一種α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶及表達(dá)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。用于重組表達(dá)該α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus?niger）Ac4，其保藏編號(hào)為CGMCC?No.7417。本發(fā)明所得到的重組菌種能夠表達(dá)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表達(dá)的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶活力。同時(shí)，所得重組α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，擴(kuò)大了α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的應(yīng)用領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】一種Ct轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶及表達(dá)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的菌株

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶篩選和重組表達(dá)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種種來(lái)源于棒曲霉 (Aspergillus clavatus)的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，以及該α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶在絲狀真菌宿 主細(xì)胞中的異源表達(dá)。

【背景技術(shù)】
[0002] α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶（a -transglucosidase Ε. C. 2. 4. 1. 24)能夠從低聚糖類底物 的非還原性末端切開(kāi)α-1、4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基以α_1、6糖 苷鍵轉(zhuǎn)移到另一個(gè)糖類底物上，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖（簡(jiǎn)稱頂〇,主要包括異 麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等）、糖脂或糖肽等。該酶既具有水解能力，又可以專一地進(jìn)行葡 萄糖苷鍵的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，是生產(chǎn)低聚異麥芽糖的必需酶制劑之一。
[0003] α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶在自然界中分布廣泛，種類繁多，性質(zhì)各異，幾乎存在于所有生 物體內(nèi)，在人類的糖原降解及動(dòng)物、植物和微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能。α 轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶主要應(yīng)用于生產(chǎn)頂〇,而頂〇是人類腸道有益菌群雙歧桿菌的增殖因子，攝 入后不被人體消化吸收，也不易被大腸中的多數(shù)腐敗細(xì)菌所利用，卻能作為雙歧桿菌的碳 源而被利用。因此作為一種功能性食品原料，頂〇已被廣泛用在各種食品的制造，居各種功 能性低聚糖之首。
[0004] 目前工業(yè)上已經(jīng)有以淀粉或麥芽糖為原料，通過(guò)酶法生產(chǎn)低聚異麥芽糖的工藝， 但是已有的生產(chǎn)工藝轉(zhuǎn)化率并不高。此外，雖然我國(guó)異麥芽糖產(chǎn)量很高，α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷 酶的用量很大，但是沒(méi)有工業(yè)化生產(chǎn)，該酶仍然依賴進(jìn)口。因此，本領(lǐng)域亟需獲得高純度的 轉(zhuǎn)化活性較高的低聚異麥芽糖，提高生產(chǎn)工藝的轉(zhuǎn)化效率；也亟需獲得相應(yīng)的高活性的α 轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶及其相應(yīng)的生產(chǎn)菌株。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶及表達(dá)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的菌株， 從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明一個(gè)方面提供一種α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列為SEQ ID Ν0:1。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用于編碼上述α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序 列為 SEQ ID Ν0:2。
[0008] 本發(fā)明的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，是從棒曲霉（Aspergillus clavatus)中擴(kuò)增出的。
[0009] 本發(fā)明還提供用于表達(dá)上述α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的曲霉菌株；
[0010] 一種表達(dá)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus niger)Ac4,已于2013年4月 7日保存于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，菌株編號(hào)為CGMCC No. 7417。
[0011] 本發(fā)明的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶和重組黑曲霉菌株用于生產(chǎn)低聚異麥芽糖。
[0012] 本發(fā)明所得到的重組菌種能夠高效的表達(dá)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，且其酶活力大大 高于其在野生菌中的酶活，也高于宿主菌黑曲霉自身表達(dá)的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶活力。 同時(shí)，所得重組的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶是由食品安全菌（GRAS)黑曲霉分泌所得，擴(kuò)大了 α轉(zhuǎn) 移葡萄糖苷酶的應(yīng)用領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1 :本發(fā)明所構(gòu)建的pGm-Ac4的質(zhì)粒圖譜；
[0014] 圖2 :本發(fā)明重組菌株的代謝產(chǎn)物的蛋白SDS-PAGE凝膠圖，顯示了黑曲霉轉(zhuǎn)化子 Ac4的表達(dá)情況，以及野生菌和宿主菌黑曲霉G1的蛋白表達(dá)情況，其中泳道1所示為蛋白標(biāo) 準(zhǔn)分子量標(biāo)記，由上至下為116. 0kD，66. 2kD，45. 0kD，35. 0kD，25. OkD和18. 4kD ;泳道2所 示為黑曲霉宿主G1在發(fā)酵5d后的蛋白表達(dá)情況；泳道3所示為Ac4的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶 表達(dá)情況，在109kDa處可以看到清晰蛋白條帶；泳道4所示為野生菌的蛋白表達(dá)情況，其無(wú) 可檢測(cè)到的蛋白表達(dá)。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明用到了在遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法。例 如 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel, 2003)等參考書(shū)中所記載的技術(shù)。但是，這并 不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 可以選用已公開(kāi)的技術(shù)來(lái)實(shí)施本發(fā)明實(shí)施例中記載的方案。
[0016] 本發(fā)明中，核酸是按Y至:V方向從左至右書(shū)寫(xiě)；氨基酸是按氨基至羧基的方向 從左至右書(shū)寫(xiě)。
[0017] 對(duì)于本發(fā)明中所涉及到各個(gè)名詞，其具體的定義如下：
[0018] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"麥芽糖"指一種碳水化合物，是淀粉、糖原、糊精等大分子多糖 類物質(zhì)在β淀粉酶催化下的主要水解產(chǎn)物。該術(shù)語(yǔ)是由兩個(gè)D-葡萄糖分子以α-1，4-糖 苷鍵連接構(gòu)成的二糖，分子式為C 12H220n · Η20。
[0019] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"低聚異麥芽糖"和"異麥芽低聚糖"可互換使用，都指選自下組 的一種或多種糖：異麥芽糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖、或潘糖。
[0020] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶"又稱為α-D-葡萄糖苷水解酶，能切開(kāi)麥 芽糖和麥芽低聚糖分子結(jié)構(gòu)中α -1，4糖苷鍵，并能將游離出來(lái)的一個(gè)葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到 另一個(gè)葡萄糖分子或麥芽糖或麥芽三糖等分子中的α -1，6位上，其轉(zhuǎn)糖苷作用可將低聚 糖中的α-1，4糖苷鍵轉(zhuǎn)化成α-1，6糖苷鍵或其他形式的鏈接，從而得到非發(fā)酵性的低聚 異麥芽糖或糖酯、糖肽等。
[0021] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"基因"指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的 區(qū)域，以及各編碼片段（外顯子）之間的插入序列（內(nèi)含子）。
[0022] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"核酸"包括DNA、RNA，單鏈或雙鏈的，以及它們的化學(xué)修飾物。
[0023] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"核酸"和"多核苷酸"在本文中可以互換使用。
[0024] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"宿主菌株"或"宿主細(xì)胞"是指表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適 宿主，所述表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物包含本發(fā)明的編碼α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的多核苷酸。具體 而言，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是野生型絲狀真菌宿主細(xì)胞或者 經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"宿主菌株"或"宿主細(xì)胞"指由絲狀真菌菌株細(xì)胞所產(chǎn)生的 細(xì)胞核原生質(zhì)體。
[0025] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"絲狀真菌"指所有絲狀形式的真菌亞門生物（參見(jiàn) INTRODUCTORY MYCOLOGY, 4th Ed. (Alexopoulos，2007)和 AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OF THE FUNGI, 10th Ed. (Kirk et al.，2008))。這些真菌的特征是帶有由 幾丁質(zhì)、纖維素和其他復(fù)雜多糖組成的細(xì)胞壁的營(yíng)養(yǎng)菌絲體。本發(fā)明所述的絲狀真菌在 形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)上不同于酵母。絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲的延伸來(lái)完成 的，碳代謝是專性需氧的。在本發(fā)明中，絲狀真菌親代細(xì)胞可以使，但不限于，曲霉屬某 種（Aspergillus sp.)(例如棒曲霉（A. clavatus)、煙曲霉（A. fumigatus)、泡盛曲霉 (A. awamori)、黃曲霉（A. flavus)，土曲霉（A. terreus)和米曲霉（A. oryzae))、青霉屬某 種（Penicillium sp.)(例如產(chǎn)黃青霉（P.chrysogenum))、新薩托菌屬某種（Neosartorya sp.)(例如費(fèi)希新薩托菌（N.fischeri))、粘帚霉菌屬某種（Gliocladium sp.)(例如粉 紅粘帚霉（G.roseum))、木霉屬某種（Trichoderma sp.)(例如里氏木霉（T.reesei)、綠 色木霉（T. viride)、康寧木霉（T. koningii)、哈茨木霉（T. harzianum))、腐質(zhì)霉屬某種 (Humicola sp.)(例如特異腐質(zhì)霉（H. insolens)和灰腐質(zhì)霉（H. grisea))、金孢霉屬某種 (Chrysosporium sp·)、鐮刀菌屬某種（Fusarium sp·)、脈孢霉屬某種（Neurospora sp·)、 肉座菌屬某種（Hypocrea sp.)和裸孢殼屬某種（Emericella sp.)的細(xì)胞。
[0026] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"曲霉"或"曲霉屬某種"指以前或目前被分類為曲霉屬的任何 真菌屬。
[0027] 用于將編碼α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的多核苷酸插入表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域熟知 的。一般是通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行酶切和連接反應(yīng)來(lái)完成的。在一些實(shí)施方式中， 所用的限制性酶切位點(diǎn)是SnaBI和Xbal。在其他實(shí)施方式中，所用的限制性酶切位點(diǎn)是 SnaBI〇
[0028] 酶表達(dá)的分析和酶活力的測(cè)定：
[0029] 為了評(píng)價(jià)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的表達(dá)，可以在蛋白水平或核酸水平進(jìn)行分析?？梢?應(yīng)用的分析方法包括Northern印跡、斑點(diǎn)印跡（DNA或RNA分析）、Southern印跡、放射自 顯影、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）和含有適當(dāng)標(biāo)記的探針（基于核酸編碼序列）進(jìn) 行的原位雜交。此外，基因表達(dá)可以通過(guò)免疫學(xué)方法，諸如細(xì)胞、組織切片的免疫組織化學(xué) 染色或者組織培養(yǎng)基的免疫試驗(yàn)。例如通過(guò)Western印跡或ELISA來(lái)評(píng)估。這樣的免疫試 驗(yàn)可以用于定性地和定量地評(píng)價(jià)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的表達(dá)。此類方法的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的，并且用于實(shí)施此類方法的許多試劑是可商業(yè)獲得的。在一些實(shí)施方式中，α 轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的表達(dá)通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。
[0030] α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的活性測(cè)定采用HPLC方法，既可以使用淀粉為原料，也可以使 用麥芽糖為原料，根據(jù)生成的異麥芽糖、潘塘等低聚糖的量來(lái)判定酶活高低。一種優(yōu)選的測(cè) 定方法包括：以淀粉為原料（濃度10%?40%)，經(jīng)高溫α淀粉酶（〇. 05%?0. 5%)在90°C? 115°C液化到DE10?20,煮沸5分鐘?15分鐘滅酶，冷卻到60°C，調(diào)pH到4?7,加普魯蘭 酶（0· 05% ?0· 5%)、α 真菌淀粉酶（〇· 05% ?0· 5%)和 Maltogenase (0· 05% ?0· 5%)，然后 加入α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶（〇. 05%?0. 5%)進(jìn)行保溫轉(zhuǎn)化（溫度30°C?60°C ;時(shí)間24?72 小時(shí)），從而獲得高含量的低聚異麥芽糖漿，對(duì)所得糖漿進(jìn)行HPLC分析。另一種優(yōu)選的測(cè)定 方法包括：以麥芽糖（濃度10%?40%)為底物，加入α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶（ο. 05%?0. 5%)， 然后進(jìn)行保溫轉(zhuǎn)化（溫度30°C?60°C ;時(shí)間24?72小時(shí)），獲得高含量的低聚異麥芽糖 漿，對(duì)所得糖漿進(jìn)行HPLC分析。在一些實(shí)施方式中，α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的活性選用麥芽糖 作為底物進(jìn)行測(cè)定。
[0031] 本文所述的具體實(shí)施例，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本 發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等 人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。在本發(fā)明中，百分比為重量百分比，除非特別說(shuō) 明。
[0032] 實(shí)施例1 : α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶基因 Ac4的分離
[0033] 按照制造商的說(shuō)明書(shū)，使用真菌基因組DNA提取試劑盒（Omega)從棒曲霉 (Aspergillus clavatus)過(guò)夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。然后
[0034] 根據(jù)NCBI上的編號(hào)為XM_001271890的序列設(shè)計(jì)PCR引物，用于克隆棒曲霉中的 Ac4基因的正向引物Ac4-F序列如下：
[0035] 5' -CCATTACGTAATGGCCAGTCTCGTAGGCCTTCTTGCCAGT(下劃線所示序列為 SnaBI 酶 切位點(diǎn)），
[0036] 反向引物Ac4_R序列如下：
[0037] 5' -CCATTACGTATTACCACTTCAGAATCCAATCCTCAG(下劃線所示序列為 SnaBI 酶切位 點(diǎn)）。
[0038] 將該基因用Phusion DNA聚合酶（Thermo scientific)從棒曲霉基因組DNA中擴(kuò) 增出來(lái)。
[0039] 擴(kuò)增條件：
[0040] 第一步：98°C 保持 3min。
[0041] 第二步：98°C保持10s，然后72°C保持75s，此步驟重復(fù)30次。
[0042] 第三步：72°C 保持 10min。
[0043] 使用凝膠純化試劑盒（Fermentas)將上述PCR產(chǎn)物純化。用限制性內(nèi)切酶 SnaBI (Fermentas)對(duì)純化了的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶SnaBI對(duì)質(zhì)粒pGm 進(jìn)行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化，并用T4DNA連接酶（Fermentas)將上述 兩個(gè)酶切產(chǎn)物連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans5a大腸桿菌（Transgen)，用氨節(jié)青霉素進(jìn)行 選擇，最終篩選出了目的質(zhì)粒。為確保準(zhǔn)確，對(duì)若干克隆進(jìn)行測(cè)序（Invitrogen)。
[0044] 按照制造商的說(shuō)明書(shū)，使用質(zhì)粒中量制備試劑盒（Axygen)從測(cè)序結(jié)果正確的大 腸桿菌克隆中純化質(zhì)粒。所得質(zhì)粒為pGm-Ac4 (圖1)，測(cè)得的核苷酸序列為SEQ ID N0:2， 其翻譯的氨基酸(蛋白）序列為SEQ ID NO :1。序列比對(duì)結(jié)果表明其是一個(gè)新的等位基因， 去掉內(nèi)含子的直接編碼的核苷酸序列為SEQ ID N0 :3。
[0045] 實(shí)施例2 :PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化黑曲霉
[0046] 吸取黑曲霉G1孢子懸浮液于CMA平板中心（9cm培養(yǎng)皿），待菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng) 皿，切1/4大小的培養(yǎng)基于200mL CMA液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm的條件培養(yǎng)14?16h。
[0047] 用無(wú)菌Miracloth濾布收集菌絲體，并用溶液A清洗一次，在無(wú)菌條件下將清洗過(guò) 的菌絲體轉(zhuǎn)移到40mL原生質(zhì)體化溶液，在30°C、200rpm的條件下溫浴1?2h，用顯微鏡觀 察檢測(cè)原生質(zhì)體化進(jìn)展。
[0048] 用無(wú)菌Miracloth濾布過(guò)濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質(zhì)體溶液。將原生 質(zhì)體溶液分裝于兩個(gè)50mL無(wú)菌的一次性離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45mL， 在4000rpm條件下離心8min以獲得沉淀并棄去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀兩次。 將沉淀重懸浮于10mL溶液B中，并用血球計(jì)數(shù)板對(duì)原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。將原生質(zhì)體再次離心 并棄去上清液，根據(jù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質(zhì)體數(shù)目在 lX10 7f/mL。
[0049] 在冰上，將100 μ L上述原生質(zhì)體溶液加入預(yù)冷的無(wú)菌15mL離心管中，每個(gè)轉(zhuǎn)化反 應(yīng)用1管。加入10 μ g DNA。加入12. 5 μ L溶液C，溫和混勻后再冰上放置20min。
[0050] 將麗SA頂層瓊脂試管熔化并保持在55°C。從冰中移出上述15mL離心管，并向管 中加入lmL溶液C和2mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質(zhì)體混合物。向3個(gè) 頂層瓊脂試管中的每一個(gè)中加入lmL上述原生質(zhì)體混合物，并立即傾倒與MMSA平板上，并 將平板在30°C下培養(yǎng)7?10d。
[0051] 溶液 A :2. 5mLlM Κ2ΗΡ04,2· 5mLlM ΚΗ2Ρ04,48· 156g MgS04,加入 dlH20 至終體積 500mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0052] 溶液 B :5mLlM Tris (pH7. 5)，2. 77g CaCl2,109. 32g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積 500mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0053] 溶液 C :250g PEG4000,2. 77g CaCl2,5mLlM Tris(pH7. 5)，加入 dlH20 至終體積 500mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0054] 原生質(zhì)體化溶液：將0· 6g裂解酶（Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum, Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0055] MMSA 平板：0· 59g 乙酰胺（Sigma)，3. 4g CsCl (Sigma)，0· 52g KC1，1. 52gKH2P04， 218. 5g山梨醇，lml痕量元素（見(jiàn)下），20g瓊脂，加入dlH20至終體積972. 5mL，高壓蒸汽滅 菌后加入用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌的25mL40%葡萄糖和2. 5mL20%MgS04。
[0056] MMSA 頂層瓊脂試管：0· 59g 乙酰胺（Sigma)，3. 4g CsCl (Sigma)，0· 52g KC1，1. 52g KH2P04, 218. 5g山梨醇，lml痕量元素，lOg低熔點(diǎn)瓊脂糖，加入dlH20至終體積972. 5mL，高 壓蒸汽滅菌后，在培養(yǎng)基未凝固時(shí)，加入用〇. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌的25mL40%葡萄糖 和2. 5mL20%MgS04，之后立即分裝于無(wú)菌試管中，每管10mL。
[0057] 痕量元素：在 250mL dlH20 中加入 lg FeS04 · 7Η20,8· 8g ZnS04 · 7Η20,0· 4g CuS04 · 5H20,0· 15g MnS04 · 4H20,0· lg Na2B407 · 10H20, 50mg (NH4) 6M〇7024 · 4H20,0· 2mL 濃 HC1， 完全溶解后用dlH20定容至1L，用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0058] CMA平板：20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，lg蛋白胨，15g瓊脂，加入dlH20至終體積 lOOOmL，高壓蒸氣滅菌。
[0059] CMA液體培養(yǎng)基：20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，lg蛋白胨，加入dlH20至終體積 lOOOmL，高壓蒸氣滅菌。
[0060] 待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑選25個(gè)菌落，按照制造商的說(shuō)明書(shū)，使用真菌基因組DNA 提取試劑盒（Omega)從其過(guò)夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。按實(shí)施例1所述實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)Ac4 的黑曲霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。所得陽(yáng)性克隆的孢子懸浮液接 種于30mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d，所得發(fā)酵液用8層紗布過(guò) 濾，濾液在14000Xg條件下離心lOmin，收集上清液。所得上清液即為酶液。將酶液在濃 度為12%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳，對(duì)在預(yù)期位置處有明顯條帶的陽(yáng)性克隆進(jìn)行HPLC分 析。根據(jù)HPLC分析圖譜，選取酶活力最高者作為Ac4轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的重組菌進(jìn)行進(jìn)一步 研究。黑曲霉（Asperillus niger)Ac4,已于2013年4月7日保存于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心（CGMCC)，菌株編號(hào)為CGMCC No. 7417。
[0061] 實(shí)施例3 : α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉重組菌株的發(fā)酵和酶的表達(dá)
[0062] 將表達(dá)Ac4 α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉轉(zhuǎn)化子的孢子懸浮液接種于30mLTSB發(fā)酵 培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d。所得發(fā)酵液用8層紗布過(guò)濾，濾液在14000 X g 條件下離心l〇min，收集上清液。所得上清液即為Ac4a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶液。將酶液在濃 度為12%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳（圖2)。
[0063] 電泳結(jié)果顯示在109kDa處可以看到明顯條帶，而野生菌沒(méi)有可見(jiàn)的蛋白條帶，宿 主菌G1有極微弱的蛋白條帶，但表達(dá)量明顯遠(yuǎn)小于重組菌的表達(dá)量。
[0064] 配制pH4. 6的醋酸-醋酸鈉緩沖液，Ac4酶液用上述緩沖液稀釋至合適的濃度。以 10%麥芽糖為底物，加入適量的Ac4酶液，然后在50°C保溫轉(zhuǎn)化24小時(shí)以上，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 低聚異麥芽糖漿。將產(chǎn)物糖漿稀釋10倍，取lml稀釋糖漿經(jīng)0. 22 μ m的一次性微孔濾膜過(guò) 濾后，進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果表明本發(fā)明的黑曲霉（Asperillus niger) Ac4可高效的代謝生 產(chǎn)低聚異麥芽糖。
[0065] 實(shí)施例4 : α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶及重組菌株的應(yīng)用
[0066] 工業(yè)生產(chǎn)低聚異麥芽糖漿。以淀粉為原料，加水制成30%粉漿，在pH值為6. 0、溫 度為90?120°C條件下，經(jīng)耐熱性α -淀粉酶液化后，在pH值為5. 0、溫度為60°C的條件 下，用β_淀粉酶、普魯蘭酶和真菌α-淀粉酶同時(shí)作用，轉(zhuǎn)化成麥芽糖后，加入重組表達(dá)的 α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶(氨基酸序列為SEQ ID NO: 1)進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)生成異麥芽糖、異麥芽三 糖、四糖及五糖等含α-1，6鍵的分支低聚糖與潘糖。加入α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶使其轉(zhuǎn)化率 明顯提高可達(dá)40%?50%以上，再經(jīng)活性炭脫色、離子交換樹(shù)脂脫鹽，濃縮到固形物為75%， 得到普通異麥芽糖漿，其中含異麥芽低聚糖為40%?50%，葡萄糖為40%，再將葡萄糖用酵母 發(fā)酵或膜過(guò)濾除去，便可得到含異麥芽低聚糖為90%的產(chǎn)品。
【權(quán)利要求】
1. 一種α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
2. 用于編碼權(quán)利要求1所述的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
3. 權(quán)利要求1所述的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶在生產(chǎn)低聚異麥芽糖中的應(yīng)用。
4. 用于重組表達(dá)權(quán)利要求1所述的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的曲霉菌株。
5. 如權(quán)利要求3所述的曲霉菌株，為黑曲霉（Asperillus niger)Ac4,其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 7417。
6. 權(quán)利要求3所述的曲霉菌株在生產(chǎn)低聚異麥芽糖中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/15GK104152422SQ201310174073
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月13日
【發(fā)明者】王華明, 訾禎禎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所