一種分子遺傳學(xué)診斷hTERT和SV40轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)診斷hTERT和SV40轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，其主要特征是以T4DNA連接重組子SV40LTag-pcDNA3.1(-)和pLXSNneo-hTERT，以脂質(zhì)體導(dǎo)入常見染色體數(shù)目異常組織細(xì)胞，G418篩選整合有重組子的細(xì)胞作傳代擴(kuò)增后凍存，臨用時(shí)按質(zhì)控所需比例混合，使原先每例細(xì)胞只有1種染色體數(shù)目異常轉(zhuǎn)變?yōu)楹幸欢ū壤?種至5種染色體數(shù)目異常的嵌合體質(zhì)控細(xì)胞，增加了鑒別診斷、嵌合體診斷的難度，原始細(xì)胞易得且將廢棄的多余細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有效的永生化質(zhì)控細(xì)胞，以疑難質(zhì)控細(xì)胞作室間質(zhì)評(píng)和室內(nèi)質(zhì)控，對及時(shí)發(fā)現(xiàn)和解決質(zhì)量問題、提高診斷水平具有重要的意義。
【專利說明】-種分子遺傳學(xué)診斷hTERT和SV40轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)控細(xì)胞及其制備 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種分子遺傳學(xué)診斷hTERT和SV40轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，主要 應(yīng)用于醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室作染色體病診斷的技術(shù)考核、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)。

【背景技術(shù)】
[0002] 染色體是細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)，人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為 決定男女性別的性染色體。染色體上載有遺傳信息的基因，其中DNA占90%以上，RNA含量 隨細(xì)胞周期及生長情況而有所變化，一般占1%?10%。
[0003] 染色體結(jié)構(gòu)異常、數(shù)目異常及嵌合體，臨床上表現(xiàn)為染色體病，屬于常見的出生缺 陷，如先天愚型、原發(fā)性閉經(jīng)、兩性畸型等。染色體結(jié)構(gòu)異常包括染色體易位、缺失、倒位、環(huán) 狀等；染色體數(shù)目異常是指多出或缺少1條或數(shù)條染色體；嵌合體核型是指同一病例個(gè)體 并存數(shù)種染色體核型。目前診斷染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常的常規(guī)方法是染色體核型分析，即 用被檢的組織或細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)、〇. 02 μ Ι/ml秋水仙素終止細(xì)胞生長、分離中期細(xì)胞、 0.075mol/LKCl低滲、甲醇-冰乙酸（3 : 1)固定等染色體制片程序后，再經(jīng)胰酶消化、G顯 帶、染色體核型分析，從而作出染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目是否異常的判斷，但染色體核型分析需經(jīng) 細(xì)胞培養(yǎng)和制片，一般需2?3周后才能作出診斷報(bào)告，不能達(dá)到快速診斷的目的。近年來 開展的熒光原位雜交技術(shù)，能快速作出染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)是否異常的診斷，一般在24小時(shí) 就能作出診斷報(bào)告，因?yàn)楫a(chǎn)前診斷中的重大遺傳病如21-三體、18-三體、13三體、性染色體 數(shù)目異常均屬常見染色體數(shù)目異常，均可經(jīng)熒光原位雜交作出快速診斷，所以近年來熒光 原位雜交技術(shù)已被越來越廣泛地應(yīng)用于被定義為常見染色體數(shù)目異常的21-三體、18-三 體、13三體、性染色體異常（X與Y染色體）的產(chǎn)前診斷。
[0004] 作為所開展的各類實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng)目，均應(yīng)有相應(yīng)規(guī)范的質(zhì)量控制措施。實(shí)驗(yàn)室的質(zhì) 量控制是確保實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果準(zhǔn)確性的前提，已成為政府行為。為了加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制， 我國于1982年成立了衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，下設(shè)室間質(zhì)評(píng)辦公室，專職從事于實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng) 目的質(zhì)量控制。衛(wèi)生部[衛(wèi)醫(yī)發(fā)]1997第31號(hào)文件、《臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》、《醫(yī)院評(píng)審標(biāo) 準(zhǔn)實(shí)施細(xì)則》以及大量的文獻(xiàn)均指出，實(shí)驗(yàn)室必須有規(guī)范的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，所開展的實(shí)驗(yàn)診 斷項(xiàng)目必須參加衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的室間質(zhì)評(píng)。自1982年以來，在臨床檢驗(yàn)學(xué)科先 后開展了臨床實(shí)驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng)。包括了對各檢驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)前、中、后以及儀器、 試劑和實(shí)驗(yàn)人員的質(zhì)量控制。質(zhì)量控制已滲透到臨檢、生化、微生物、免疫、基因、細(xì)胞形態(tài) 學(xué)診斷等各個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制已成為開展實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng)目的準(zhǔn)入制度、成為醫(yī) 院等級(jí)評(píng)審的重要標(biāo)準(zhǔn)。
[0005] 產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制已引起日益重視。隨著我國對生殖健康和出生缺陷工作的 是益重視，近年來各省市均建立了產(chǎn)前診斷中心，開展了 21三體綜合癥、18三體綜合征、 神經(jīng)管畸形等重大出生缺陷的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷，其中與重大出生缺陷相關(guān)的胎兒羊水 染色體異常的診斷已成為目前產(chǎn)前診斷的主要項(xiàng)目。由于產(chǎn)前診斷是新開展的學(xué)科，大多 專業(yè)人員的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)較為缺乏，特別是對于疑難、罕見病例、國內(nèi)外首報(bào)病例以及如貓叫綜 合癥等染色體異常不明顯但臨床后果嚴(yán)重的病例，誤診現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。我國國家主席令 (1994年10月27日第三十三號(hào)）公布的"產(chǎn)前診斷法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)"以及國務(wù)院辦公廳[國發(fā)辦 (1999) 15號(hào)]轉(zhuǎn)發(fā)衛(wèi)生部"關(guān)于做好提高出生人口素質(zhì)工作意見"的通知中均強(qiáng)調(diào)指出， "各省、市產(chǎn)前診斷中心必須加強(qiáng)產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制、嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)"。
[0006] 產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制是許多學(xué)者致力于研究的重要課題。國外有較多的文獻(xiàn)報(bào) 道了產(chǎn)前診斷質(zhì)量控制的重要性，Sikkema-Raddatz B等對產(chǎn)前細(xì)胞遺傳學(xué)診斷的細(xì)胞培 養(yǎng)及制片過程的影響因素作了深入的研究，提出了室內(nèi)質(zhì)量控制的方法；Fries N和Merz E等提出了影像學(xué)產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制方法；Pihlk等認(rèn)為必須加強(qiáng)產(chǎn)前篩查的質(zhì)量控制； 在2002?2004年期間，Bastien P等對法國23家實(shí)驗(yàn)室作了弓形蟲產(chǎn)前分子診斷的室間 質(zhì)量評(píng)價(jià)，認(rèn)為室間質(zhì)評(píng)對促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室間的技術(shù)交流、發(fā)現(xiàn)問題、提高實(shí)驗(yàn)診斷質(zhì)量起到重 要的作用。
[0007] 雖然我國行政主管部門以及學(xué)術(shù)界十分重視產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制（包括室內(nèi)質(zhì) 控和室間質(zhì)評(píng)），但因沒有可行的質(zhì)控物，所以無法開展實(shí)質(zhì)性的質(zhì)量控制。也就是說，要開 展產(chǎn)前診斷的室間質(zhì)評(píng)和室內(nèi)質(zhì)控，首先必須要有質(zhì)控物。研制可行的質(zhì)控物、開展產(chǎn)前診 斷質(zhì)量控制是質(zhì)量管理人員以及本專業(yè)技術(shù)人員長期以來想方設(shè)法解決但始終沒有解決 的難題。
[0008] 國外文獻(xiàn)報(bào)道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poul in DL、 Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長速率， 永生化細(xì)胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時(shí)也能保留其 原始細(xì)胞的許多分化表型；另有國外研究表明，導(dǎo)入外源性hTERT可以使細(xì)胞保持正常表 型及分化特征，近年來已利用hTERT成功建立了某些細(xì)胞的永生化細(xì)胞系，基本保持染色 體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對"正常"的生長特征。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，日本 學(xué)者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周細(xì)胞、牙髓 細(xì)胞系和牙囊細(xì)胞系，細(xì)胞群體倍增數(shù)達(dá)150次以上，細(xì)胞均表現(xiàn)原有的生物學(xué)特性，誘導(dǎo) 培養(yǎng)后都可以表達(dá)來源細(xì)胞的相關(guān)蛋白。Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細(xì)胞 系，細(xì)胞倍增達(dá)200次以上，細(xì)胞分化標(biāo)志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達(dá)穩(wěn)定；還有國外 研究表明，人體組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)死亡而無法傳代，即在進(jìn)入衰老期 (Ml期）前就會(huì)死亡。但猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化，可使細(xì)胞渡 過Ml期后繼續(xù)存活、傳代培養(yǎng)20-30代，然后細(xì)胞又會(huì)進(jìn)入危機(jī)期（M2期），細(xì)胞死亡率增 加并伴染色體異常，分裂的細(xì)胞逐漸減少，絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生死亡。而hTERT可以維持細(xì)胞 染色體端粒的穩(wěn)定，從而使細(xì)胞渡過危機(jī)期（M2期），可繼續(xù)存活、傳代達(dá)100-300代以上。 所以用SV40和hTERT同時(shí)轉(zhuǎn)染人離體組織細(xì)胞建立永生化細(xì)胞系，SV40可以使細(xì)胞渡過 Ml期，hTERT可以使細(xì)胞渡過M2期，比單獨(dú)使用其中之一建立的細(xì)胞系更穩(wěn)定、壽命更長。 但是，至今尚未見有關(guān)以猴腎病毒40大T抗原基因（SV40LT)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基 (hTERT)同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞以建立永生化細(xì)胞系并用作質(zhì)控細(xì)胞的文獻(xiàn)報(bào)道。
[0009] 在產(chǎn)前診斷中，常有一些在診斷報(bào)告發(fā)出后剩余的病例活細(xì)胞，本可用作質(zhì)量控 制細(xì)胞，但因?yàn)檫@類細(xì)胞未作特殊處理，很易死亡、難以大規(guī)模擴(kuò)增以供許多實(shí)驗(yàn)室反復(fù)多 次使用，所以就難以作為質(zhì)控細(xì)胞使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了解決醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室作染色體病診斷中無質(zhì)控物的問題，本發(fā)明 人提出了本發(fā)明。
[0011] 本發(fā)明的目的是要提供一種用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的分子遺傳學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室作染色體病 診斷的技術(shù)考核、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)的hTERT和SV40轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法。
[0012] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：以T4DNA連接經(jīng)BamHI酶切質(zhì)粒SV40LTag DNA 及載體 pcDNA3. 1 (-)DNA 的產(chǎn)物，構(gòu)建 SV40LTag-pcDNA3. 1 (-)重組子；并以 Ligation Mix連接經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產(chǎn)物，構(gòu)建 pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增純化、鑒定后以脂質(zhì)體導(dǎo)入因臨床診 治需要而作染色體病診斷后并已確診為常見染色體數(shù)目異常之一的21-三體、18-三體、13 三體、X或Y染色體異常的剩余的呈貼壁對數(shù)生長的原代或傳代活細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞的 DNA整合，以G418篩選整合有重組子的細(xì)胞，作傳代擴(kuò)增后凍存，然后取這些常見染色體數(shù) 目異常的細(xì)胞，按質(zhì)控所需比例混合，使原先每例細(xì)胞只有1種染色體數(shù)目異常轉(zhuǎn)變?yōu)楹?有一定比例的2種至5種或多種染色體數(shù)目異常的嵌合體質(zhì)控細(xì)胞，集中保存?zhèn)溆谩?br> [0013] 本發(fā)明以因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確診為常見染色體數(shù)目異常 之一的21-三體、18-三體、13三體、X或Y染色體異常的剩余的呈貼壁生長的原代或傳代活 細(xì)胞為原始細(xì)胞，標(biāo)本易得（如2012年本室發(fā)現(xiàn)21-三體43例、18-三體28例、13三體7 例、X染色體數(shù)目異常15例、Y染色體數(shù)目異常12例）且將廢棄的剩余細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有效的 質(zhì)控細(xì)胞；以轉(zhuǎn)基因同時(shí)導(dǎo)入SV40LTag-pcDNA3. 1 (-)和pLXSNneo-hTERT重組質(zhì)粒而建成 的質(zhì)控細(xì)胞具有永久生存、無限擴(kuò)增的性能，可按需復(fù)制足夠的細(xì)胞系以滿足質(zhì)控要求；將 5種各具單一染色體數(shù)目異常的細(xì)胞按質(zhì)控所需比例混合后，使原先每例細(xì)胞僅有單一染 色體數(shù)目異常轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ū壤?種至5種染色體數(shù)目異常的易誤診的嵌合體質(zhì)控細(xì)胞， 從而增加了鑒別診斷、染色體嵌合體診斷的難度和復(fù)雜性，以疑難病例考核診斷水平、作室 內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)，對及時(shí)發(fā)現(xiàn)質(zhì)量問題、制定改進(jìn)預(yù)案、提高診斷水平具有顯著的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明制備的一種21-三體羊水組織細(xì)胞（代表性細(xì)胞）的質(zhì)控細(xì)胞。
[0015] 圖2是本發(fā)明提出的5種染色體數(shù)目異常細(xì)胞等比例混合的質(zhì)控細(xì)胞的熒光原位 雜交結(jié)果模擬圖。
[0016] 如圖1，細(xì)胞傳代至第150代、培養(yǎng)至第3天時(shí)，呈圓形、梭形、貼壁生長，細(xì)胞生長 匯合率已達(dá)45%。
[0017] 如圖2,包含有5個(gè)細(xì)胞，其中細(xì)胞1為18-三體細(xì)胞，1. 1、1. 2、1. 3各代表1條18 號(hào)染色體，比正常細(xì)胞多了 1條18號(hào)染色體；細(xì)胞2為少1條性染色體的細(xì)胞，2. 1代表1 條X染色體，正常細(xì)胞應(yīng)還有1條X染色體或1條Y染色體；細(xì)胞3為多1條Y染色體的 細(xì)胞，3. 1、3. 2各代表1條Y染色體，正常細(xì)胞只有1條Y染色體；細(xì)胞4為13-三體細(xì)胞， 4. 1、4. 2、4. 3各代表1條13號(hào)染色體，細(xì)胞內(nèi)多了 1條13號(hào)染色體，正常細(xì)胞為2條13號(hào) 染色體；細(xì)胞5為21-三體細(xì)胞，5. 1、5. 2、5. 3各代表1條21號(hào)染色體，細(xì)胞內(nèi)多了 1條21 號(hào)染色體，正常細(xì)胞為2條21號(hào)染色體。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 1、原始細(xì)胞：所用的原始細(xì)胞來源于因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確 診為常見染色體數(shù)目異常之一的21-三體、18-三體、13三體、X或Y染色體異常的剩余的 呈貼壁生長的原代或傳代活組織細(xì)胞，其原代或傳代活組織細(xì)胞也可以涉及染色體結(jié)構(gòu)異 常的活組織細(xì)胞或除5種常見染色體數(shù)目異常以外的第1號(hào)至第22號(hào)染色體數(shù)目異常活 組織細(xì)胞。細(xì)胞類型為胎兒羊水、絨毛組織等細(xì)胞。
[0019] 2、SV40LT和hTERT的提?。海?)酶切SV40LT和hTERT :①酶切SV40LT :從市售購 買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質(zhì)粒，溶解于適量的H20或TE緩沖液中，力口 2uL10X酶切緩沖液、18uL H20和限制性內(nèi)切酶BamH I(l-5U/ugDNA)，37°C溫育lh，75°C加 熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液（也可通過加入0. 5mol/L EDTA)終止反應(yīng)以備 電泳。②酶切hTERT :hTERT位于質(zhì)粒pClneo-hTERT的EcoRI與Sal I位點(diǎn)之間，pLXSNneo 載體多克隆位點(diǎn)（MCS)含EcoRI與Xhol酶切位點(diǎn)。從市售購買pCIneo-hTERT質(zhì)粒，溶解 于適量的超凈H 20或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液和18uL H20,加入限制性內(nèi)切酶 EcoR I和Xho I各0. 5ul，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液 (也可通過加入0. 5mol/L EDTA)終止反應(yīng)，按常規(guī)PCR法擴(kuò)增hTERT后，收取擴(kuò)增物以備 電泳。（2)SV40LT和hTERT電泳：① SV40LT(SV40DNA)電泳：取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液 配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái) 上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm， 用適量的10X加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時(shí)做合 適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對照物，接通電極，使DNA向陽極移動(dòng)，在1-lOV/cm凝膠的電壓下電泳 至足夠分離DNA片段的距離時(shí)，關(guān)閉電源。②hTERT電泳：取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配 成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái)上 除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用 適量的10X加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時(shí) 做合適的標(biāo)準(zhǔn)對照物，接通電極，使hTERT向陽極移動(dòng)，在l-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電 泳至足夠分離hTERT片段的距離時(shí)（30min)，關(guān)閉電源。（3) SV40LT和hTERT純化與回收： ① SV40LT純化與回收：從瓊脂糖中分離出約2600bp SV40大T抗原DNA :在300-360nm長波 紫外光源下（使用長波紫外光源以防止DNA損傷）將含目標(biāo)DNA片段的凝膠條帶切下裝入 透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放 入電泳槽（長度方向與電泳平行），加入適量緩沖液將透析袋浸沒（約6-7mm)，接通電源， 150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋 中吸出緩沖液于l -5ml Eppendorf管中，加入1. 5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺(tái)式離 心機(jī)上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，在下層DNA的溶液中加入等體 積酚氯仿（2個(gè)）抽提2次，上清液轉(zhuǎn)入到另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、 2倍體積預(yù)冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入 70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μ1 TE溶解DNA。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠 法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。②hTERT純化與回收：從 瓊脂糖中分離hTERT條帶：在長波紫外光源下將含目標(biāo)hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透 析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入 電泳槽（長度方向與電泳平行），加入適量緩沖液將透析袋浸沒（約6-7mm)，接通電源，150 伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋 中吸出緩沖液于l -5ml Eppendorf管中，加入1. 5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺(tái)式離 心機(jī)上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，自下層hTERT的溶液中加入等 體積酚氯仿（2個(gè)）抽提2次，上清轉(zhuǎn)入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2 倍體積預(yù)冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，力口 入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ 1 TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖 凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來。
[0020] 3、SV40LT 和 hTERT 分別與載體 pcDNA3. 1 和 pLXSNneo 構(gòu)建重組子：（1) SV40LT/ pcDNA3. 1重組子的構(gòu)建：取9 μ 1上述DNA成份（0. 1-5 μ g)、10 μ 12 X連接緩沖液、 1 μ 110mmol/LATP、T4DNA連接酶（20?500粘性末端單位）或大腸桿菌DNA連接酶、 pcDNA3. 1 空載體混合，15°C溫育 24h，構(gòu)建成 SV40LT/pcDNA3. 1 重組子。（2)pLXSNne〇-hTERT 重組子的構(gòu)建：取9 μ 1上述純化的hTERT成份（0. 1-5 μ g)、1 μ 110mmol/L ATP、10ul Ligation Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo空載體混合，15°C溫育24h，構(gòu)建 pLXSNneo-hTERT 重組子。
[0021] 4、重組子的純化、擴(kuò)增、鑒定：（l)SV40LT/pcDNA3. 1重組子的擴(kuò)增、分離與鑒定： ①大腸桿菌感受態(tài)的制備：其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽離子等處理細(xì)菌， 使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl 2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制 備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下：從37°C培養(yǎng)16?20h 的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH52)，或lml新鮮的16?20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn) 到一個(gè)含有l(wèi)〇〇mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h(旋轉(zhuǎn) 搖床200?300r/min)，每隔20?30min測量0D600值~ 0. 4,在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到 一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min后，于4°C用SorvallGS2 轉(zhuǎn)頭（或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭）以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將 管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以10ml用冰預(yù)冷的0. lmMCaCl2重懸每份沉 淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭（或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭）以4000r/min離心10min，以 回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng) 物用2ml冰預(yù)冷的0. 1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰 凍，-70°C貯存?zhèn)溆茫美鋮s的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200 μ 1轉(zhuǎn)移到無菌 的微量離心管中，每管加 DNA或連接反應(yīng)混合物（體積彡10 μ 1，DNA彡50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以 混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放 置90s?2min，不要搖動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1?2min，每離心管加 800μ 1S0C培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min 使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積（每個(gè)90mm平板可達(dá) 200 μ 1)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgS04和相應(yīng)抗生素的S0B培養(yǎng)基上，將 平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。②重組子 的篩選、擴(kuò)增與提取：用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基 或豐富培養(yǎng)基（如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基）中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB 培養(yǎng)基（含有適當(dāng)抗生素）的2L燒瓶中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)（0D6C4,為提高產(chǎn) 量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)， 于4°C，6000g離心lOmin，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積彡20mL的高速離心 管中（細(xì)菌沉淀可以在-20°C或-70°C無限期保存），加入lmL新配的含25mg/mL溶菌酶的 GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至 液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置l〇min，加入7. 5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至 粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置l〇min，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒 入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0. 6倍體積的 異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?lOmin，于室溫，1500g離心lOmin，加入2II1L701%乙醇輕輕 洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥（沉淀可在4°C長期保存）。③重組子 的鑒定：上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的DNA(含SV40T/pcDNA3. 1)，同上法用限制性內(nèi)切 酶BamH I進(jìn)行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶， 前者符合GenBank中SV40T片段的大小。（2)pLXSNne〇-hTERT重組子的純化、擴(kuò)增、鑒定 ： ①大腸桿菌感受態(tài)的制備：其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽離子等處理細(xì)菌， 使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl 2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制 備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下：從37°C培養(yǎng)16?20h 的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH52)，或lml新鮮的16?20h過夜培養(yǎng)物， 轉(zhuǎn)到一個(gè)含有l(wèi)OOmlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h(旋 轉(zhuǎn)搖床200?300r/min)，每隔20?30min測量0D600值~ 0. 4,在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移 到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2 轉(zhuǎn)頭（或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭）以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將 管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以10ml用冰預(yù)冷的0. lmMCaCl2重懸每份沉 淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭（或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭）以4000r/min離心10min， 以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培 養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0. 1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中 冰凍，-70°C貯存?zhèn)溆?。②以感受態(tài)大腸桿菌純化和擴(kuò)增pLXSNneo-hTERT重組子：用冷卻的 無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中分別取200 μ 1轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，在每管中 加 DNA或連接反應(yīng)混合物（體積< 10μ 1，DNA< 50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放 置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖 動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1?2min，每離心管加800 μ 1S0C培養(yǎng)基，用 水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá) 質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積（每90mm平板可達(dá)200μ1)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài) 細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgS04和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸 收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。③篩選、擴(kuò)增重組子：用無菌牙簽或滅 菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基（如超級(jí)肉湯或TB超級(jí) 肉湯培養(yǎng)基）中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基（含有適當(dāng)抗生素）的2L燒瓶 中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)（0D 6C4,為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒 瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)，于4°C，6000g離心10min，用4mL GTL溶 液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積彡20mL的高速離心管中（細(xì)菌沉淀可以在-20°C或_70°C 無限期保存），加入lmL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin， 加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置 lOmin，加入7. 5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放 置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可 見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0. 6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?lOmin， 于室溫，1500g離心lOmin，加入2mL70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇， 并真空干燥（沉淀可在4°C長期保存）。④重組質(zhì)粒的鑒定與擴(kuò)增：挑取平皿上的單菌落， 接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素 LB培養(yǎng)基中，37°C，250r/min搖床中培養(yǎng)，14h后收集 培養(yǎng)物，4°C、10000r/min離心5min，按試劑盒說明書小量提取并純化重組質(zhì)粒；以EcoRI 和Hindlll雙酶切重組質(zhì)粒反應(yīng)體系：限制性內(nèi)切酶各0. 5ul、10Xbuffer2ul、重組質(zhì)粒 1〇111、加水補(bǔ)足至2〇111，371：酶切111。酶切產(chǎn)物于80￥電壓條件下進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳， 時(shí)間30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照；按常規(guī)測定重組質(zhì)粒的序列；重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測序鑒定 準(zhǔn)確后，將含有該質(zhì)粒的細(xì)菌接種至LB培養(yǎng)液中，擴(kuò)增培養(yǎng)，按大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說 明書進(jìn)行大劑量質(zhì)粒抽提純化，紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度及純度后備用。
[0022] 5、重組子SV40LT/pcDNA3. 1和pLXSNneo-hTERT導(dǎo)入染色體異常組織細(xì)胞及其陽 性克隆的篩選與擴(kuò)增：①染色體異常組織細(xì)胞的收集與培養(yǎng)：以無菌操作提取在作其他實(shí) 驗(yàn)或其他檢查后多余、廢棄的染色體異常組織細(xì)胞，以細(xì)胞終濃度約為IX 105/mL備用，取 上述呈單個(gè)分散的細(xì)胞或經(jīng)處理后成為單個(gè)分散的細(xì)胞接種于含5?10nm〇l/L胰島素、 20%胎牛血清的RPMI 1640液中或接種于含20%胎牛血清、5?10nm〇l/L胰島素的低糖 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37°C，體積分?jǐn)?shù)5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細(xì)胞 形態(tài)為梭形、小園形細(xì)胞不到10%、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)75%?85%、處于剛進(jìn)入對數(shù)生 長期時(shí)，即考慮收集培養(yǎng)細(xì)胞，先吸干凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入l_2ml0. 01 %的膠原酶II 液（以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)），靜置2-10min (顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測），吸去膠原酶II 液，加入低糖DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)液，用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成 細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入離心管離心沉淀，去上清液，細(xì)胞沉淀用上述培養(yǎng)液清洗2次后，制成懸液， 用作重組子導(dǎo)入。②SV40T/pcDNA3. 1的導(dǎo)入：在上法分離所得細(xì)胞中，選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法， 將上述2 X 105個(gè)細(xì)胞接種于35mm培養(yǎng)皿中，在37°C C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24?36h，使細(xì)胞生成 單層、細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)55%? 65%、處于將進(jìn)入或剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)，即轉(zhuǎn)染重組子SV40T/pcDNA3. 1，在1. 5ml微量離 心管中制備下列溶液：管4，將5￥4017?(^嫩3.1溶于10(^1無血清培養(yǎng)液中；管8，將2(^1 Lipofectamine溶于80 μ 1無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min，吸去細(xì) 胞培養(yǎng)液后，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，在Lip〇f ectamine-SV40T/pCDNA3. 1混合物中 加入lml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入lml無血清培養(yǎng)液，在 C〇2培養(yǎng)箱培養(yǎng)l〇h，吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為 4001^17 1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8?10天后選擇單個(gè)細(xì)胞集落進(jìn)行亞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后 再加大G418濃度到800mg · Γ1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的克隆進(jìn)行傳代擴(kuò) 增。
[0023] 6、染色體數(shù)目異常組織細(xì)胞的傳代、擴(kuò)增：收集上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入 SV40LT/pcDNA3. 1和pLXSNneo-hTERT的陽性單克隆細(xì)胞集落，以低糖DMEM或RPMI 1640 培養(yǎng)基配成約1 x 105/mL的細(xì)胞懸液，接種于數(shù)瓶20?50cm2培養(yǎng)瓶中，加入5mL含20mL/ L胎牛血清、10nm〇l/L胰島素的低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，至細(xì)胞貼壁生長、匯合率達(dá) 80?85%、處于對數(shù)生長期的前期時(shí)收集細(xì)胞，再按上述步驟傳代培養(yǎng)，如此反復(fù)傳代接 種、培養(yǎng)，記錄代數(shù)并觀察細(xì)胞生長特點(diǎn)，以此建立可在體外反復(fù)傳代擴(kuò)增的染色體數(shù)目異 常質(zhì)控細(xì)胞。如圖1所示，細(xì)胞傳代至第150代、培養(yǎng)至第3天時(shí)，呈圓形、梭形、貼壁生長， 其細(xì)胞生長匯合率已達(dá)45%。細(xì)胞傳代至第151代后，生長變慢，貼壁生長稀疏。
[0024] 7、原液質(zhì)控細(xì)胞的制備：⑴原液活質(zhì)控細(xì)胞的制備：取生長狀態(tài)良好、處于對 數(shù)生長期的不同世代的貼壁細(xì)胞，經(jīng)過消化、終止和離心分離（1200r/min，6min)，用含二 甲亞砜的凍存液0.5?lml重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為5X10 5個(gè)/ml，加入凍存管，經(jīng)4°C， 0. 5h ;-20°C，2h ;-70°C，過夜，入_196°C液氮凍存。（2)原液固定質(zhì)控細(xì)胞的制備：（1)終止 培養(yǎng)、收獲細(xì)胞前2?3h，加入濃度為20 μ g/ml的秋水仙素，每5ml培養(yǎng)基中用7號(hào)針頭， 加3?4滴使最終濃度為0. 1 μ g/ml。輕輕搖勻后，再放入恒溫箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)2?3h，以 積累較多停止在中期的分裂象。（2)收獲細(xì)胞：由恒溫箱取出培養(yǎng)瓶，以0.25%胰蛋白酶消 化貼壁細(xì)胞5分鐘，每次收獲1瓶，用吸管充分吹打培養(yǎng)瓶瓶壁，使細(xì)胞全部脫離瓶壁，然后 將細(xì)胞液移至錐形離心管內(nèi)，1500轉(zhuǎn)/min，離心lOmin，去上清液。（3)低滲處理：加入37°C 預(yù)溫的〇.〇75mol/L KC18ml，反復(fù)吹打（約一百次）后，置37°C水浴箱中低滲處理25min左 右。（4)預(yù)固定：加入新鮮制備固定液lml (甲醇：冰醋酸=3 : 1)，輕輕混勻。（5)離心： 2000轉(zhuǎn)/min,離心lOmin，吸棄上清液。（6)固定：沿離心管壁慢慢加入固定液8ml，輕輕混 勻，固定l〇min。（7)離心：同上，吸去上清液。（8)再固定：加固定液8ml，混勻，固定lOmin。 (9)離心：同上，吸去上清液。（10)制備原液質(zhì)控細(xì)胞懸液：根據(jù)細(xì)胞量多少，加入適量固定 液，充分混勻，制成濃度為l〇5/ml的細(xì)胞懸液，保存?zhèn)溆谩?br> [0025] 8、應(yīng)用質(zhì)控細(xì)胞的制備：（1)應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞的制備：提取5例在不同時(shí)間制備 的、凍存于_196°C液氮中的染色體數(shù)目異常的原液活質(zhì)控細(xì)胞，以5例之比均為1 : 1的等 濃度、等體積或細(xì)胞數(shù)進(jìn)行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應(yīng)用活質(zhì)控 細(xì)胞，理論上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數(shù)目異常的核型各占20%;另外根 據(jù)需要，取1例原液活質(zhì)控細(xì)胞與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0.5、1 : 1、1 : 2、 1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的體積比例或細(xì)胞數(shù) 比例進(jìn)行混合，制成不等比應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞，含有不同類型和比例的染色體數(shù)目異常，如某 1例取lml與另1例取50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例為2%，后者為98% ;如某1 例取lml與另外1例染色體正常的同濃度細(xì)胞懸液50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例 為2%。此外，應(yīng)活質(zhì)控細(xì)胞系還可進(jìn)行傳代擴(kuò)增后使用。（2)應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞的制備： 提取5例在不同時(shí)間制備的染色體數(shù)目異常的原液固定質(zhì)控細(xì)胞，以5例之比均為1 : 1 的等濃度、等體積或細(xì)胞數(shù)進(jìn)行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應(yīng)用固 定質(zhì)控細(xì)胞，理論上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數(shù)目異常的核型各占20%; 另外根據(jù)需要，取1例原液固定質(zhì)控細(xì)胞與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0.5、1 : 1、 1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的體積比例 或細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行混合，制成不等比應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞，含有不同類型和比例的染色體數(shù) 目異常，如某1例取lml與另1例取50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例為2%,后者為 98% ;如某1例取lml與另外1例染色體正常的同濃度細(xì)胞懸液50ml混合，則理論上前者 的嵌合體比例為2%。經(jīng)如此反復(fù)傳代擴(kuò)增和混合不同病例的染色體數(shù)目異常細(xì)胞所制備 的質(zhì)控細(xì)胞（系），不但數(shù)量足夠的多，達(dá)到用之不盡，而且使原先一般每份原液活質(zhì)控細(xì) 胞或原液固定質(zhì)控細(xì)胞中只有一種染色體數(shù)目異常轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性谕环輵?yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞 或應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞中同時(shí)含有多種不同比例的、不同類型的易誤診染色體數(shù)目異常的特 征，從而增加了鑒別診斷、染色體嵌合體診斷的難度和復(fù)雜性，標(biāo)本易得且將廢棄的多余細(xì) 胞轉(zhuǎn)化為可用于染色體核型分析的技術(shù)考核、室內(nèi)質(zhì)控及室間質(zhì)評(píng)，在室內(nèi)質(zhì)量控制、室間 質(zhì)量評(píng)價(jià)、提高診斷水平的應(yīng)用中具有顯著的效果。
[0026] 9、染色體數(shù)目異常質(zhì)控細(xì)胞庫的建立：將上述在不同時(shí)間制備的固定質(zhì)控細(xì)胞 (原液固定質(zhì)控細(xì)胞和應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞）以（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）固定液配成濃 度為l〇5/ml的細(xì)胞懸液，經(jīng)分裝、加滿固定液至管口和封口后，按年、月、日的制備日期及 標(biāo)本來源地址的大寫英文字母編號(hào)，集中保存于_20°C，備作染色體數(shù)目診斷的質(zhì)量控制之 用。同時(shí)將相應(yīng)的5種染色體數(shù)目異常核型的標(biāo)準(zhǔn)描述、按照年、月、日的制備日期以及標(biāo) 本來源地址的大寫英文字母編號(hào)錄入計(jì)算機(jī)，使用時(shí)從計(jì)算機(jī)中抽取待用質(zhì)控細(xì)胞編號(hào)， 然后從質(zhì)控細(xì)胞庫中找出相應(yīng)的質(zhì)控細(xì)胞作質(zhì)量評(píng)價(jià)；活質(zhì)控細(xì)胞（原液活質(zhì)控細(xì)胞和應(yīng) 用活質(zhì)控細(xì)胞）以凍存液（5%二甲亞砜、95%胎牛血清）配成濃度為10 5/ml的細(xì)胞懸液， 經(jīng)每管lml分裝后，按年、月、日的制備日期及標(biāo)本來源地址的大寫英文字母編號(hào)，集中保 存于-196°C液氮中，備作染色體數(shù)目診斷的質(zhì)量控制之用。同時(shí)將相應(yīng)的各種染色體數(shù)目 異常核型的標(biāo)準(zhǔn)描述、按照年、月、日的制備日期以及標(biāo)本來源地址的大寫英文字母編號(hào)錄 入計(jì)算機(jī)，使用時(shí)從計(jì)算機(jī)中抽取待用質(zhì)控細(xì)胞編號(hào)，然后從質(zhì)控細(xì)胞庫中找出相應(yīng)的質(zhì) 控細(xì)胞作質(zhì)量評(píng)價(jià)
[0027] 10、室內(nèi)質(zhì)控中的應(yīng)用：從計(jì)算機(jī)中抽取質(zhì)控細(xì)胞編號(hào)，然后從質(zhì)控細(xì)胞庫中找出 相應(yīng)的質(zhì)控細(xì)胞，發(fā)送到各實(shí)驗(yàn)室或相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員，在收到質(zhì)控細(xì)胞后，作為室內(nèi)質(zhì)控 物，與臨床待作染色體數(shù)目異常診斷的標(biāo)本在相同條件下作同步染色體數(shù)目診斷。如果質(zhì) 控細(xì)胞的染色體數(shù)目診斷結(jié)果沒有達(dá)到要求，則說明診斷方法的試劑、儀器、操作方法等方 面有問題，應(yīng)查明原因、重新檢測后報(bào)告結(jié)果。
[0028] 11、室間質(zhì)評(píng)中的具體應(yīng)用：
[0029] ①準(zhǔn)備質(zhì)控細(xì)胞：取1例或數(shù)例質(zhì)控細(xì)胞，按需要的例次或比例混合，混合的質(zhì)控 細(xì)胞株還可經(jīng)擴(kuò)增后發(fā)放使用?，F(xiàn)以5例染色體數(shù)目異常質(zhì)控細(xì)胞等比例細(xì)胞數(shù)混合為 例，每種染色體數(shù)目異常的細(xì)胞各占20%。然后將質(zhì)控細(xì)胞發(fā)送到各受試對象做室間質(zhì)量 評(píng)價(jià)。
[0030] ②熒光原位雜交（FISH)檢測質(zhì)控細(xì)胞染色體數(shù)目及結(jié)果判定：各受試對象收到 質(zhì)控細(xì)胞后，如為活質(zhì)控細(xì)胞系，則可酌情對質(zhì)控細(xì)胞系進(jìn)行傳代擴(kuò)增后測試，以增加細(xì) 胞數(shù)；如為固定質(zhì)控細(xì)胞，則直接測試。試劑采用瑞士雅培制藥有限公司的AneuVysion 試劑盒，含有兩個(gè)不同的雜交區(qū)域，共完成5條染色體的數(shù)目分析：第18號(hào)（Spectrum Aqua,青色）、X(Spectrum Green,綠色）、Y(Spectrum Orange,紅色）號(hào)染色體為計(jì)數(shù)探 針（Chromosome Enumerating Probe，CEP)，混合后雜交第 1 個(gè)區(qū)域；第 13 號(hào)（Spectrum Green,淺綠色）和21 (Spectrum Orange,紫紅色）號(hào)染色體為區(qū)域特異性探針（Locus Specific Identifier，LSI)，混合后雜交第2個(gè)區(qū)域。方法是取13和21號(hào)染色體為位點(diǎn) 特異探針，18、X和Y染色體為著絲粒探針，將質(zhì)控細(xì)胞系（與實(shí)驗(yàn)室被檢標(biāo)本）同步，經(jīng) 2000r/min離心lOmin，去上清，留沉淀0. 2ml，離心管中加入4ml膠原酶37°C溫浴30min， 2000r/min離心lOmin，去上清，然后加入5ml預(yù)溫的15mol/L KC1，在37水浴中低滲25min， 2000r/min離心lOmin，去上清。加入新配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3 : 1)固定lOmin， 離心2000r/min離心lOmin去上清，反復(fù)兩次。滴片，自然干燥老化。將制備好的標(biāo)本片自 冰柜中取出，依次放人70 %、85 %、100 %乙醇中脫水，室溫干燥，預(yù)處理好的玻片置73 °C， 70%甲酰胺中5min。在暗室中將兩種探針混合液各10 μ 1加在玻片的靶區(qū)域，蓋上蓋玻片， 避免產(chǎn)生氣泡，封片膠將蓋玻片封好，置暗濕盒中42°C雜交過夜，清洗，在高倍鏡下觀察雜 交效果，每例標(biāo)本計(jì)數(shù)60?100個(gè)細(xì)胞，記錄雜交信號(hào)數(shù)目并采集圖像，要求細(xì)胞核膜必須 完整，核內(nèi)雜交信號(hào)明亮清晰無重疊，信號(hào)彌散及微弱均不作統(tǒng)計(jì)。
[0031] ③測試結(jié)果：經(jīng)探針雜交后，細(xì)胞內(nèi)的18號(hào)染色體顯示青色的點(diǎn)，每條18號(hào)顯示 1個(gè)青色的點(diǎn)，2條則顯示2個(gè)青色的點(diǎn)，3條則顯示3個(gè)青色的點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)X(女性）染色 體顯示綠色的點(diǎn)，每條X染色體顯示1個(gè)綠色的點(diǎn)，2條則顯示2個(gè)綠色的點(diǎn)，3條則顯示3 個(gè)綠色的點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)Y(男性）染色體顯示紅色的點(diǎn)，每條Y染色體顯示1個(gè)紅色的點(diǎn)，2條 則顯示2個(gè)紅色的點(diǎn)，3條則顯示3個(gè)紅色的點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)的13號(hào)染色體顯示淺綠色的點(diǎn)，每 條13號(hào)顯示1個(gè)淺綠色的點(diǎn)，2條則顯示2個(gè)淺綠色的點(diǎn)，3條則顯示3個(gè)淺綠色的點(diǎn)；細(xì) 胞內(nèi)的21號(hào)染色體顯示紫紅色的點(diǎn)，每條21號(hào)顯示1個(gè)紫紅色的點(diǎn)，2條則顯示2個(gè)紫紅 色的點(diǎn)，3條則顯示3個(gè)紫紅色的點(diǎn)。
[0032] 圖2為5種染色體數(shù)目異常質(zhì)控細(xì)胞等濃度等量混合、制片、熒光原位雜交所得結(jié) 果模擬圖，如圖2所示，細(xì)胞1為18-三體細(xì)胞，1. 1、1. 2、1. 3各代表1條18號(hào)染色體，細(xì)胞 內(nèi)多了 1條18號(hào)染色體，有3個(gè)青色的點(diǎn)，正常細(xì)胞為2條18號(hào)染色體、2個(gè)青色的點(diǎn)；細(xì) 胞2為少1條性染色體的細(xì)胞，2. 1代表1條X染色體，只有1個(gè)綠色的點(diǎn)，正常細(xì)胞應(yīng)還有 1條X染色體（1個(gè)綠色的點(diǎn)）或1條Y染色體（1個(gè)紅色的點(diǎn)）；細(xì)胞3為多1條Y染色體 的細(xì)胞，3. 1、3. 2各代表1條Y染色體，正常細(xì)胞只有1條Y染色體、1個(gè)紅色的點(diǎn)；細(xì)胞4 為13-三體細(xì)胞，4. 1、4.2、4. 3各代表1條13號(hào)染色體，細(xì)胞內(nèi)多了 1條13號(hào)染色體，有3 個(gè)淺綠色的點(diǎn)，正常細(xì)胞為2條13號(hào)染色體、2個(gè)淺綠色的點(diǎn)；細(xì)胞5為21-三體細(xì)胞，5. 1、 5. 2、5. 3各代表1條21號(hào)染色體，細(xì)胞內(nèi)多了 1條21號(hào)染色體，有3個(gè)紫紅色的點(diǎn)，正常細(xì) 胞為2條21號(hào)染色體、2個(gè)紫紅色的點(diǎn)。
[0033] ④結(jié)果評(píng)價(jià)：各受試實(shí)驗(yàn)室將結(jié)果包括染色體數(shù)目異常的種類、比例回報(bào)室間質(zhì) 評(píng)組織者，由組織者對各室結(jié)果作統(tǒng)一評(píng)比成績，找出誤診原因、討論改正措施，以動(dòng)態(tài)發(fā) 現(xiàn)質(zhì)量問題、加強(qiáng)質(zhì)量管理、提高診斷質(zhì)量。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室的hTERT和SV40轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法， 其主要特征是以T4DNA連接重組子SV40LTag-pcDNA3. 1(_)和pLXSNneo-hTERT，以脂質(zhì)體導(dǎo) 入常見染色體數(shù)目異常組織細(xì)胞，G418篩選整合有重組子的細(xì)胞作傳代擴(kuò)增后凍存，臨用 時(shí)按質(zhì)控所需比例混合，使原先每例細(xì)胞只有1種染色體數(shù)目異常轉(zhuǎn)變?yōu)楹幸欢ū壤?多種組合染色體數(shù)目異常嵌合體質(zhì)控細(xì)胞，增加了鑒別診斷、嵌合體診斷的難度，原始細(xì)胞 易得且將廢棄的多余細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有永久生存、無限擴(kuò)增、可按需復(fù)制足夠細(xì)胞以滿足質(zhì) 控要求的質(zhì)控細(xì)胞，以此人為制備的疑難質(zhì)控細(xì)胞作常見染色體數(shù)目異常檢測室間質(zhì)評(píng)和 室內(nèi)質(zhì)控，對及時(shí)發(fā)現(xiàn)和解決質(zhì)量問題、提高診斷水平具有重要的意義。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室的hTERT和SV40轉(zhuǎn)導(dǎo) 質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，其特征是常見染色體數(shù)目異常包含21-三體、18-三體、13三體、X 和Y染色體數(shù)目異常5類。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室的hTERT和SV40轉(zhuǎn)導(dǎo) 質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，其特征是hTERT和SV40同時(shí)與染色體數(shù)目異常組織細(xì)胞整合制成 了能傳代至第150代、培養(yǎng)至第3天、呈圓形、梭形、貼壁生長，細(xì)胞生長匯合率達(dá)45%的嵌 合體質(zhì)控細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室的hTERT和SV40轉(zhuǎn)導(dǎo) 質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，其特征是按質(zhì)控所需比例混合包含： 以5例染色體數(shù)目異常原液活質(zhì)控細(xì)胞之比均為1 : 1的等濃度、等體積或細(xì)胞數(shù)進(jìn) 行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞株，理論上21-三體、 18-三體、13-三體、X和Y染色體數(shù)目異常的核型各占20% ; 以1例原液活質(zhì)控細(xì)胞與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0. 5、1 : 1、1 : 2、1 : 3、 1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20?50的體積比例或細(xì)胞數(shù)比例進(jìn) 行混合，制成不等比應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞，含有不同類型和比例的染色體數(shù)目異常； 以5例染色體數(shù)目異常的原液固定質(zhì)控細(xì)胞，以5例之比均為1 : 1的等濃度、等體積 或細(xì)胞數(shù)進(jìn)行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞，理論 上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數(shù)目異常的核型各占20% ; 以1例原液固定質(zhì)控細(xì)胞與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0. 5、1 : 1、1 : 2、 1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的體積比例或細(xì)胞數(shù) 比例進(jìn)行混合，制成不等比應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞，含有不同類型和比例的染色體數(shù)目異常，如 某1例取lml與另1例取50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例為2%，后者為98%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的一種用于醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室的hTERT和SV40轉(zhuǎn) 導(dǎo)質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，其特征是每1份質(zhì)控細(xì)胞包含有1?5種不同的染色體數(shù)目異 常，可同時(shí)用于相對應(yīng)的1?5種染色體數(shù)目異常檢測的質(zhì)量控制，無需備用多份質(zhì)控物， 使用方便、經(jīng)濟(jì)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的一種用于醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室的hTERT和SV40轉(zhuǎn) 導(dǎo)質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，其特征是每1份質(zhì)控細(xì)胞由1?5種不同比例的染色體數(shù)目異 常細(xì)胞組合而成，能設(shè)定染色體數(shù)目異常檢出率（百分比）的界限和質(zhì)量指標(biāo)；5種染色體 數(shù)目異常質(zhì)控細(xì)胞之間以及與正常細(xì)胞之間可配制2%?100%的某1種或數(shù)種染色體數(shù) 目異常的嵌合體質(zhì)控細(xì)胞，能反映、控制低比例染色體數(shù)目異常的檢測質(zhì)量，或達(dá)到與低比 例染色體數(shù)目異常的實(shí)際病例的同步檢測，具有更有效的質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)效果。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室的hTERT和SV40轉(zhuǎn)導(dǎo) 質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，其特征是染色體數(shù)目異常永生化質(zhì)控細(xì)胞庫包含：以固定液（甲 醇：冰醋酸=3 : 1的）為媒介的、-20°C保存的、按年、月、日的制備日期及標(biāo)本來源地址 的大寫英文字母編號(hào)的、細(xì)胞濃度為l〇5/ml的、由原液固定質(zhì)控細(xì)胞和應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞 構(gòu)成的固定質(zhì)控細(xì)胞；以凍存液（5%二甲亞砜、95%胎牛血清）為媒介的、-196°C液氮保存 的、按年、月、日的制備日期及標(biāo)本來源地址的大寫英文字母編號(hào)的、細(xì)胞濃度為l〇 5/ml的、 由原液活質(zhì)控細(xì)胞系和應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞系構(gòu)成的活質(zhì)控細(xì)胞系。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室的hTERT和SV40轉(zhuǎn)導(dǎo) 質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，其特征在于，涉及以染色體結(jié)構(gòu)異常、除5種常見染色體數(shù)目異常 以外的第1號(hào)至第22號(hào)染色體數(shù)目異常的細(xì)胞為原始細(xì)胞所制備的質(zhì)控細(xì)胞株。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104059885SQ201310111745
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月19日
【發(fā)明者】翁炳煥 申請人:翁炳煥