖1所示，在14 h的時候達到了穩(wěn)定期。
[0025]實施例2 芘的降解試驗將實施例1中得到的生長速度較快的無色桿菌屬)PY1菌株接種至100 mL芘-無機鹽液體培養(yǎng)基中，25°C，pH7.0，接種量lwt%，250 rpm搖床培養(yǎng)一周，取10mL培養(yǎng)液，用等體積的正己烷萃取，40 1:水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，加入無水硫酸鈉，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮定容，最后用Agilent 6890N氣相色譜儀(FID，HP25毛細管柱)測定芘殘留含量。
[0026]參數(shù)設(shè)置:進樣口的溫度是280 °C，檢測器的溫度為300 °C，程序升溫，始溫80°C ,恒溫 2 min, 15 °C/min 升到 280 °C ,恒溫 3 min ;載氣 N2 2 ml /min, H2 40 ml /min,空氣400 ml /min ;不分流進樣,進樣量I μ I。
[0027]菌株對芘的降解效能如圖3所示。結(jié)果顯示:經(jīng)過2 d的適應(yīng)期后，進入迅速降解期(3-5 d)，隨著菌體數(shù)量的增加，芘的降解率也逐漸增大，在培養(yǎng)至第5 d時，菌體數(shù)量達到最大，而芘的降解率仍緩慢增加，在培養(yǎng)第6 d時，菌體生長量已經(jīng)基本平穩(wěn)，說明由于底物逐漸被利用以及代謝產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致菌株死亡率逐漸增加，最終于繁殖率平衡。盡管菌體生長量保持平穩(wěn)，芘降解率仍然在緩慢增加，培養(yǎng)至第7 d時芘的降解率為89.20%。
[0028]實施例3 不同環(huán)境條件對芘降解的影響
將實施例1中得到的生長速度較快的無色桿菌屬PU菌株接種至100 mL花-無機鹽液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)一周,取10 mL培養(yǎng)液,用等體積的正己燒萃取,40 浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,加入無水硫酸鈉,再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮定容,最后用Agilent 6890N氣相色譜儀(FID，HP25毛細管柱)測定芘殘留含量。在100 ml芘-無機鹽液體培養(yǎng)基中，測試不同溫度(15、20、25、30、35 °C)、pH (4、5、6、7、8、9)(采用0.1 M氫氧化鈉或5%的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH)、接種量(0.lwt%,0.5wt%、lwt%、L 5wt%、2wt%)以及添加共代謝底物(1、2、5、10 mg L—1的菲)對其降解的影響。
[0029]無色桿菌屬(AchromobacterslQ) PYl菌株接種到無機鹽培養(yǎng)基中，分別在15、20、25,30,35 °C下培養(yǎng)，結(jié)果如圖4所示。可以看出，在15-25 °C范圍內(nèi)，芘的降解率隨溫度升高而增加，其中芘降解率在25 °C時達到最大。培養(yǎng)溫度為30 1:時，菌株P(guān)Yl的生長量最高，但芘的降解率略有下降。通過芘的降解率可以發(fā)現(xiàn)，菌體生長量大的同時芘降解率也相應(yīng)提高，說明菌株P(guān)Yl在旺盛生長的同時，與代謝有關(guān)的酶的分泌也是處于最旺盛的階段。結(jié)果表明，25~30 °C無論對于菌體生長還是芘的降解都非常有利。
[0030]不同pH值對無色桿菌屬iAchromobacter菌株降解花的效能具有不同程度的影響，結(jié)果如圖5所示。無色桿菌屬(AchromobacterspWYl菌株在強酸性環(huán)境中生長受到一定程度的抑制。隨著酸性的減弱，菌株開始大量生長繁殖，降解效率也明顯提高。菌株在pH為6左右時生長最旺盛，細菌數(shù)量大量增加，對芘的降解效率也達到最高。在中性偏堿性條件下，菌株對芘的降解效果略有下降。
[0031]不同初始接種量對芘降解率的影響如圖6所示，結(jié)果表明，初始接種量在lwt%的時候，芘的一周降解率即達到84.1%，而此后再加大接種量對最終的降解率沒有太大的影響。說明搖瓶條件下，1?〖％是比較合適的接種量。
[0032]添加共代謝底物(菲)對芘降解的影響結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明，芘和菲之間有著明顯的共代謝關(guān)系。隨著菲濃度的含量增加，無色桿菌屬C4cAro?c^aci6?rsp)P^il菌株能夠快速的以菲為碳源生長，同時分泌相關(guān)降解酶類，提高芘的降解率。菌株對芘的降解在菲濃度含量為20 mg/L時達到最大值，之后隨著菲含量的增加，降解效能急劇下降。這可能是因為菲的濃度增加對菌株也具有一定的毒性，抑制了菌體的生長。[0033]菌種保藏:菌株接入滅菌的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，搖床恒溫振蕩至穩(wěn)定期，加20%滅菌甘油，于凍藏管中，-80 °C保藏一年。[0034]實施例4芘高效降解菌對污染土壤的修復(fù)實驗 (1)芘污染土壤中的制備 將芘溶于丙酮中，配置5 g L—1濃縮液。稱取I kg過100目篩土樣放于不銹鋼托盤中，加入100 ml芘-丙酮濃縮液，用鏟子攪拌均勻，放在通風櫥內(nèi)并定期攪拌，使丙酮完全揮發(fā)。將I kg制備好的污染土與49 kg通過2 mm篩的清潔土壤充分攪拌均勻,制備花濃度為10 mg kg—1的污染土樣,供盆栽試驗使用。[0035](2)芘高效降解菌對污染土壤的修復(fù)效應(yīng)
采用2 kg的盆缽進行盆栽試驗，每個盆缽裝污染土樣1.5 kg，裝盆后用水澆透但是不產(chǎn)生滲漏水。選擇金鉤南瓜作為供試植物，挑選飽滿的種子，10%的H2O2消毒30 min,蒸餾水沖洗三遍。接種菌株于100 ml富集培養(yǎng)基中(3 g L—1牛肉膏、5 g L—1蛋白胨、5 g L^NaCl,pH 7.0，121 1:濕熱滅菌 30 min), 30 1:振蕩培養(yǎng) 48 h，離心(10000 轉(zhuǎn) min_1,5 min)收集菌體，0.1 mol L-1的MgSO4.7H20洗滌菌體3次，最后用0.1 mol L-1的MgSO4.7H20將菌體懸浮，測定細菌懸液的光密度(λ =600 nm)并調(diào)整至密度約為1012個ml'[0036]試驗共分為四個處理:1、單獨種植南瓜(Pu);2、種植南瓜+接種降解菌(Pu+PYl);3、種植南瓜+添加葡萄糖(Pu+Glu);4、種植南瓜+接種降解菌+添加葡萄糖(Pu+PYl+Glu)，同時設(shè)置不種南瓜的空白盆缽作為對照(CK)。每個處理3個重復(fù)，葡萄糖以0.6%的量加入；細菌以2%的菌懸液澆入，不接種細菌的處理施以等量的0.1 mol L-1的MgSO4溶液，與土壤混勻。每盆播種6顆消毒過的南瓜種子，發(fā)芽后間苗至3棵。盆缽隨機排列于日光溫室內(nèi)，每天稱重法保持土壤含水量為田間持水量的60%，常規(guī)管理，60 d后收獲。[0037]60 d時植株分地上部和地下部收獲，用自來水沖洗干凈后蒸餾水沖洗三遍，70 0C烘干，稱取干重，粉碎備用；每個盆缽采取混勻土樣200 g，一部分儲存于4 °C冰箱供微生物分析使用，另一部分風干磨碎，過100目篩備用。[0038]土壤中芘殘留量的測定:取2.0 g 土樣于離心管內(nèi)，加入2 g無水硫酸鈉，混勻；加入30 mL有機提取劑(丙酮:正己烷=1: 1),40 °C下超聲萃取30 min ；4000 r mirT1離心，收集上清液。該步驟重復(fù)三次，合并上清液。將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至2 mL，過Cleanert C18-SPE柱，用10 mL正己烷洗脫，40 1:下N2吹干，用正己烷定容到2 mL，GC分析。[0039]結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明，種植南瓜能顯著提高土壤芘降解率，主要是由于植物的根系分泌物增加土壤的碳源，同時改良了土壤性質(zhì)。在種植南瓜的同時，接種降解菌和添加葡萄糖處理土壤芘降解率有增加的趨勢，但是與種植南瓜相比沒有顯著差異。在接種降解菌的同時，添加少量葡萄糖作為外加碳源，對提高降解菌在土壤中的存活率具有非常重要的作用，同時土壤芘降解率也顯著高于僅添加葡萄糖的處理。
【權(quán)利要求】
1.一種花高效降解菌，其為無色桿菌C4cAro?oAaci6?rsp.)PYl,其保藏登記號為CGMCCN0.7741。
2.無色桿菌dAroffiohciersp.) PYl CGMCC N0.7741在降解芘中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:降解時的溫度為25°C，pH為6.0，初始接種量為lwt%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:降解時加入菲進行共降解。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:降解芘污染土壤中時，土壤里種植南瓜和添加葡萄糖。`
【文檔編號】C12R1/025GK103555606SQ201310283838
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月29日
【發(fā)明者】秦華, 白建峰, 徐秋芳, 李永春 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)