適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片及探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片及探針。它解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)準(zhǔn)確率較低等技術(shù)問題。適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的一組探針，該組探針包括序列表中SEQ?ID?NO：1-SEQ?ID?NO：24所示的核苷酸序列。一組適用于基因芯片方式普查結(jié)腸癌的核心基因探針，其特征在于，它包括序列表中SEQ?ID?NO：1-SEQ?ID?NO：24所示的核苷酸序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1、早期診斷結(jié)腸癌變成可能，癌癥患者的存活率大大的提高。2、芯片技術(shù)的推廣使結(jié)腸癌的普查從臨床體檢的水平走向分子診斷的水平，普查水平和質(zhì)量大大提高。3、芯片分子診斷技術(shù)在結(jié)腸癌的推廣使癌癥的普查從被動(dòng)普查變成主動(dòng)預(yù)測(cè)和早期治療。
【專利說明】適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片及探針
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因芯片，尤其是涉及一種適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片及探針。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)腸癌是指結(jié)腸粘膜上皮在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡性病變，是常見的惡性腫瘤之一。結(jié)腸癌起病隱匿，早期常無(wú)明顯的臨床表現(xiàn)，病情發(fā)展較慢，出現(xiàn)明顯的癥狀時(shí)大多已到了中晚期，死亡率僅次于肺癌和肝癌，占我國(guó)惡性腫瘤第三位。到2020年前，全球癌癥發(fā)病率將增加50%，即每年將新增1500萬(wàn)癌癥患者，且20%的新發(fā)癌癥患者在中國(guó)。全球20%的新發(fā)癌癥病人在中國(guó)，24%的癌癥死亡病人在中國(guó)。目前我國(guó)每死亡5人，即有I人死于癌癥；而在O~64歲人口中，每死亡4人，即有I人死于癌癥。我國(guó)近20年來癌癥發(fā)病率、死亡率及年輕化呈現(xiàn)“三線”走高的趨勢(shì)，每分鐘就有6人確診為癌癥。數(shù)據(jù)顯示，除了基因遺傳之外，環(huán)境污染、生活壓力大、不良飲食習(xí)慣等生活細(xì)節(jié)，成為癌癥發(fā)病的重要誘因。 [0003]結(jié)腸癌亦是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，隨著我國(guó)人民生活水平的提高和飲食等生活方式的轉(zhuǎn)變，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，年遞增4.71 %，遠(yuǎn)超2 %的國(guó)際水平，從1982年的7/10萬(wàn)升至目前的30.7/10萬(wàn)，局部地區(qū)甚至超過發(fā)達(dá)國(guó)家的水平。大規(guī)模人群普查資料表明，35歲以上的人群中，結(jié)直腸癌的發(fā)病率約為24~32/10萬(wàn)，早期結(jié)直腸癌根治術(shù)后，患者5年存活率可達(dá)90%以上，而晚期癌5年存活率不足10%。根據(jù)美國(guó)近30年的統(tǒng)計(jì)，20世紀(jì)70年代的結(jié)直腸癌死亡率為28/10萬(wàn)，2000年為20/10萬(wàn)，下降了29%,其主要原因?yàn)榻?、三十年來美?guó)大力開展無(wú)癥狀人群普查，檢出了大量“早期癌”并對(duì)癌前病變進(jìn)行干預(yù)治療?？梢?，早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌對(duì)于治愈有很重要的意義。
[0004]結(jié)腸癌的特點(diǎn)是癌變呈漸進(jìn)性并且與年齡密切相關(guān)，一般在40-70歲之間高發(fā)，癌變間期長(zhǎng)達(dá)10-20年，這樣漫長(zhǎng)的發(fā)病周期給了我們?cè)缙诎l(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的良好機(jī)會(huì)，目前臨床上常用的結(jié)腸癌的普查方法主要是結(jié)腸鏡檢查，糞便潛血檢查及糞便DNA基因檢查結(jié)合受檢者的臨床癥狀，例如長(zhǎng)期性的腹痛，便秘和便血等等。但是這些檢查方法的缺點(diǎn)是只能檢查出中晚期的結(jié)腸癌，此外檢查的通量有限，目前不太適合大規(guī)模的檢查。
[0005]隨著人類基因組計(jì)劃的完成，個(gè)體化基因組學(xué)在臨床上的應(yīng)用深入，以基因技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷方法開始在癌癥診斷特別是早期診斷方面開始進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用，目前已開展結(jié)腸癌分子診斷的主要技術(shù)有:以檢測(cè)結(jié)腸癌基因突變?yōu)槟康牡幕驕y(cè)序技術(shù)；以PCR技術(shù)為主的癌變基因試劑盒檢測(cè)癌胚抗原，APC基因和P53基因等等；結(jié)腸癌腫瘤組織標(biāo)志物等等。
[0006]目前看來，上述各種檢測(cè)的靈敏度都不夠理想，主要是檢測(cè)的靈敏度不夠高，或檢測(cè)的基因數(shù)目比較少?；蛐酒瑱z測(cè)技術(shù)依然是目前較理想的檢測(cè)手段，高通量，快速和可控制的成本?；蛐酒?genechip)也叫DNA芯片、DNA微陣列(DNA microarray),是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的技術(shù)，其主要原理是:在玻片等固相載體上以微點(diǎn)陣的形式固定各種基因探針，組成二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，對(duì)每一個(gè)探針上的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，從而應(yīng)用核酸雜交的原理來檢測(cè)待檢樣品中的目的基因。該方法具有操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，高通量等特點(diǎn)，檢測(cè)靶分子種類多、效率高、結(jié)果客觀性強(qiáng)，基因芯片技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速，高通量地進(jìn)行檢測(cè)和醫(yī)學(xué)診斷。
[0007]但是，現(xiàn)有的基因芯片特別是用于腫瘤分子診斷的芯片都存在兩個(gè)明顯的設(shè)計(jì)缺顯，第一，很多科技公司要么在一張芯片上羅列了幾百甚至上千個(gè)基因，這樣不僅制作基因芯片成本高，而且在檢測(cè)過程中容易造成成本過高，分析時(shí)造成較高的假陽(yáng)性率，使基因芯片的方法在臨床腫瘤的檢測(cè)中的推廣打了很大的折扣；第二，所檢測(cè)的基因選擇不合理，使檢測(cè)癌癥的靈敏度達(dá)不到臨床要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問題，提供一種檢測(cè)準(zhǔn)確率高的適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片。
[0009]本發(fā)明的另一目的是針對(duì)上述問題，提供一種檢測(cè)準(zhǔn)確率高的一組適用于基因芯片方式普查結(jié)腸癌的核心基因探針。
[0010]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案:本適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的一組探針，其特征在于，該組探針包括序列表中SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。
[0011]上述的適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片中，如SEQ ID NO =1-SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列包括12個(gè) 結(jié)腸癌檢測(cè)基因，12個(gè)結(jié)腸癌檢測(cè)基因探針序列如下:APC探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO =1-SEQ ID NO:2所述；P53探針序列包括兩條，分別如SEQID NO:3-SEQ ID N0:4 所述;K_ras 探針序列包括兩條，分別如 SEQ ID NO:5_SEQ ID NO:6所述；PI3CA探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8所述；MLHl探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10所述;P0LE探針序列包括兩條，分別如SEQ IDNO:11-SEQ ID NO:12 所述；SMAD4 探針序列包括兩條，分別如 SEQ ID NO:13_SEQ ID NO:14所述；ARID1A探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:15_SEQ ID NO:16所述；FAM123B探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:17-SEQ ID NO: 18所述；β-Catenin探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:20所述；S0X9探針序列包括兩條，分別如SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:22 所述；TCF7L1 探針序列包括兩條，分別如 SEQ ID NO:23_SEQ ID NO:24所述。
[0012]在上述的適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片中，該組探針還包括序列表中SEQ IDNO:25-SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列。
[0013]在上述的適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片中，如SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:36所不的核昔酸序列包括8個(gè)看家基因,8個(gè)看家基因探針序列如下:18SRNA探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:26所述；ACTB探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:27-SEQ ID N0:28所述;GAPDH探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:29_SEQ ID NO:30所述；HPRT1探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:32所述；B2M探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:34所述；RPL27探針序列包括兩條，分別如SEQID NO:35-SEQ ID NO:36 所述。
[0014]在上述的適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片中，所述的固相載體上具有24列乘16行微陣列,其中1-6行中每一行的1-24列為序列表中SEQ ID NO:1-SEQ ID N0:24所示的核苷酸序列的排列；15_16行中每一行的1-24列為序列表中SEQ ID NO:25_SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列的重復(fù)排列；上述24列乘16行微陣列中1-12行為所檢的6個(gè)樣本的排列，13-14行為正常對(duì)照的所檢樣本，15-16行為看家基因?qū)φ盏臉颖尽?br> [0015]在上述的適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片中，所述的固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯或載玻片中的任意一種。
[0016]一組適用于基因芯片方式普查結(jié)腸癌的核心基因探針，其特征在于，它包括序列表中SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。
[0017]與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:1、早期診斷結(jié)腸癌變成可能，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)的可疑授檢者進(jìn)行跟蹤、隨訪，定期做身體檢查；癌癥患者的存活率大大的提聞。2、芯片技術(shù)的推廣使結(jié)腸癌的普查從臨床體檢的水平走向分子診斷的水平，普查水平和質(zhì)量大大提高。3、芯片分子診斷技術(shù)在結(jié)腸癌的推廣使癌癥的普查從被動(dòng)普查變成主動(dòng)預(yù)測(cè)和早期治療，極大的節(jié)省醫(yī)藥成本。4、采用基因芯片檢測(cè)基技術(shù)能夠幫助醫(yī)生更加透徹的了解癌變的分子機(jī)理，對(duì)合理有效的治療有極大的指導(dǎo)意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明提供的微陣列結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]如圖1所示，本適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片包括固相載體和固定在固相載體上的一組探針，其特征在于，該組探針包括序列表中SEQ ID NO =1-SEQ ID N0:24所示的核苷酸序列。如SEQ ID NO =1-SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列包括12個(gè)結(jié)腸癌檢測(cè)基因，12個(gè)結(jié)腸癌檢測(cè)基因探針序列如下:APC探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO=1-SEQID NO:2所述；P53探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所述；K_ras探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6所述；PI3CA探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8所述；MLHl探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:9_SEQ IDNO:10所述;P0LE探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:11-SEQ ID NO: 12所述；SMAD4探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:13-SEQ ID NO: 14所述；ARIDlA探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:15-SEQ ID NO: 16所述；FAM123B探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:18 所述；β-Catenin 探針序列包括兩條，分別如 SEQ ID NO:19_SEQ ID NO:20所述；S0X9探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:22所述；TCF7L1探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:24所述。
[0020]該組探針還包括序列表中SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列。如SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列包括8個(gè)看家基因，8個(gè)看家基因探針序列如下:18SRNA探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:26所述；ACTB探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:27-SEQ ID NO:28所述；GAPDH探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:29-SEQ ID NO:30 所述；HPRTl 探針序列包括兩條，分別如 SEQ ID NO:31-SEQID NO:32所述；B2M探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:34所述；RPL27探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:35-SEQ ID NO:36所述。
[0021]固相載體上具有24列乘16行微陣列，其中1-6行中每一行的1_24列為序列表中SEQ ID NO =1-SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列的排列；15-16行中每一行的1_24列為序列表中SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列的重復(fù)排列；上述24列乘16行微陣列中1-12行為所檢的6個(gè)樣本的排列，13-14行為正常對(duì)照的所檢樣本,15-16行為看家基因?qū)φ盏臉颖?。固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯或載玻片中的任意一種。
[0022]本發(fā)明中每個(gè)基因的芯片探針包含可以引導(dǎo)所檢測(cè)的基因進(jìn)行擴(kuò)增的一對(duì)核苷酸引物，引物長(zhǎng)度不超過30個(gè)堿基，所引導(dǎo)擴(kuò)增的產(chǎn)物一般不超過130個(gè)核苷酸，以利于核酸擴(kuò)增的效果，每對(duì)引物都進(jìn)行了優(yōu)化組合，其CG含量合理，不會(huì)出現(xiàn)引物二聚體的現(xiàn)象。每一個(gè)要檢測(cè)的基因都有4個(gè)重復(fù)檢測(cè)位點(diǎn)，以獲得至少3-4次的基因擴(kuò)增結(jié)果，取3次最為接近的擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算其Ct值，然后對(duì)比正常與受檢者的基因表達(dá)差異，實(shí)現(xiàn)腫瘤核心基因表達(dá)狀況風(fēng)險(xiǎn)和發(fā)病可能性的評(píng)估，同時(shí)結(jié)合其他檢測(cè)結(jié)果做出最終診斷。
[0023]一組適用于基因芯片方式普查結(jié)腸癌的核心基因探針，其特征在于，它包括序列表中SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。
[0024]本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到人類腫瘤的發(fā)生是有腫瘤遺傳基因(10-15%)和后天發(fā)生的體細(xì)胞突變基因(85-90%)，腫瘤的基因主要是腫瘤的140個(gè)核心驅(qū)動(dòng)基因(driver genes)和上千個(gè)隨客基因(passenger genes),他們主要介導(dǎo)12個(gè)主要的腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)的特殊微環(huán)境的特點(diǎn)，結(jié)合發(fā)明人在長(zhǎng)期大量芯片科研應(yīng)用中的經(jīng)驗(yàn)發(fā)明設(shè)計(jì)了選擇關(guān)鍵的核心腫瘤基因做為結(jié)腸癌的全新基因芯片的方法和設(shè)計(jì)方法。本發(fā)明包括檢測(cè)導(dǎo)致結(jié)腸癌基因突 變頻率最高的12個(gè)基因(60-90%)，在一張384微孔板的面積上能夠同時(shí)檢測(cè)6份病人的標(biāo)本，每份標(biāo)本的每個(gè)基因包括4個(gè)重復(fù)檢測(cè)點(diǎn)，同時(shí)比較正常人和受檢者的基因表達(dá)差異特征，最后通過比較統(tǒng)計(jì)分析P值的顯著差異來推算出腫瘤特別是早期結(jié)腸癌的發(fā)生概率，為結(jié)腸癌的分子檢測(cè)提供了高敏感高通量的方法。
[0025]12個(gè)結(jié)腸癌檢測(cè)基因如下:
[0026]APC 基因 MM:611731 ;
[0027]P53 基因 MM: 191170 ;
[0028]K-ras 基因 MM: 190070 ；
[0029]PI3CA 基因 MM: 171834 ;
[0030]MLHl 基因 MM: 120436 ；
[0031]POLE 基因 MM: 174762 ;
[0032]SMAD4 基因 MM: 600993 ；
[0033]ARIDlA 基因 MM: 603024 ；
[0034]FAM123B 基因 MM: 300647 ；
[0035]β -Catenin 基因 MM: 607758 ；
[0036]S0X9 基因 MM: 608160 ；
[0037]TCF7L1 基因 MM: 604652。
[0038]6個(gè)看家基因如下:
[0039]18SRNA 基因 MM: 359724 ；[0040]ACTB 基因 MM: 102630 ；
[0041]GAPDH MIM:138400 ；
[0042]HPRTI 基因 MM:308000;
[0043]B2M 基因 MM: 109700 ；
[0044]RPL27 基因 MM: 607526。
[0045]表1:本發(fā)明中結(jié)腸癌檢測(cè)基因檢測(cè)核酸擴(kuò)增的序列列表:
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的一組探針，其特征在于，該組探針包括序列表中SEQ ID NO=1-SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片，其特征在于，如SEQIDNO=1-SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列包括12個(gè)結(jié)腸癌檢測(cè)基因，12個(gè)結(jié)腸癌檢測(cè)基因探針序列如下=APC探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO =1-SEQ ID NO:2所述；P53探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所述；K_ras探針序列包括兩條,分別如SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6 所述；PI3CA 探針序列包括兩條，分別如 SEQ ID NO:7_SEQ IDNO:8所述；MLHl探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10所述；POLE探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO =Il-SEQ ID NO: 12所述；SMAD4探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14 所述；ARIDlA 探針序列包括兩條，分別如 SEQ ID NO:15_SEQID NO:16所述；FAM123B探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:17_SEQ ID NO:18所述；β-Catenin探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:20所述；S0X9探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:22所述；TCF7L1探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:24 所述。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片，其特征在于，該組探針還包括序列表中SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片，其特征在于，如SEQIDNO:25-SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列包括8個(gè)看家基因，8個(gè)看家基因探針序列如下:18SRNA探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:26所述；ACTB探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:27-SEQ ID NO:28所述;GAPDH探針序列包括兩條，分別如SEQ IDNO:29-SEQ ID NO:30 所述；HPRTI 探針序列包括兩條，分別如 SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:32所述；B2M探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:33_SEQ ID NO:34所述；RPL27探針序列包括兩條，分別如SEQ ID NO:35-SEQ ID NO:36所述。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片，其特征在于，所述的固相載體上具有24列乘16行微陣列，其中1-6行中每一行的1-24列為序列表中SEQ IDNO =1-SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列的排列；15_16行中每一行的1_24列為序列表中SEQID NO:25-SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列的重復(fù)排列；上述24列乘16行微陣列中1_12行為所檢的6個(gè)樣本的排列，13-14行為正常對(duì)照的所檢樣本，15-16行為看家基因?qū)φ盏臉颖尽?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的適用于結(jié)腸癌普查的核心基因芯片，其特征在于，所述的固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯或載玻片中的任意一種。
7.—組適用于基因芯片方式普查結(jié)腸癌的核心基因探針，其特征在于，它包括序列表中SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103834722SQ201310245299
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2013年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月19日
【發(fā)明者】楊海濤 申請(qǐng)人:惠州市第二婦幼保健院