專利名稱：一種添加鋅離子調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種添加鋅離子調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，隨著全球石油資源逐漸枯竭、世界石油價格不斷上漲，全球氣候呈現(xiàn)的不斷惡化趨勢，能源問題成為當(dāng)前世界經(jīng)濟(jì)及工業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的問題，發(fā)展可替代能源刻不容緩。作為新型的生物燃料，全球?qū)τ谏锒〈嫉男枨罅恐鹉暝黾?，生物丁醇的生產(chǎn)研究也因此成為當(dāng)前可再生綠色能源開發(fā)利用的熱點(diǎn)之一。生物丁醇不僅是優(yōu)良的有機(jī)溶劑及重要的化工原料，更是一種極具潛力的新型生物燃料，被稱為第二代生物燃料。其與生物乙醇相比，具有高于乙醇的熱值及良好的燃料經(jīng)濟(jì)性，可提高汽車燃料效率和行車?yán)锍虜?shù)，丁醇的性質(zhì)更接近于烴類，與汽油的配伍性好，無需改造汽車。丁醇，又稱為正丁醇，是一種重要的化工原料和化學(xué)溶劑，在多個領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用及用途。主要用于制造鄰苯二甲酸二丁酯DBP和丙烯酸丁酯BA等脂肪族二元酸酯類及磷酸酯類，同時還可用于生產(chǎn)丁酸、丁醛、丁胺乳酸及塑料和橡膠制品等。此外，丁醇作為重要溶劑，大量用于脲醛樹脂、纖維素樹脂、醇酸樹脂和涂料等的生產(chǎn)中。丁醇還可以作為香料，主要用于制備香蕉、奶油、威士忌和干酪等型香精。亦用作萃取劑、色素稀釋劑等。綜上，丁醇具有極為廣闊的消費(fèi)市場，在全球化工及能源領(lǐng)域需求量保持持續(xù)增長，其化工合成法以石油為原料，投資大，技術(shù)設(shè)備要求高。丙酮丁醇發(fā)酵主要是指利用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum,簡稱丙丁菌)等在厭氧條件下將葡萄糖、果糖等作為發(fā)酵代謝底物，經(jīng)過復(fù)雜生物化學(xué)過程后，形成以丙酮及丁醇為主要代謝產(chǎn)物的發(fā)酵工藝。丙酮丁醇發(fā)酵是一個厭氧發(fā)酵過程，全程主要包括兩個時期，產(chǎn)酸期及產(chǎn)溶劑期。在產(chǎn)酸期，產(chǎn)生包括丁酸和乙酸在內(nèi)的有機(jī)酸，發(fā)酵液中有機(jī)酸濃度上升，PH值迅速下降，產(chǎn)酸期與細(xì)胞生長有聯(lián)系，同時產(chǎn)生H2和CO2 ;當(dāng)有機(jī)酸累積到一定濃度時，發(fā)酵進(jìn)入第二階段，稱為產(chǎn)溶劑期，溶劑產(chǎn)物包括丙酮、丁醇及乙醇(ABE)，有機(jī)酸因重吸收而導(dǎo)致濃度下降，同時也產(chǎn)生部分CO2和H2。傳統(tǒng)丙酮丁醇發(fā)酵存在一系列制約因素，主要體現(xiàn)在丁醇產(chǎn)量及產(chǎn)率較低，發(fā)酵終點(diǎn)溶劑濃度較低等問題，提升丙酮丁醇梭菌丁醇合成能力，降低發(fā)酵周期成為解決生物丁醇發(fā)酵問題的一個突破。在丙酮丁醇梭菌溶劑代謝生成途徑中，涉及關(guān)鍵調(diào)控酶丁醇脫氫酶、乙酰乙酰-CoA:乙酸/丁酸:CoA轉(zhuǎn)移酶及乙醇脫氫酶等，因此，尋找并實(shí)施工藝調(diào)控手段，作用于關(guān)鍵代謝途徑以有效提高溶劑尤其是丁醇代謝合成能力，縮短發(fā)酵周期以獲得更高生產(chǎn)速率對于生物丁醇理論研究及工業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。 鋅(Zn)是生命代謝中重要的微量金屬元素:它是多種生物酶類的重要輔基，如堿性磷酸酶、乙醇脫氫酶、氨基肽酶等。能夠參與糖類、脂類、蛋白質(zhì)合成和降解等重要的新陳代謝過程；在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和程序性凋亡以及維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及完整性等方面均起到了重要作用。已有研究表明，鋅離子添加對釀酒酵母的乙醇產(chǎn)量及乙醇耐受性有一定的提高作用，研究證實(shí)，鋅離子是乙醇脫氫酶的重要輔基，對乙醇脫氫酶的酶活性有著重要的影響。另一方面，針對丙酮丁醇梭菌代謝途徑，亦有研究表明，丙酮丁醇梭菌丁醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶一丁醇脫氫酶，鋅離子在其分離純化過程中對于酶活性保持至關(guān)重要。在目前厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的技術(shù)領(lǐng)域，尚無添加鋅離子以提高丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量、生產(chǎn)速率及轉(zhuǎn)化率的專利或文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種添加鋅離子調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，以達(dá)到提高丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量、生產(chǎn)速率和轉(zhuǎn)化率的技術(shù)效果。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:一種添加鋅離子調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，根據(jù)丙酮丁醇梭狀菌(Clostridium acetobutylicum)厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的特性,包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵。厭氧發(fā)酵時，添加鋅離子調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長因子，添加鋅離子，添加濃度為0.10 mg/L^120 mg/L。初始pH5.5，121°C滅菌15min，厭氧發(fā)酵前通AN2以除去發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧；以10% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37.5°C，攪拌轉(zhuǎn)速為150 rpm。其中，菌種活化步驟時，活化培養(yǎng)基成分包括葡萄糖、胰蛋白胨以及酵母粉，初始PH6.0,121°C滅菌15 min，過夜除氧；以5% (v/v)接種量將菌種接種于活化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37.5°C、時間20 h。其中，種子培養(yǎng)步驟時，種子培養(yǎng)基成分包括碳源、氮源和無機(jī)鹽，初始pH5.5，121°C滅菌15 min，過 夜除氧；以5% (v/v)接種量將上述活化菌液接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37.5°C、時間20 h。本發(fā)明通過添加鋅離子調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，能夠促進(jìn)菌體生長及碳源利用，極大縮短了發(fā)酵周期、提高了丁醇產(chǎn)量及產(chǎn)率、極大提高了厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的效率。該方法簡單，易于操作，極其適合厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的工藝調(diào)控，對于厭氧發(fā)酵丁醇工藝的開發(fā)及生物基丁醇的制備研究，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:菌種:丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。本發(fā)明所有實(shí)施例中的活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任何可實(shí)現(xiàn)丙酮丁醇梭菌所適用的常規(guī)培養(yǎng)基，本實(shí)施例中如下配方。活化培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨30 g/L，酵母粉10 g/L。種子培養(yǎng)基:葡萄糖70 g/L,乙酸銨3.22 g/L，酵母粉2.0 g/L, MgSO4.7H20 0.2g/L, KH2PO4 0.5 g/L, K2HPO4 0.5 g/L, FeSO4.7H20 0.01 g/L, MnSO4.7H20 0.01 g/L,生物素0.01 g/L,對氨基苯甲酸0.01 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖70 g/L,乙酸銨3.22 g/L，酵母粉2 g/L, MgSO4.7Η20 0.2 g/L, KH2PO4 0.5 g/L, K2HPO4 0.5 g/L, FeSO4.7H20 0.01 g/L, MnSO4.7H20 0.01 g/L,生物素0.01 g/L，對氨基苯甲酸 0.01 g/L，ZnSO4.7H20 0.001 g/L。
3L發(fā)酵罐培養(yǎng)時發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為1.1L?；罨囵B(yǎng)時將20 ml活化培養(yǎng)基裝于100 ml試管中，121°C滅菌15 min，冷卻后置于厭氧培養(yǎng)箱過夜除氧。將分裝凍存于甘油中的菌種接種于裝有20 ml活化培養(yǎng)基的試管中，接種后置于厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，接種量為5% (v/v)，培養(yǎng)溫度為37.5°C,活化培養(yǎng)20 h用于種子培養(yǎng)。將活化的菌種按10%(v/v)接種量接種于種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37.5°C，培養(yǎng)20 h，用于厭氧發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)接種量為10% (v/v)，培養(yǎng)溫度為37.5°C,攪拌轉(zhuǎn)速為150 rpm,初始ρΗ5.5，接種前發(fā)酵罐通入N2以除去發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧。本實(shí)施例與對照組(對照組為不添加鋅離子，其他條件與本實(shí)施例相同)的對比結(jié)果如表1.
表I添加ZnSO4.7Η20 (0.001 g/L)與對照組的發(fā)酵結(jié)果對比
權(quán)利要求
1.一種添加鋅離子調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)和厭氧發(fā)酵，其特征在于，厭氧發(fā)酵時，向厭氧發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加鋅離子；發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長因子，初始pH5.5,121°C滅菌15 min ;厭氧發(fā)酵前通入N2以除去發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧；以10% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37.5°C，攪拌轉(zhuǎn)速為150 rpm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的鋅離子添加濃度是0.10 mg/L^120mg/L.
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的菌種活化步驟如下:活化培養(yǎng)基成分包括葡萄糖、胰蛋白胨以及酵母粉，初始PH6.0,121°C滅菌15 min，過夜除氧；以5%(v/v)接種量將菌種接種于活化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37.5°C、時間20 h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)步驟如下:種子培養(yǎng)基成分包括碳源、氮源和無機(jī)鹽，初始PH5.5，121°C滅菌15 min，過夜除氧；以5% (v/v)接種量將上述活化菌液接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37.5°C、時間20 h。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)步驟如下:種子培養(yǎng)基成分包括碳源、氮源和無機(jī)鹽，初始PH5.5，121°C滅菌15 min，過夜除氧；以5% (v/v)接種量將上述活化菌液接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37.5°C、時間20 h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種添加鋅離子調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明根據(jù)丙酮丁醇梭菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的特性，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵三個環(huán)節(jié)。采用此方法能夠促進(jìn)菌體生長及碳源利用，極大縮短了發(fā)酵周期、提高了丁醇產(chǎn)量及產(chǎn)率、極大提高了厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的效率。該方法簡單，易于操作，極其適合厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的工藝調(diào)控，對于厭氧發(fā)酵丁醇工藝的開發(fā)及生物基丁醇的制備研究，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。
文檔編號C12R1/145GK103215316SQ20131012802
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月12日
發(fā)明者陳麗杰, 吳又多, 薛闖, 白鳳武 申請人:大連理工大學(xué)