α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶及其重組表達(dá)菌株的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種新型的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?1。用于重組表達(dá)該α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus?niger）At3，其保藏編號(hào)為CGMCC?No.6923。本發(fā)明所得到的重組菌種能夠表達(dá)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表達(dá)的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶活力。同時(shí)，所得重組α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，擴(kuò)大了α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的應(yīng)用領(lǐng)域。
【專(zhuān)利說(shuō)明】ct轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶及其重組表達(dá)菌株

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶分離表達(dá)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種來(lái)源于土曲霉（Aspergillus terreus)的新型的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，以及該α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶在絲狀真菌宿主細(xì)胞 (諸如黑曲霉（Aspergillus niger)中的異源表達(dá)。

【背景技術(shù)】
[0002] α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶（a-transglucosidase E. C. 2. 4. 1. 24)能夠從低聚糖類(lèi)底 物的非還原性末端切開(kāi)α-1、4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基以α-1、 6糖苷鍵轉(zhuǎn)移到另一個(gè)糖類(lèi)底物上，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖（簡(jiǎn)稱(chēng)頂0,主要 包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等）、糖脂或糖肽等。該酶既具有水解能力，又可以專(zhuān)一地 進(jìn)行葡萄糖苷鍵的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，是生產(chǎn)低聚異麥芽糖的必需酶制劑之一。
[0003] α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶在自然界中分布廣泛，種類(lèi)繁多，性質(zhì)各異，幾乎存在于所有生 物體內(nèi)，在人類(lèi)的糖原降解及動(dòng)物、植物和微生物的糖類(lèi)代謝方面具有重要的生理功能。α 轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶主要應(yīng)用于生產(chǎn)頂〇,而頂〇是人類(lèi)腸道有益菌群雙歧桿菌的增殖因子，攝 入后不被人體消化吸收，也不易被大腸中的多數(shù)腐敗細(xì)菌所利用，卻能作為雙歧桿菌的碳 源而被利用。因此作為一種功能性食品原料，頂〇已被廣泛用在各種食品的制造，居各種功 能性低聚糖之首。
[0004] 目前工業(yè)上已經(jīng)有以淀粉或麥芽糖為原料，通過(guò)酶法生產(chǎn)低聚異麥芽糖的工藝， 但是已有的生產(chǎn)工藝轉(zhuǎn)化率并不高。此外，雖然我國(guó)異麥芽糖產(chǎn)量很高，α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷 酶的用量很大，但是沒(méi)有工業(yè)化生產(chǎn)，該酶仍然依賴(lài)進(jìn)口。因此，本領(lǐng)域亟需獲得高純度的 轉(zhuǎn)化活性較高的低聚異麥芽糖，提高生產(chǎn)工藝的轉(zhuǎn)化效率；也亟需獲得相應(yīng)的高活性的α 轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶及其相應(yīng)的生產(chǎn)菌株。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶及其重組表達(dá)菌株，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有 技術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明一個(gè)方面提供一種新型的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列為SEQ ID Ν0: 1〇
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用于編碼上述α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序 列為 SEQ ID Ν0: 2。
[0008] 本發(fā)明的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，是從土曲霉中擴(kuò)增出的。
[0009] 本發(fā)明還提供用于表達(dá)上述α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的曲霉菌株；
[0010] 一種表達(dá)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus niger)At3,已于2012年11 月30日保存于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，菌株編號(hào)為CGMCC No. 6923。
[0011] 本發(fā)明的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶和重組黑曲霉菌株用于生產(chǎn)低聚異麥芽糖。
[0012] 本發(fā)明所得到的重組菌種能夠表達(dá)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其酶活力大大高于其在 野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表達(dá)的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶活力。同時(shí)，所 得重組α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，擴(kuò)大了 α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的 應(yīng)用領(lǐng)域。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1 :本發(fā)明所使用的pGm質(zhì)粒的遺傳圖譜；
[0014] 圖2 :黑曲霉（Asperillus niger) At3的發(fā)酵液蛋白SDS-PAGE凝膠圖，顯示了黑 曲霉轉(zhuǎn)化子At3的表達(dá)情況，以及野生菌和宿主菌黑曲霉G1的蛋白表達(dá)情況，其中泳道1 所示為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記，由上至下為116. 0 kD，66. 2 kD，45. 0 kD，35. 0kD，25. OkD和 18. 4kD ;泳道2所不為黑曲霉宿王G1在發(fā)酵5d后的蛋白表達(dá)情況；泳道3所不為At3的 α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶表達(dá)情況，在107kDa處可以看到清晰蛋白條帶；泳道4所示為野生菌的 蛋白表達(dá)情況。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明用到了在遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法。例如 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)等參考書(shū)中所記載的技術(shù)。但是，這 并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員可以選用已公開(kāi)的技術(shù)來(lái)實(shí)施本發(fā)明實(shí)施例中記載的方案。
[0016] 本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中記載的低聚異麥芽糖和異麥芽低聚糖可互換使用，都指選自下組 的一種或多種糖：異麥芽糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖、或潘糖。此外，應(yīng)理解，所述的術(shù)語(yǔ)還 包括上述糖的混合物。
[0017] 本發(fā)明所記載的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，又稱(chēng)為α-D-葡萄糖苷水解酶，能切開(kāi)麥芽 糖和麥芽低聚糖分子結(jié)構(gòu)中α -1，4糖苷鍵，并能將游離出來(lái)的一個(gè)葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另 一個(gè)葡萄糖分子或麥芽糖或麥芽三糖等分子中的α -1，6位上，其轉(zhuǎn)糖苷作用可將低聚糖 中的α-1，4糖苷鍵轉(zhuǎn)化成α-1，6糖苷鍵或其他形式的鏈接，從而得到非發(fā)酵性的低聚異 麥芽糖或糖酯、糖肽等。
[0018] 基因指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及各編碼片 段（外顯子）之間的插入序列（內(nèi)含子）。
[0019] 核酸包括DNA、RNA，單鏈或雙鏈的，以及它們的化學(xué)修飾物；核酸與多核苷酸在本 說(shuō)明書(shū)中可以互換使用。
[0020] 本發(fā)明中的酶表達(dá)的分析和酶活力的測(cè)定的方法如下：
[0021] 為了評(píng)價(jià)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的表達(dá)，可以在蛋白水平或核酸水平進(jìn)行分析?？梢?應(yīng)用的分析方法包括Northern印跡、斑點(diǎn)印跡（DNA或RNA分析）、Southern印跡、放射自 顯影、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）和含有適當(dāng)標(biāo)記的探針（基于核酸編碼序列）進(jìn) 行的原位雜交。此外，基因表達(dá)可以通過(guò)免疫學(xué)方法，諸如細(xì)胞、組織切片的免疫組織化學(xué) 染色或者組織培養(yǎng)基的免疫試驗(yàn)。例如通過(guò)Western印跡或ELISA來(lái)評(píng)估。這樣的免疫試 驗(yàn)可以用于定性地和定量地評(píng)價(jià)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶（諸如At3)的表達(dá)。此類(lèi)方法的細(xì)節(jié) 是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且用于實(shí)施此類(lèi)方法的許多試劑是可商業(yè)獲得的。在一些實(shí) 施方式中，α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶（諸如At3)的表達(dá)通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。
[0022] α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶（諸如At3)的活性測(cè)定采用HPLC方法，既可以使用淀粉為原 料，也可以使用麥芽糖為原料，根據(jù)生成的異麥芽糖、潘塘等低聚糖的量來(lái)判定酶活高低。 一種優(yōu)選的測(cè)定方法包括：以淀粉為原料（濃度1〇%~40%)，經(jīng)高溫α淀粉酶（〇. 059Γ0. 5%) 在90°C ~115°C液化到DEKT20,煮沸5分鐘?15分鐘滅酶，冷卻到60°C，調(diào)pH到4~7,加普 魯蘭酶（0. 05%?0. 5%)、α 真菌淀粉酶（〇. 〇5%?0. 5%)和 Maltogenase(0. 05%?0. 5%)，然后加 入α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶（〇· 059Γ0. 5%)進(jìn)行保溫轉(zhuǎn)化（溫度30°C?60°C ;時(shí)間24~72小時(shí)） ，從而獲得高含量的低聚異麥芽糖漿，對(duì)所得糖漿進(jìn)行HPLC分析。另一種優(yōu)選的測(cè)定方法 包括：以麥芽糖（濃度1〇%~40%)為底物，加入α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶（〇. 059Γ0. 5%)，然后進(jìn)行 保溫轉(zhuǎn)化（溫度30°C?60°C;時(shí)間24~72小時(shí)），獲得高含量的低聚異麥芽糖漿，對(duì)所得糖 漿進(jìn)行HPLC分析。在一些實(shí)施方式中，α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶（諸如At3)的活性選用麥芽糖 作為底物進(jìn)行測(cè)定。
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0024] 實(shí)施例1克隆α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶基因At3
[0025] 按照制造商的說(shuō)明書(shū)，使用真菌基因組DNA提取試劑盒（Omega)從土曲霉的過(guò)夜 培養(yǎng)物中提取基因組DNA。根據(jù)NCBI上的編號(hào)為XM_001210809的序列設(shè)計(jì)PCR引物。用 于克隆土曲霉中的At3基因的正向引物At3-F序列為5'-ccaTTACGTAATGGTTGACATCACCGAC CTTCTGG，反向引物 At3-R 序列為 5'-CTGCTCTAGACTACCACTCCAGGACCCAGTCCTT，將該基因用 Phusion DNA聚合酶（Thermo scientific)從土曲霉基因組DNA中擴(kuò)增出來(lái)。
[0026] 擴(kuò)增條件：
[0027] 第一步：98°C 保持 3min。
[0028] 第二步：98°C保持10s，然后72°C保持75s，此步驟重復(fù)30次。
[0029] 第三步：72°C保持 lOmin。
[0030] 使用凝膠純化試劑盒（Fermentas)將上述PCR產(chǎn)物純化。用限制性?xún)?nèi)切酶SnaBI 和Xbal (Fermentas)對(duì)純化了的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；同時(shí)，用限制性?xún)?nèi)切酶SnaBI和Xbal 對(duì)質(zhì)粒pGm (遺傳圖譜如圖1)進(jìn)行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化，并用T4 DNA連接酶（Fermentas)將上述兩個(gè)酶切產(chǎn)物連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans5a大腸桿菌 (Transgen)，用氨節(jié)青霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確，對(duì)若干克隆進(jìn)行測(cè)序（Invitrogen)。
[0031] 按照制造商的說(shuō)明書(shū)，使用質(zhì)粒中量制備試劑盒（Axygen)從測(cè)序結(jié)果正確的大 腸桿菌克隆中純化質(zhì)粒。所得2個(gè)質(zhì)粒分別為pGm-At3,結(jié)果擴(kuò)增出的基因的核苷酸序列為 SEQ ID N0 :2,其翻譯的氨基酸（蛋白）序列為SEQ ID N0 :1，序列比對(duì)結(jié)果表明其是一個(gè)新 的等位基因。
[0032] 實(shí)施例2 :PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化黑曲霉
[0033] 吸取黑曲霉G1孢子懸浮液于CMA平板中心（9 cm培養(yǎng)皿），待菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng) 皿，切1/4大小的培養(yǎng)基于200 mL CMA液體培養(yǎng)基中，在30°C、200 rpm的條件培養(yǎng)14~16 h〇
[0034] 用無(wú)菌Miracloth濾布收集菌絲體，并用溶液A清洗一次，在無(wú)菌條件下將清洗過(guò) 的菌絲體轉(zhuǎn)移到40 mL原生質(zhì)體化溶液，在30°C、200 rpm的條件下溫浴1~2 h，用顯微鏡觀 察檢測(cè)原生質(zhì)體化進(jìn)展。
[0035] 用無(wú)菌Miracloth濾布過(guò)濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質(zhì)體溶液。將原生 質(zhì)體溶液分裝于兩個(gè)50 mL無(wú)菌的一次性離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45 mL，在4000 rpm條件下離心8 min以獲得沉淀并棄去上清液。用20 mL溶液B再清洗沉淀 兩次。將沉淀重懸浮于10 mL溶液B中，并用血球計(jì)數(shù)板對(duì)原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。將原生質(zhì)體再 次離心并棄去上清液，根據(jù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質(zhì)體 數(shù)目在1X10 7個(gè)/mL。
[0036] 在冰上，將100 μ L上述原生質(zhì)體溶液加入預(yù)冷的無(wú)菌15 mL離心管中，每個(gè)轉(zhuǎn)化 反應(yīng)用1管。加入10 μ g DNA。加入12. 5 μ L溶液C，溫和混勻后再冰上放置20 min。
[0037] 將麗SA頂層瓊脂試管熔化并保持在55°C。從冰中移出上述15 mL離心管，并向管 中加入1 mL溶液C和2 mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質(zhì)體混合物。向3 個(gè)頂層瓊脂試管中的每一個(gè)中加入1 mL上述原生質(zhì)體混合物，并立即傾倒與MMSA平板上， 并將平板在30°C下培養(yǎng)疒10 d。
[0038] 溶液 A :2. 5 mL 1M Κ2ΗΡ04,2· 5 mL 1M ΚΗ2Ρ04,48· 156 g MgS04,加入 dlH20 至終體 積500 mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0039] 溶液 B :5 mL 1M Tris (pH 7.5),2.77 g CaCl2，109.32 g 山梨醇，加入(11!120至 終體積500 mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0040] 溶液 C :250 g PEG 4000,2· 77 g CaCl2,5 mL 1M Tris (pH 7. 5)，加入 dlH20 至終 體積500 mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0041] 原生質(zhì)體化溶液：將 0· 6 g 裂解酶（Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum，Sigma)溶解于40 mL溶液A中，用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0042] MMSA 平板：0.59 g 乙酰胺（Sigma)，3.4 g CsCl (Sigma)，0.52 g KC1，1.52 g KH2P04,218.5 g山梨醇，1 ml痕量元素（見(jiàn)下），20 g瓊脂，加入dlH20至終體積972.5 mL， 高壓蒸汽滅菌后加入用〇. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌的25 mL 40%葡萄糖和2. 5 mL 20% MgS04。
[0043] MMSA 頂層瓊脂試管：0· 59 g 乙酰胺（Sigma)，3· 4 g CsCl (Sigma)，0· 52 g KC1， 1.52 g KH2P04,218.5 g山梨醇，1 ml痕量元素（見(jiàn)下），10 g低熔點(diǎn)瓊脂糖，加入dlH20至 終體積972. 5 mL，高壓蒸汽滅菌后，在培養(yǎng)基未凝固時(shí)，加入用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除 菌的25 mL 40%葡萄糖和2. 5 mL 20% MgS04，之后立即分裝于無(wú)菌試管中，每管10 mL。
[0044] 痕量元素：在 250 mL dlH20 中加入 1 g FeS04 · 7Η20,8· 8 g ZnS04 · 7Η20,0· 4 g CuS04 · 5Η20,0· 15 g MnS04 · 4Η20,0· 1 g Na2B407 · 10H20,50 mg (NH4)6 M〇7024 · 4Η20,0· 2 mL 濃HC1，完全溶解后用dlH20定容至1 L，用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0045] CMA平板：20 g葡萄糖，20 g麥芽浸出物，1 g蛋白胨，15 g瓊脂，加入dlH20至終 體積1000 mL，高壓蒸氣滅菌。
[0046] CMA液體培養(yǎng)基：20 g葡萄糖，20 g麥芽浸出物，1 g蛋白胨，加入dlH20至終體積 1000 mL，高壓蒸氣滅菌。
[0047] 待平板上長(zhǎng)出菌落后，挑選25個(gè)菌落，按照制造商的說(shuō)明書(shū)，使用真菌基因組DNA 提取試劑盒（Omega)從其過(guò)夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。按實(shí)施例1中所述實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)At3 的黑曲霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。所得陽(yáng)性克隆的孢子懸浮液接 種于30mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200 rpm的條件下培養(yǎng)5d，所得發(fā)酵液用8層紗布過(guò) 濾，濾液在14000Xg條件下離心10 min，收集上清液。所得上清液即為酶液。將酶液在濃 度為12%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳，對(duì)在預(yù)期位置處有明顯條帶的陽(yáng)性克隆進(jìn)行HPLC分 析。根據(jù)HPLC分析圖譜，選取酶活力最高者作為At3轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的重組菌進(jìn)行進(jìn)一步 研究。選取的黑曲霉（Asperillus niger)At3,已于2012年11月30日保存于位于北京市 朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心（CGMCC)，菌株編號(hào)為 CGMCC No. 6923。
[0048] 實(shí)施例3 :黑曲霉（Asperillus niger) At3的發(fā)酵和酶的表達(dá)
[0049] 將表達(dá)At3 α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉（CGMCC No. 6923)轉(zhuǎn)化子的孢子懸浮液 接種于30mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200 rpm的條件下培養(yǎng)5 d。所得發(fā)酵液用8層紗 布過(guò)濾，濾液在14000Xg條件下離心10 min，收集上清液。所得上清液即為At3 α轉(zhuǎn)移葡 萄糖苷酶酶液。將酶液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳（圖2);電泳結(jié)果顯示在 107kDa處可以看到明顯條帶，而野生菌在預(yù)期位置沒(méi)有可見(jiàn)的蛋白條帶，宿主菌G1有極其 微弱的條帶，但表達(dá)量明顯遠(yuǎn)小于重組菌的表達(dá)量。
[0050] 配制pH4. 6的醋酸-醋酸鈉緩沖液，At3酶液用上述緩沖液稀釋至合適的濃度。以 10%麥芽糖為底物，加入適量的At3稀釋酶液，然后在50°C保溫轉(zhuǎn)化24小時(shí)以上，得到轉(zhuǎn)化 產(chǎn)物低聚異麥芽糖漿。將產(chǎn)物糖漿稀釋10倍，取lml稀釋糖漿經(jīng)0. 22 μ m的一次性微孔濾 膜過(guò)濾后，進(jìn)行HPLC分析。HPLC結(jié)果顯示，底物麥芽糖的含量有明顯減少，此過(guò)程伴隨有異 麥芽糖和異麥芽三糖的產(chǎn)生并且其產(chǎn)量顯著增加，同時(shí)也有些許潘糖產(chǎn)生。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 先前預(yù)期的結(jié)果一致，證明本發(fā)明的土曲霉α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化到黑曲霉中表達(dá)，確有 很好的轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶活性，可以催化麥芽糖生產(chǎn)低聚異麥芽糖。
[0051] TSB 發(fā)酵培養(yǎng)基：12 g NaN03,0. 5 g KC1，1. 5 g ΚΗ2Ρ04,2· 05 g MgS04 ·7Η20,3· 5 g NaH2P04*H20,45 g胰蛋白大豆肉湯，70 g檸檬酸鈉，1 g吐溫80，1 mL痕量元素（見(jiàn)下）， 加入dlH20至終體積700 mL，高壓蒸氣滅菌后加入300 mL用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除 菌的40%麥芽糖。
[0052] 痕量元素：在 250 mL dlH20 中加入 1 g FeS04 · 7Η20,8· 8 g ZnS04 · 7Η20,0· 4 g CuS04 · 5Η20,0· 15 g MnS04 · 4Η20,0· 1 g Na2B407 · 10H20,50 mg (NH4)6 M〇7024 · 4Η20,0· 2 mL 濃HC1，完全溶解后用dlH20定容至1 L，用0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0053] 實(shí)施例4表達(dá)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的應(yīng)用實(shí)例
[0054] 工業(yè)生產(chǎn)低聚異麥芽糖漿，以淀粉為原料，加水制成30%粉漿，在pH值為6. 0、溫 度為9(T120°C條件下，經(jīng)耐熱性α -淀粉酶液化后，在pH值為5. 0、溫度為60°C的條件下， 用β_淀粉酶、普魯蘭酶和真菌α-淀粉酶同時(shí)作用，轉(zhuǎn)化成麥芽糖后，加入實(shí)施例3的菌 株編號(hào)為CGMCC No. 6923的黑曲霉所表達(dá)的α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)生成異麥芽 糖、異麥芽三糖、四糖及五糖等含α-1，6鍵的分支低聚糖與潘糖。加入α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷 酶使其轉(zhuǎn)化率明顯提高可達(dá)409Γ50%以上，再經(jīng)活性炭脫色、離子交換樹(shù)脂脫鹽，濃縮到固 形物為75%，得到普通異麥芽糖漿，其中含異麥芽低聚糖為409Γ50%，葡萄糖為40%，再將葡 萄糖用酵母發(fā)酵或膜過(guò)濾除去，便可得到含異麥芽低聚糖為90%的產(chǎn)品。上述結(jié)果表明本 發(fā)明所保藏的重組菌株能夠高效的表達(dá)α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其酶活力大大高于其在野生 菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表達(dá)的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶活力。
[0001] I t:列表 SCOUCNCE LISTING <ll〇> /cnu'IM:物技術(shù)寶所 d鑛移葡萄βΙΙΙΙ麗其重菌# <160> 2 < 170> Patcntln vcrsiosi 3.5 <2H)> 1 <211> 9m <212> FRT <213> aHraiisgiucesidisi proicin <4(M)> 1 Mci ￥al Asp ilc Thr Asp Leu Leu Ala Gly Ala Cys Lew Leu Pro ￥al I 5 m 15 Val Tyr Gly Ala Scr Gin Thr Leu Ala Pro Scr Thr Scr Ala Thr Ala 20 25 30 Scr His Thr Gin Phe Thr lie Pro Ala Scr Ala Asp Val Gly Ala Gin 35 40 45 Leu He Ala Asn lie Asp Asp Pro Gin Ala Val Asu Ala Gin Scr Val 50 55 60 Cys Pro Gly Tyr Arg Ala Ser Asp Val His His Asn Ser His Gly Phe 65 TO 75 80 Thr Ala Scr Leu Gb Leu Ala Gly Asp Pro Cys Asn Vd Tyr Gly Thr 85 m 95 Asp Val Glu Ala Leu Thr Leu Thr Val filu Tyr Gin Ala Lys Asp Arg IW 105 110
[0002] Leu Asn Ik Gin lie 1 hr Pro Thr His Val Asp Ala Scr Asn Ala Scr Π5 120 125 Trp Τ>τ He Leu Scr Giu Asp Leu Val Pro An? Pro Gin Ala Scr Scr 130 135 140 Asp Gly Scr Ala His Asp Scr Asp Leu Ala Pbc Scr Trp Scr Asn Glu !45 150 155 靡 Pro Scr Phe Asn Phe Lys> Val Thr Arg Lys Ah Thr Oly Asp OIu Leu 165 m 175 Phe Asn Thr Glu Gly Scr Thr Leu Val Tyr Giu Asn Gin Phe Ik Glu ! !85 190 Phe Va! Scr Ab Leu Pro Glu Glu Tyr Asn Leu Tyr G!y Leu Gly Gk! 195 2m 205 為增 IVIel Ala Cilii Leu Arg Leu Leu Arg Asn Ala Thr Leu Tlir Mel Tyr 210 215 220 Ala Ala Asp He Gly Asp Pro lie Asp Scr Asn He Tyr Gly Gin His 225 230 235 240 Pro Phe Tyr Leu Asp Thr Arg Tyr Tyr Lys Val Asp Lys His Gly Scr 245 25U 255 His Thr Leu Val Lys Thr Asp ?-vs Ala Asp Ala Scr Glu Gly Tyr Val 260 265 270 Ser T>t Scr His Gly Val Phe Leu Arg Asn Ala His Gly Gin Giu Val 275 280 2R5 Leu Leu Asn Pro Lys GJy Val Thr Trp Arg Thr Leu Gly Gly Scr lie
[0003] 好列表 290 295 3(10 Asp 丨,cm Thr Phe Tyr Ala Gly Pro Scr Gin Va丨 Gin Va丨 Thr Gin Gin 305 310 315 320 Tyr Leu Lys Ser Thr Val Gly Ixu Pro Ala Met Gin Lys Tyr Sa· Hir 325 330 335 Leu Glv Phc His Gin Cys Arg Trp Gly Tyr Asn Asn Trp Tlir Gin Lett 340 345 350 Ala Asp Va丨 Vrd AUi Asn Phe Glu Lys Phe Ghi lie Pro Leu Glu Tyr 355 360 365 He Tip Scr Asp He Asp Tyr Mel His Gly Tyr Arg Asn Phe Asp Asn 370 375 3H0 Asp Val His Arg Plie Pm Tyr Asp Ghi Gly Val Glu Phe Leu A^n Lys 385 390 395 4(K1 Leu Hss Asp Scr Gly Arg His Trp Val Pro lie Val Asp Gly Ala [,cii 405 410 415 Tyr He Pro Asn Pro Ghi Asn Ain Scr Asp Ala Tyr Gkt Thr Tyr Thr 420 425 430 Arg Gly Ala Ala Asp Asp Leu Trp lie 1 ,ys Asn Pro Asp Gly Ser i.eu 435 440 445 Tyr lie Gly Ala Val Trp Pro Gly Tyr Thr Val Tyr Pro Asp Trp His 450 455 460 His Pro Lys Ala Val Asp Phe Trp Ala Asn Glu lie Val Tlir Trp Trj> 465 470 415 480
[0004] 列表 Lys Lys ixu Pro Tyr Asp 01); lie Trp Tyr Asp Met Ala Cllu Val Scr 485 490 495 Scr Fhc Cys Val Gly Ser Cys Gly Thr Gly Asn Leu Thr Leu Asn Pro 5_ 505 510 Val His Pro Pro Phe Ala Leu Fro Gly Olu Fro (ily Asn Val Val Tyr 515 52(? 525 Asp Tyr Pro Glu GIv Phe Glu I.ys Thr Asn Ala Thr Glu Ala Ala Scr 530 533 540 Ala Scr Ala Gly Scr Scr Ser Gin Ala Ala Ala Ala Pro Thr Ser Fro 545 550 555 560 Scr Thr Thr Thr Scr Tyr Leu Arg T!ir Tin Pro 1'hr Ala Gly Val Aig 565 57ti 575 Asn Val Asn His Pro Pro Tyr Vat He Asn His Val Gin Thr Gly His 5H0 585 590 Asp Leu Ala Val His Ala He Scr Pro Asn Scr Thr His Val Asp Gly 595 600 60S Val Gin Glu Tyr Asp Val His Scr Leu Phe Gl> His Gin Gly lie Asn 610 615 620 Ala Thr T>t Gin Gly Leu Leu Gly Val Trp Pro Giu Lys Arg Pro Phe 625 630 635 640 He 11c Ala Arg Scr Thr Fhc Ala Gly Scr Giy Lys Ττρ Ala Gly His 645 650 655
[0005] 行：列表 Trp Gly Gly Asp Asn lie Scr Lys Trp Gly Scr Met Tyr Phe Scr He 660 665 670 Scr Gin Ala Leu Scr Phe Scr Leu Phe Gly lie Pro Mel Phe GJv Thr 675 (m ms Asp Thr Cys Gly Phe Asn Gly As? Tin Asp Glu Glu Leu Cys Asn Arg mo 695 7m Trp Met Gin Leu Scr Ala Phe Phe Pro Phe Tyr Arg Asn His Asn Val 705 7 HI 715 720 Leu Scr Ala ilc Pro Gin Glu Pro Tyr Arg Trp Ala Scr Val He Asp 725 730 735 Ato Scr Lys Ala Ala Mel Lys Ik Arg Tyr Ala lie Leu Pro Tyr Phe 740 745 750 Tyr Thi* Leu Phe His Plie Aki His Uir Tlir Gly Ser Thr Val Arg 755 760 765 Ala Leu Ala Leu Trp Scr Gly Leu Pro Scr Trp Scr Scr Arg Scr Trp 770 775 7雜 Qu Pro Gin Va〗Asp Thr Val Lys Gly Val Phe Pro Gly Va〗Gly Asn 7K5 791! 795 800 Gly Glu Val Trp Tyr Asp Trp Tyr Thr Gin Thr Ala Val Asp Ala Glu 805 810 815 Pro Gly Val Asn Lys Thr Leu Scr Ala Pro Leu Gly His He Pro Val ?20 825 830
[0006] 序剩衣 Phc Val Arg (ily (My Ser Val lie Pro Mel (iln Olu Pro Ala Leu Tlir 835 UO 845 Thr Thr Asp Ala Arg Lys Thr Pro Trp Ser Leu Leu Thr Ser Leu Ser 850 855 860 Ser Glu Glv Thr Ala Trp Gly Glu Leu Tw Leu Asp Asp Gly Glu Ser K65 X?0 875 SSO \y Thr Fro Asp (Hu Thr Leu Leu Va! Ilir Fhc (iln A!a A!a His Ser xx5 _) ms Lys Leu Arg Ala Thr Pro Lys Gly Asn Trp Glu Ghi Ser Asn Ala Leu ^?) m Ala Asn Val Thr Val Leu Gly Val Ala Lys Glu Pro Arg Asn Val Arg 915 920 925 Phc Asn (ily Lys Lys He Ser Ser Val Ala Tyr Asn Ah Thr Ser (itn m) 935 雜 Val Leu Ser Val Gly Gly Leu Gin Glu Leu Thr Gly Lys Gly Ala Trp 945 950 955 960 Ala Lys Asp Trp Val Leu GJu Trp 965 <2H> 2 <211> 3112 <212> DNA <213> α-lransgiucosidasc gene <400 2 atggtlgaca icaccgacct tctggccggt gcctgcclgs teccggtggt ctatggggcg 60 agtcagaccc tggccccgag cacctccgcg acggcttctc acacccagtt caccatccct 120
[0007] 坪列表 gcgtcggccg acgtcggtgc teaaltgate gcoaacatcg aegatecgea ggocgtgaat 180 gcgcagagtg tgtgccctgg atatcgggct teggatgtle atcalaactc teaiggglll 240 acggctagtc tggagttggc gggagacccc tgcaatgigt acggaacgga tgtcgaagcc 3_ ttgacttiga ccgtcgagta ccaggcgaag gatcggttga acatccagat cacccctact 36(1 cacgttgEcg cgtccaalgc etetlggtae atectttegg agfieclggl gccccggccc 420 caggeticgl eg gaiggcte ggeieatgae tgegatcttg gwaatgaa 480 mmama 處m 歲驄 t gacmgmm gemmggag atgagmtt mmmcgm 540 ggctccactt tggtgtatga aaaccagttc atcgagtttg tgagcgcctt gcctgagg^g ⑷" lacaacttgt alggcttggg tgagcggatg gcccagctgc ggttgctgcg caatgccact 祕(mì)i) ctgaccatgt aigeggcfgi liliggtgal ccgattgata ggtaagcagc gilgeaaaeg 720 gggtcaagca gatctgttac tgacattgtc gtgtagcaat atctatggcc agcaiccati 780 ctatctggac accagatact acaaagtgga caagcacggc totcacaeti tggtcaagae H40 cgacaaggcc g^tgcctetg aggaatatgt gtcitattcc catggtgtct tcctgagaaa 900 tgcecatgga eaggaggtcc tcctgaacce caaggglgtg acatggcgta ctctcggtgg 960 aagcatcgat cttactttcl acgccggccc aagccaggtc caagtcaccc agcagtatct 1020 gaagagtact gttggtctgc cggccatgca gaaglatagc acgctcggct tccaccagtg 1080 ccgctgggga tacaacaaci ggsecgggei ggeagstgte gtggcgaact ttgagaagtt 1140 cgagattcct ctggaataca tetggtatgt agtcgatgca tccagtcttg gtctcctggt 1200 ctgacactte taggtctgat attgactata tgeaoggtta ccggaacttc gacaacgatg 1260 tccaccggtt cccatacgac gagggtgtcg agttcctcaa caaactccac gacagtggac 1320 gccaetgggt cccgaitgtt gatggggcgc ictalatcoc gaacocogag aatgctlcig 1380 atgcgtaagt catgclaiac ctatacaccc ggttgtgcct tlactaatca tgtcacoagg 1440
[0008] tatgaaacat acacccgagg agelpggat gaictctgga icaagaaccc cgatggcagc 1500 ctelacattg gageegteig gc^eggcte ?gletate eigai%gca toaeaiteag 1560 gcagtggact tetgggccaa cgagalcgig acciggtgoa aoaaactgcc atafgatggl 1620 atctggtacg aealggctga agigfcticf ttcigtgfeg gcagctgcgg lao^ggaaac HM ugacictca acccggnca cccaccauc gcgcigcccg gagagccagg caacgicgic 174() lacgaciaic ctgagggci! igagaagacc aacgcgaccg aggcigccic Igcaiccgci 1X〇〇 gglieltcea geeaggcigc igc%cicca acetet^gi e^cgi￡gae ilcclatetg 1861) cgtaccacgc coactgctgg c^tcgcaat gigaaccacc ciccctacgt gatcaaccat 1920 gtccagacgg gcci^gatct cgctgticat gcgatitcic ccaactccac ^acgitgat 19X0 ggggftxagg agta^gatgt gcac^tctg ittggecacc agggtatoa tgccai^^c 2M§ caaggicte tlggagtalg gcctgagaag c^ecgtKm tiatcgoteg llcc^gttc 2! 00 gttggct^tg giimatgggc cggtcactgg ggcggcgata acatttficaa giggggatcc 2160 atgtacllct ccatctctca ggccccticg ttctctctct tcggtatccc caigtttggt 2220 accgalaccl gcggtttcaa cggaaacacc gacgaggagc tctgcaaccg clggaigcaa 22 SO ctctccgcct tettcccctt ctaccgtaac cacaatgtte tctcggctat cccgcaggaa 2340 ce_€ggl gggegtoggt tot麟egca ageaagge鼸 ^Igaafat eegclaegee 24_ attctccc€t aeifeiaeae feitii^ac tteg<xcaca ceacgggcte gactgteatg 2460 cgcgccctgg cgtgggagtt tcccaacgac ccctcgctgg ccgccatcga cacccagttt 2520 atggtcgggc cttccgtcat ggtcgtcccg gtcctgggag ccccaggicg acaccgtcaa 2580 gggtgUtic cccgglgUg gcaacggcga ggtciggtac gacigglaca cgcagaclgc 2640 ggttgacgcg gagccgggtg tcaacaagac tctctetgct cctctcggcc acatcccggt 2700 cttlgtogg gglggcagig toAcccgat gc^gagcec gcgclgasca ccaccgalgc 2760 gcgcaagacg ccttggtcgc ttctgacatc actgagcagc gagggcaccg cctggggcga 2820
[0009] 序列表 gctctatctc gatgacggcg aaagcgtcac cccggatgag acgcttcttg tcacattcca 2KH0 ggctgcgcac tcgaagclgc gtgccacgcc caaaggcaac tgggaagagt cgaaigctct 2940 ggccaacglg acggicctig gtglggccaa ggagccgcge aalgiccggi icaaiggcaa 3000 gaagalcagc icgglcgcct acaatgcgac UcgcaggU ctctcigicg gaggicicca 3060 ggagctgacl ggcaagggcg cgtgggccaa ggaclgggtc ctggagtggt ag 3112
【權(quán)利要求】
1. 一種α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的氨基酸序列為 SEQ ID NO: 1〇
2. 權(quán)利要求1所述的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶在生產(chǎn)低聚異麥芽糖中的應(yīng)用。
3. 用于編碼權(quán)利要求1所述的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 2〇
3. 用于重組表達(dá)權(quán)利要求1所述的α轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的曲霉菌株。
4. 如權(quán)利要求3所述的曲霉菌株，為黑曲霉（Asperillus niger)At3,其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 6923。
5. 權(quán)利要求4所述的曲霉菌株在生產(chǎn)低聚異麥芽糖中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/54GK104099306SQ201310118904
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月8日
【發(fā)明者】王華明, 訾禎禎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所