專利名稱：一種山豆根生物脫毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及降低植物中草藥毒性的方法，具體涉及一種利用微生物對天然有毒山豆根整體或總堿提取物進行生物脫毒，以獲得減毒持效的山豆根總堿提取物。
背景技術(shù)：
山豆 根系豆科槐屬植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根及根莖，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，為治療咽喉腫痛之要藥。臨床常用于治療咽喉及牙齦腫痛、溫?zé)狳S疸、心律失常、肝炎肝癌等疾病(黃兆勝，中藥學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，2002:113)?，F(xiàn)代植物化學(xué)研究顯示山豆根中含有生物堿、黃酮、三萜類、多糖、酚類、有機酸等多種活性成分，其中生物堿類既是山豆根的功能成分也是毒性成分。山豆根的毒性主要表現(xiàn)為胃腸道反應(yīng)、神經(jīng)毒性反應(yīng)、過敏反應(yīng)等，中毒后出現(xiàn)惡心、嘔吐、肌肉痙攣、全身抽搐、呼吸衰竭直至死亡。如何發(fā)揮山豆根在臨床上的療效，同時降低毒性所帶來的不良反應(yīng)，成為眾多藥學(xué)專家和學(xué)者關(guān)注的焦點。已有報道的解毒方法不是很多，主要有通過中藥配伍解毒，山豆根與生甘草合用可以減輕毒性，但不能消除對腸胃的不良反應(yīng)，制約著山豆根的臨床應(yīng)用。微生物轉(zhuǎn)化是通過微生物細(xì)胞對外源性物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)修飾，即利用微生物在代謝過程中產(chǎn)生的單一或一系列酶系對外源性物質(zhì)進行的催化反應(yīng)。以微生物為代謝模型，考察藥物在生物體內(nèi)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，已在藥物代謝研究中得到了廣泛的應(yīng)用，其優(yōu)點是:微生物與人體代謝相似性較高；微生物來源廣泛、種類繁多；催化過程易于調(diào)控；可節(jié)省大量實驗動物、降低藥物研究成本。微生物轉(zhuǎn)化實質(zhì)上為有機合成的一種，具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、處理簡便、成本低廉等優(yōu)點，已成為新藥創(chuàng)制的一個重要途徑。目前，山豆根總堿的微生物脫毒研究尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有減毒技術(shù)的不足，旨在提供一種利用微生物對山豆根進行脫毒的方法，所要解決的技術(shù)問題是遴選微生物并確立脫毒的工藝條件。山豆根脫毒(亦稱減毒)其實質(zhì)是對其活性成分(即山豆根總堿提取物簡稱總堿提取物)進行脫毒，因此本脫毒方法有兩種，一是以山豆根藥材為原料進行脫毒處理，然后提取出總堿提取物；二是首先提取出山豆根藥材中的總堿提取物，然后以該提取物為原料進行脫毒處理。兩種方法的最終目標(biāo)是得到減毒的活性產(chǎn)物(簡稱減毒產(chǎn)物)。本發(fā)明遴選的微生物為灰色鏈霉菌Streptomyces griseus ATCC13273,保藏于美國模式菌種保藏中心(簡稱ATCC)。以山豆根藥材為原料的脫毒方法，包括以下步驟:1、將山豆根藥材粉碎后過至少40目篩，與麩皮、豆粉按質(zhì)量比10-20:2-5:1_3混
合均勻。2、在混合粉料(下簡稱粉料)中加入粉料重量70-90%的蒸餾水，攪拌均勻后裝瓶密封，121°C、0.14MPa下滅菌20min，冷卻后在無菌條件下接入培養(yǎng)成熟的ATCC13273菌液于25-35°C發(fā)酵培養(yǎng)5-8天，菌液接種量為粉料質(zhì)量的1_3%。3、培養(yǎng)結(jié)束后加入20倍量的5% (質(zhì)量百分濃度，下同)鹽酸滲濾，滲濾液裝入732型陽離子交換樹脂柱，依次用水和30%乙醇(質(zhì)量百分濃度，下同)洗脫去雜，經(jīng)60%乙醇洗脫，洗脫液濃縮蒸干得減毒產(chǎn)物。以山豆根總堿提取物為原料的脫毒方法，包括山豆根總堿的提取和總堿提取物的脫毒，所述的山豆根總堿的提取是山豆根藥材粉末經(jīng)17倍量0.5%鹽酸水溶液滲漉，滲漉液過濾并載入732型陽離子交換樹脂柱，依次用水及30%乙醇溶液洗脫除雜，然后以6%(質(zhì)量百分濃度，下同)氨醇溶液洗脫總生物堿成分，洗脫液減壓蒸餾回收氨醇液得山豆根總堿提取物。所述的總堿提取物的脫毒是以山豆根總堿提取物為底物，以少量乙醇溶解后添加到培養(yǎng)成熟的ATCC13273菌液中，每升菌液中添加量為3_5g，于25_35°C發(fā)酵培養(yǎng)5_8天。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)乙醇回流提取、過濾分離和減壓濃縮蒸干得減毒產(chǎn)物。本發(fā)明利用微生物對山豆根粉末或總堿提取物進行生物轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)減毒增效或持效的效果，有利于山豆根植物資源的開發(fā)和利用。
具體實施例方式在無菌條件下將保藏在4°C的ATCC13273菌種(由中國藥科大學(xué)余伯陽教授惠贈)由斜面轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基(配方為:200g去皮馬鈴薯浸取液1L，葡萄糖20g，KH2P043g,無水MgSO40.73g，維生素B1IOmg),培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)2天成為種子液，每mL種子液中菌體不少于1.0X IO8個。種子液再轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA培養(yǎng)基中，每升培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接種子液10ml，培養(yǎng)2天至菌體不再明顯增加時即得培養(yǎng)成熟的菌液。實施例1:稱取山豆根粉碎后過60目篩藥粉2kg,與小麥麩皮0.5kg、黃豆粉0.3kg均勻混合，加入2.4kg蒸餾水，置容器內(nèi)采用高壓滅菌，條件為121°C，0.14MPa，滅菌20min，冷卻至30°C左右時，接種占混合干物料1%的ATCC13273菌液，添加1.8L無菌水，在無菌條件下均勻混合。固體發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30°C，時間為5天；培養(yǎng)結(jié)束后20倍量的5%稀鹽酸液滲濾，滲濾液裝入732型陽離子交換樹脂柱，依次用水和30%乙醇洗脫去雜，經(jīng)60%乙醇洗脫至無生物堿反應(yīng)，洗脫液濃縮蒸干得減毒產(chǎn)物0.17kg。實施例2:稱取山豆根粉碎后過60目篩藥粉2kg，經(jīng)17倍量0.5%鹽酸水溶液滲漉，滲漉液過濾并載入732型陽離子交換樹脂，依次用水及30%乙醇溶液洗脫除雜，然后以6%氨醇溶液洗脫總生物堿成分，最后減壓回收氨醇液得山豆根總堿提取物?？倝A提取物以乙醇溶解，添加到培養(yǎng)成熟的ATCC13273菌液中混勻。每升菌液加總堿提取物4g。液體發(fā)酵溫度為28°C，時間為7天；發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)乙醇回流充分溶解后，濾除菌體，濾液減壓濃縮得山豆根發(fā)酵減毒產(chǎn)物0.18kg。為便于理解本發(fā)明的理解，下面提供山豆根總堿和總堿減毒產(chǎn)物的急性毒性和抗炎活性研究資料。實驗例1急性毒性研究取實驗所需健康昆明小鼠140只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，按體質(zhì)量、性別分層隨機法分為山豆根總堿組、空白菌體組、實施例1組、實施例2組,受試起始劑量為0.4g/kg,等比級數(shù)為1:0.76，總堿組、實施例1和例2組設(shè)置四個給藥劑量，每個劑量10只，另設(shè)陰性對照組給予等容積生理鹽水。禁食(不禁水)12h后，各組均按10mL/kg —次性尾靜脈注射，給藥后記錄動物的即時反應(yīng)并連續(xù)觀察7d，記錄動物毒性出現(xiàn)時間及恢復(fù)時間、死亡情況。表I半數(shù)致死量及置信區(qū)間(單位:g/kg)
權(quán)利要求
1.一種山豆根生物脫毒方法，以山豆根藥材為原料，其特征在于包括以下步驟: (1)將山豆根藥材粉碎后過至少40目篩，與麩皮、豆粉按質(zhì)量比10-20:2-5:1-3混合均勻； (2)向粉料中加入粉料重量70-90%的蒸餾水，攪拌均勻后裝瓶密封，121°C、0.14MPa下滅菌20min，冷卻后在無菌條件下接入培養(yǎng)成熟的ATCC13273菌液于25_35°C發(fā)酵培養(yǎng)5_8天，菌液接種量為粉料質(zhì)量的1-3% ； (3)培養(yǎng)結(jié)束后加入20倍量的5%鹽酸滲濾，滲濾液裝入732型陽離子交換樹脂柱，依次用水和30%乙醇洗脫去雜，經(jīng)60%乙醇洗脫，洗脫液濃縮蒸干得減毒產(chǎn)物。
2.—種山豆根生物脫毒方法，包括山豆根總堿的提取和總堿提取物的脫毒，其特征在于: 所述的總堿提取物的脫毒是以山豆根總堿提取物為底物，以少量乙醇溶解后添加到培養(yǎng)成熟的ATCC13273菌液中，每升菌液中添加量為3_5g，于25_35°C發(fā)酵培養(yǎng)5_8天，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)乙醇回流提取、過濾分離和減 壓濃縮蒸干得減毒產(chǎn)物。
全文摘要
一種山豆根生物脫毒方法，以山豆根藥材為原料，其特征是將山豆根藥材粉末與麩皮、豆粉均勻混合，加入適當(dāng)水分，經(jīng)滅菌、冷卻后接入培養(yǎng)成熟的ATCC13273菌液，于25-35℃發(fā)酵培養(yǎng)5-8天，發(fā)酵液經(jīng)稀酸滲濾，注入大孔樹脂柱，經(jīng)水和30%乙醇洗脫去雜后，以60%乙醇洗脫，洗脫液濃縮蒸干得減毒產(chǎn)物?；蛘咦陨蕉垢幉姆勰┲邢忍崛】倝A提取物，然后以總堿提取物為底物，以少量乙醇溶解后添加到培養(yǎng)成熟的ATCC13273菌液中，每升菌液中添加量為3-5g，于25-35℃發(fā)酵培養(yǎng)5-8天，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)乙醇回流提取、過濾分離和減壓濃縮蒸干得減毒產(chǎn)物。
文檔編號C12P1/06GK103160542SQ20131009333
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日
發(fā)明者錢利武, 張毅, 馬玲, 周國勤 申請人:安徽省藥物研究所